Multicolor detecção de fluorescência para Gota microfluídica Utilizando Fibras Ópticas

1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco
Published 5/05/2016
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Bioengineering

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Summary

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Cole, R. H., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers. J. Vis. Exp. (111), e54010, doi:10.3791/54010 (2016).

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Abstract

Introduction

Microfluídica gotículas fornecer uma plataforma em alta biologia rendimento por compartimentar experimentos em um grande número de gotículas aquosas suspensas em uma transportadora de petróleo 1. Gotas têm sido utilizados para aplicações tão variadas como a análise de células individuais 2, reacção em cadeia da polimerase digitais (PCR), 3, e 4 evolução da enzima. ensaios fluorescentes são o modo padrão de detecção para microfluídica gota, como os seus sinais luminosos e tempo de resposta rápido são compatíveis com a detecção de volumes de gotículas sub-nanolitros a taxas kilohertz. Muitas aplicações exigem a detecção de fluorescência de pelo menos duas cores em simultâneo. Por exemplo, o nosso laboratório vulgarmente PCR realiza-activada de gotículas triagem experiências que utilizam um canal de detecção para o resultado de um ensaio, e utiliza um corante de fundo secundário para fazer gota-ensaio negativo contáveis ​​5.

estações de detecção típicos para microfluídica gotículas são based em microscópios de epifluorescência, e exigem complicados esquemas de manipulações de luz para introduzir luz de excitação de lasers de espaço livre no microscópio a ser focada na amostra. Depois de fluorescência é emitida a partir de uma gotícula, a luz de fluorescência emitida é filtrada de modo a que cada canal de detecção utiliza um tubo fotomultiplicador (PMT) centrada sobre uma banda de comprimento de onda. sistemas de detecção óptica de epifluorescência baseado em microscópio fornecer uma barreira à entrada devido à sua custa, a complexidade ea manutenção necessária. As fibras ópticas dispõem de meios para construir um esquema de detecção simplificada e robusto, uma vez que as fibras podem ser inseridas manualmente em dispositivos de microfluidos, eliminando a necessidade de encaminhamento de luz à base de espelho, e permitindo caminhos de luz para ser interligado através de conectores de fibra óptica.

Neste trabalho, nós descrevemos a montagem e validação de um sistema compacto e modular para realizar detecção de fluorescência multicolor, utilizando uma rede de fibras ópticas de umda fotodetector única 6. As fibras ópticas são acoplados aos lasers individuais e são inseridos normal a um canal de escoamento em forma de L em deslocamentos espaciais regulares. Uma fibra de recolha de fluorescência é orientada paralelamente às regiões de excitação e é ligado a um único PMT. Uma vez que uma gotícula passa através dos feixes de laser em momentos diferentes, os dados registados pelo PMT mostra um deslocamento temporal, que permite ao utilizador fazer a distinção entre a fluorescência emitida após a gotícula é excitada por cada feixe de laser distinta. Este deslocamento temporal, elimina a necessidade de separar a luz emitida PMTs separadas utilizando uma série de espelhos dicróicos e filtros passa-banda. Para validar a eficácia do detector, que quantificar fluorescência em populações de gotículas de encapsulação de corantes de cor diferente e concentração. A sensibilidade do sistema é investigada para detecção de cor única fluoresceína, e mostra a capacidade de detectar gotículas com concentrações de até 0,1 nm, uma sensibilidade impr 200xovement quando comparado a uma fibra baseada recentes relatados na literatura 7.

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Protocol

1. SU8 Fabricação Mestre

  1. Projetar as estruturas microfluídicos para fabricação de três camadas usando software de design e têm os desenhos impressos por um fornecedor em filme placa de circuito com resolução de 10 m. Os detalhes da concepção do dispositivo são dadas em uma referência em anexo 6 e as geometrias de canal são mostradas na Figura 1. As camadas deverá incluir marcas de alinhamento para ajudar a colocar características de cada camada de fabricação 8.
  2. Coloque um wafer de silício diâmetro pré-limpeza de 3 polegadas em um revestidor de rotação e ligar o vácuo para apor-lo para o mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 no centro da bolacha e centrifugação durante 20 segundos a 500 rpm, em seguida 30 segundos a 1750 rpm, proporcionando uma espessura de camada de 80 um.
  3. Remover a bolacha e assar em uma placa de aquecimento de 135 ° C durante 30 min. Permitir que o wafer arrefecer à RT antes de passar para a próxima etapa.
  4. Expor o wafer revestido para o st máscara 1 camada sob a colimado 190 mW, LED 365 nm durante 3 minutos. Após a exposição, colocar a pastilha em uma placa de aquecimento de 135 ° C durante 1 min, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de prosseguir para o passo seguinte.
  5. Coloque o wafer sobre o coater rotação e ligar o vácuo para apor-lo para o mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 no centro da bolacha e centrifugação durante 20 segundos a 500 rpm, em seguida 30 segundos a 5000 rpm, o que resulta em uma camada que proporciona uma espessura adicional de 40 uM.
  6. Remover a bolacha e coza numa placa de aquecimento 135 ° C durante 30 min, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de passar para a próxima etapa.
  7. Alinhar a camada de máscara 2 nd para a geometria modelada em 1.3 e expor a pastilha revestida a uma colimado 190 mW, a 365 nm LED durante 3 min. Após a exposição, colocar sobre uma placa de aquecimento de 135 ° C durante 4 min 30 s, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de prosseguir para o passo seguinte.
  8. Coloque o wafer sobre o coater rotação e ligar o vácuo para apor-lo para o mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 no centro da bolacha e centrifugação durante 20 segundos a 500 rpm, em seguida, 30segundos a 1000 rpm, o que resulta em uma camada que proporciona uma espessura adicional de 100 um.
  9. Remover a bolacha e coza numa placa de aquecimento 135 ° C durante 30 min, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de passar para a próxima etapa.
  10. Alinhar a camada de máscara 3 rd na geometria modelada em 1.3 e expor a pastilha revestida a uma colimado 190 mW, a 365 nm LED durante 3 min. Após a exposição, colocar sobre uma placa de aquecimento de 135 ° C durante 9 minutos, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de prosseguir para o passo seguinte.
  11. Desenvolver as máscaras por imersão num banho em agitação de acetato de éter propilenoglicol monometílico, durante 30 min. Lava-se a bolacha em isopropanol e coza numa placa de aquecimento 135 ° C durante 1 min. Coloque o mestre desenvolvido em uma placa de Petri de 100 mm para polidimetilsiloxano moldagem (PDMS).

2. PDMS fabricação de dispositivos

  1. Preparar 10: 1 PDMS pela combinação de 50 g de base de silicone com 5 g de agente de cura em um copo de plástico. Misture o conteúdo com uma ferramenta rotativa equipada com uma vareta. degmedida que a mistura no interior de um exsicador durante 30 minutos, ou até que todas as bolhas de ar são removidas.
  2. Despeje o PDMS para dar uma espessura de 3 mm sobre o mestre e coloque de volta para o secador durante mais de desgaseificação. Uma vez que todas as bolhas são removidas, o dispositivo de cozer a 80 ° C durante 80 min.
  3. Cortar o dispositivo a partir do molde utilizando um bisturi e coloque sobre uma superfície limpa com o lado estampado para cima e perfurar as entradas e saídas fluídicos com um soco biópsia 0,75 mm. O dispositivo tem de ser cortado de modo a que os 120 uM e 220 uM geometrias altos são acessíveis a partir do lado do dispositivo.
  4. Plasma tratar o dispositivo, com o lado recurso acima, juntamente com um pré-limpas 2 polegadas por 3 polegadas lâmina de vidro a 1 mbar O 2 plasma durante 20 segundos em um aspirador de plasma 300 W. Unir o dispositivo de PDMS, colocando o lado modelado do dispositivo PDMS para o lado tratado com plasma da lâmina de vidro. Colocar o dispositivo num forno de 80 ° C e assar o dispositivo montado, durante 40 min.
  5. Tornar os canaishidrofóbica usando uma seringa para irrigar o dispositivo com um fluido de tratamento de superfície fluorado. Imediatamente cozer o dispositivo a 80 ° C durante 10 minutos para evaporar o solvente.

3. Preparação de componentes ópticos

  1. Prepara-se o laser de fibra de excitação através da remoção do isolamento a partir da última 5mm de um núcleo 105 uM, 125 uM de revestimento, NA = 0,22 fibra óptica.
  2. Prepare a fibra de excitação laser a cores 2 nd repetindo 3.1 para uma fibra idêntica 2º.
  3. Preparar a fibra de recolha do sinal de fluorescência pela repetição 3,1 para um núcleo de 200 um, 225 uM de revestimento, NA = 0,39 fibra óptica.
  4. Inspecione as pontas de todas as fibras - se as dicas não terminam em uma superfície plana, re-unir as extremidades com um escriba fibra.
  5. Anexar um acoplador de fibra de laser a um 50 mW, 405 nm do laser e anexar um dos 105 mm fibras do núcleo para o laser. Direcionar a extremidade descarnada para o sensor da potência do lasermetro, e usar os ajustes finos do acoplador laser para maximizar a potência do laser.
  6. Repetir para 3,5 nm de um laser de 50 mW, 473.
  7. Montar uma 446/510/581/703 filtros de banda quad nm na PMT utilizando tubos de lente para bloquear a luz do laser e transmitir fluorescência emitida. Ajustar o engate de fibra de modo que a luz viaja através dos filtros antes de bater a PMT.
  8. Anexar a fibra de 3,3 a unidade montada em 3.7.

4. offline Mixed Geração Emulsion

  1. Obter um dispositivo de microfluidos dropmaker foco de fluxo com um orifício de 60 x 60 mm uM.
  2. Encha uma seringa de 1 ml com HFE 7500 óleos com 2% fluorado iônica 9.
  3. Encha uma série de seringas de 1 ml com as seguintes combinações de fluoresceína (FITC) e corantes azul de dextrano conjugado (CB) em PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM de FITC / 10 nM CB, 1 nM de FITC / 100 nM CB, e 10 nM com FITC / 100 nM CB.
  4. Montar o dispositivo dropmaker no palco de um micros invertidaslidar e as seringas aquosos e óleo sobre bombas de seringa. Casal das seringas para os dispositivos que utilizam tubos PE-2.
  5. Executando bombas de seringa a 500 mL / h para o óleo e 250 ul / h durante as soluções aquosas, criar uma mistura de 80 uM gotículas contendo as soluções de 4,3. Para cada tipo de amostra aquosa, utilizar um dispositivo dropmaker fresco para eliminar a contaminação cruzada. Recolhe ~ 200 ul de emulsão a partir de cada combinação de corante para uma seringa vazia.
  6. Após os 4 tipos gotas foram coletadas em uma única seringa coleção, misturar a emulsão girando repetidamente a seringa.
  7. Repita os passos 4,2-4,6 com soluções aquosas contendo 0,1, 1, 10, e 100 nM com FITC em PBS.

5. Optical Fiber Inserção

  1. Coloque o chip microfluídico fabricados no passo 2 no palco de um microscópio invertido acoplado com uma câmera digital capaz de <100 ms velocidades do obturador.
  2. Trabalhando com cuidado de lado, inseta a fibra acoplado ao laser de 473 nm no montante de 120 canais mais distante mm, tomando cuidado para não perfurar até o canal de fluxo principal.
  3. Inserir a fibra acoplado ao laser de 405 nm no canal 120 uM alta lado mais distante a jusante, fornecendo o espaçamento da fibra de 300 mm.
  4. Inserir a fibra PMT-associado no canal 220 uM de altura normal, para as duas fibras de excitação de laser.

6. detecção de fluorescência de emulsões mistas

  1. Montar uma seringa de 5 ml cheio com HFE 7500 com 2% de surfactante fluorado iónica à entrada de óleo espaçador do dispositivo de detecção com tubagem PE-2.
  2. Monte a seringa contendo a emulsão / CB mista FITC em uma bomba de seringa orientado verticalmente e casal a entrada de gota reinjeção do dispositivo utilizando tubagem PE-2. Conectar um comprimento de tubagem PE-2 a partir da saída do dispositivo a um recipiente de resíduos.
  3. Primeiro o dispositivo rodando cada uma das bombas em 1000 uL / ​​hr até tantoóleo e as gotas são vistos para ser combinando regularmente no dispositivo e de fluxo a jusante.
  4. Ajustar as taxas de fluxo de modo que o óleo espaçador funciona a 6.000 l / h e as gotas a 100 l / h, proporcionando espaçamento significativa entre gotículas viajam através da região de detecção.
  5. Ligue os lasers, iniciar o programa de aquisição de dados e ajustar o ganho de PMT para fornecer sinais que são mais de 100 vezes o ruído da linha de base. Ajustar a potência do laser de modo a que todos os picos doublet são claramente visíveis em um único timetrace, linearmente dimensionado.
  6. Adquirir 60 seg do timetrace tensão PMT em pelo menos 20 kHz. Importe os dados em programa de computação, tais como Matlab e medir as alturas dos picos das dobletes gravados a partir do roteiro de programa de computação personalizado.
    NOTA: Este é fornecido como informação suplementar.
  7. Repita os passos de 6,2-6,7 usando o FITC-only emulsão mista criada em 4.7, com o laser de 405 nm desligado.

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Representative Results

A fabricação de um dispositivo de PDMS que permite a inserção de fibras ópticas exige um processo de passos múltiplos a fotolitografia para criar canais de altura variável (Figura 1). Em primeiro lugar, uma camada de 80 um de altura de SU-8 é girada sobre uma bolacha de silício e modelado utilizando uma máscara para criar a geometria de manipulação de fluidos. Em seguida, um 40 um camada adicional de SU-8 é girado para a bolacha, e modelado usando uma segunda máscara para criar recursos que formarão 120 mm de altura a laser canais de inserção de fibra. Por último, 100 uM mais SU-8 é girado para a bolacha, e modelado para dar 220 uM de detecção de altura canais de inserção da fibra. O mestre está desenvolvido e utilizado para moldar um dispositivo de PDMS, o que por sua vez está ligado a uma lâmina de vidro. A fabricação final contém 80 pm geometria fluxo alto, acessado através de furos na parte superior do dispositivo e 120 mm e 220 mm canais de fibra óptica altas acessado através do lado dadispositivo.

A geometria do dispositivo utilizado para a detecção é mostrado na Figura 2. Externamente gerados 80 uM emulsões são re-injectado numa abertura de queda e espaçadas por reinjecção óleo espaçador antes de fluir para dentro de um canal de detecção em forma de L. são inseridas duas fibras acoplado a laser em 120 uM canais altas proporcionar excitação a localizações espaciais discretas no canal de fluxo. Porque as fibras multimodo inseridos nestes canais têm um diâmetro externo de 125 um e um diâmetro de núcleo de 105 | iM, toda a secção transversal do canal de escoamento é iluminado por luz laser. Em nosso dispositivo do canal de fluxo de detecção faz uma curva de 90 graus abrupta após a última região excitação laser para criar acesso óptico perto de uma fibra OD 225 mm usado para detectar fluorescência emitida. A fibra maior é usado por causa da sua elevada abertura numérica (NA = 0,39), que é semelhante a uma objectiva de microscópio padrão.

Uma gotícula flui através do canal de detecção encontra regiões discretas de excitação na frente de cada uma das fibras ópticas acoplado a laser (Figura 3A). O único PMT acoplado aos registos de fibra de detecção de fluorescência emitida com um deslocamento temporal, os mapas para a fonte de excitação. Para uma gotícula que contém corantes que excita a 473 nm (região de "1" na Figura 3A) e a 405 nm (região "2" na Figura 3B), o sinal de PMT resultante contém um dupleto de sinal, com um pico de separação que se correlaciona com o tempo que leva uma gota para se deslocar de uma região de excitação para o próximo. Ao codificar temporalmente dados espectrais deste modo, a necessidade de uma maior retenção de luz e PMTs separados para cada cor fluoróforo é eliminado. A Figura 3B mostra dupletos de sinal para um trem de 4 gotas com diferentes combinações de corantes. O primeiro pico na dupla correspondems para a fluorescência emitida depois da excitação pelo laser 473 nm na região de "1" e o segundo pico corresponde a fluorescência emitida depois da excitação pelo laser de 405 nm na região de "2".

A eficácia do sistema de detecção foi testada através da detecção de uma emulsão mista de gotículas contendo corantes que excita a 405 nm (azul de dextrano conjugado, CB) e a 473 nm (fluoresceína, ITCF). Gotículas foram fluiu através das regiões de detecção em aproximadamente 50 Hz e os dados foram registrados durante 60 segundos, em seguida, pós-processados ​​com um script programa de computação. Os dados são representados graficamente na Figura 4 e mostra uma clara separação entre os quatro tipos de gotículas injectadas-Re. Uma vez que o sistema de detecção não diferenciar entre as diferentes cores da luz emitida, cada gotícula é descrito por sua fluorescência total máximo depois de ser animado na região "1" (pico 1) e na região 2 (2 pico).

(Figura 5). Os dados mostram a capacidade para detectar a concentração de corante que variam de 0,1 a 100 nM FITC em um único detector, com as mesmas configurações de detecção.

figura 1
Figura 1. Multi-camada de fotolitografia. O dispositivo de microfluidos é fabricado através da criação de um mestre com três alturas diferentes funcionalidades. Em primeiro lugar, uma camada de 80 um de altura de SU-8 é fiado em e modelado utilizando uma máscara para os canais de fluido. Em seguida, mais 40 mm SU-8 é girada sobre e 120 mm de altura recursos são padronizados com um mascarar tanto através dos SU-8 camadas para produzir a geometria para acomodar 125 mm fibras ópticas de altura. Após isto, uma00 mm mais SU-8 é girada sobre e modelado com uma máscara de para produzir 225 mm características de altura. Depois de desenvolver, ligas PDMS, e ligação de plasma ao vidro, o dispositivo resultante contém grandes canais acessíveis a partir do lado para a inserção de fibra, além de canais de fluido fechados padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Projeto de dispositivos e layout óptico. As porções de fluidos do dispositivo são compostos por um reinjector gota e um espaçador óleo, acoplado a um canal em forma de L. Fibras acoplados aos lasers individuais são inseridos normal à direcção de fluxo. Uma fibra de detecção é inserido perpendicular às fibras de laser, a fim de recolher a luz fluorescente. Esta luz é filtrada através de abandpass filtro, antes de ser detectado por um único PMT. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. codificação temporal da informação multicolor. Gotas (a) Fluxo através de regiões de excitação "1" e "2" em momentos diferentes, proporcionando deslocamento de tempo que permite a identificação da luz emitida. (B) de dados a partir de um trem de 4 gotas de diferentes fluem através do canal de detecção. O primeiro pico de cada dupleto corresponde à fluorescência emitida após excitação na região de "1" e o segundo pico em cada duplos corresponde à fluorescência emitida após excitação na região "2". A altura dos picos das gotículas são proporcionais a quantidade de corante a uma animadodado comprimento de onda, excepto quando de purga espectral ocorre devido ao uso de corantes com sobreposição de espectros de excitação. A largura dos picos são determinadas pela quantidade de tempo que leva uma gota de atravessar uma região de excitação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. multicolorido detecção de uma população mista de gotícula. Gráfico de dispersão que mostra a intensidade máxima da gota por uma população mista de gotículas depois da excitação e emissão de 473 nm por um laser (pico 1) e um laser de 405 nm (pico 2). As gotículas contêm combinações de fluoresceína (FITC) e azul cascata (CB) em concentrações Nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior destafigura.

Figura 5
Figura 5. detecção de cor Única sobre população gota altamente variada. Histograma de emissões por uma população gota mista contendo 0,1-100 nM de fluoresceína após excitação por um laser 473 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

detecção de fibra óptica requer o alinhamento das fibras ópticas com respeito a canais de fluido. Uma vez que o nosso dispositivo utiliza canais de guia fabricadas com fotolitografia multicamada, a colocação de máscaras com relação um ao outro é de grande importância. Se os canais de guia de fibra são demasiado perto do canal de fluido, existe um potencial para a fuga de fluido; Se os canais de guia estão localizados muito longe ou desalinhado, o sinal de fluorescência recolhida pela fibra de detecção pode ser significativamente diminuída. alinhamento adequado pode ser auxiliado através da concepção de marcas de alinhamento, tais como círculos concêntricos em máscaras para ser co-localizados durante a padronização da foto. Além disso, a inserção manual das fibras ópticas para dentro do dispositivo é um processo delicado com o potencial para quebrar as pontas das fibras no interior do dispositivo, tornando-os inutilizáveis. Restrição de fibra contra a lâmina de vidro ligado ao dispositivo de PDMS e inserindo as fibras lentamente enquanto se observa com o microscópio são as chaves para succinserção de fibra essful. Por último, a reinjecção de emulsões pré-formadas deve ocorrer com um mínimo de manipulação. Idealmente, uma vez que a emulsão é feita e depositados directamente para uma seringa vazia, não deve ser transferido até ser utilizado para a reinjecção das gotículas.

Multicolor detecção exige que os picos de um sinal dupleto ser distintos um do outro e que os sinais de gotas consecutivas não se sobrepõem. A configuração de detecção que usamos aqui usa um par de fibras ópticas 125 uM separadas a uma distância de centro a centro de 300 mm, proporcionando uma zona não iluminada de ~ 175 um entre as regiões de excitação. Isso permite que uma gota de 80 ^ m a ser excitado por uma única fonte de luz de cada vez e garante que cada um dos picos em um dupleto é apenas um resultado de um tipo de excitação laser. Desenhos onde a separação entre as regiões de excitação é semelhante ao diâmetro das gotículas dar sinais de sobreposição dupletos problemáticos com pico de emissão. Tele largura de um sinal dupleto correlaciona-se com o tempo que leva para o bordo dianteiro de uma gota para inserir as primeiras regiões de excitação para o momento em que o bordo de fuga da gotícula de sair da região de excitação final, uma distância de ~ 500 mm na dispositivo que descrevemos. A fim de manter a clareza de gotas detectadas adjacentes, dupletos de sinal têm de ser espaçadas por uma região de sinal de baixo, pelo menos, tão grande como o sinal de dupleto. Para a configuração descrita aqui, 80 uM gotículas são espaçadas de pelo menos 1 mm.

Embora a detecção multi-cor com um único fotodetector permite uma economia significativa em termos de custo e complexidade em comparação com técnicas convencionais, existe alguma perda de robustez porque a luz emitida não é filtrada por comprimento de onda. Isto pode ser problemático quando detectar gotículas que contêm vários fluoróforos que excitam nos mesmos comprimentos de onda, porque a fonte de fluorescência é indistinguível. Estas limitações podem ser overcome através da realização de experimentos com perfis de excitação que não se sobrepõem, ou através da concepção de experiências onde spectral sangram mais não ocorre em um "canal" onde um ensaio sensível está sendo realizada. Isto é compatível com aplicações de detecção de microfluidos muitas das gotículas, em que um fundo brilhante corante é usado para indicar a presença de uma gotícula, e um segundo fluoróforo é usado para reportar o resultado de um ensaio de biologia molecular 10,11.

Comparado com técnicas padrão, a nossa abordagem tem duas vantagens principais: 1) as regiões de excitação espacialmente registrados eliminam a necessidade de filtragem da luz complicado, e 2) o uso da fibra óptica elimina a necessidade de um microscópio e hardware óptico à luz direta. Porque nós abordar as preocupações técnicas comuns com sistemas de detecção de microfluídicos, os investigadores anteriores desenvolveram métodos para lidar com preocupações semelhantes. Por exemplo, Martini et al. Fluorescência frequência codificar multicolor registradospor um único detector, projetando uma fonte de excitação através excepcionalmente modelado "código de barras" filtra 12. A nossa utilização de uma matriz de fibra óptica permite a utilização de um esquema de codificação temporal análoga usando o padrão, desligar os componentes de prateleira. A literatura mostra várias técnicas de acoplamento ópticos ópticos que são mais controladas que a inserção de fibra simples que descrevemos. Bliss et al. Usar guias de onda óptico com líquidos para a entrega cuidadosamente controlada e recolha de luz a partir de locais de microcanais específicos 13, Martinez Vasquez et al. Usar guias de onda do laser gravado em substratos de sílica fundida para fornecer luz de excitação 14 e Vishnubhatla et al. São capaz de fabricar precisamente canais de inserção de fibra usando uma combinação de irradiação com laser e química gravura 15. Cada uma destas técnicas requerem passos adicionais para além dos utilizados para fabricar a arquitectura fluídica base de um microflchip de uidic. Enquanto pode ser necessária para aplicações de detecção altamente sensíveis estes procedimentos de fabrico, verificou-se que a inserção da fibra em um canal moldado PDMS é adequada para a maioria das aplicações diárias do nosso laboratório. O sistema de detecção foi capaz de detectar concentrações de FITC para baixo para 100 pM em 80 | iM gotículas, mais ou menos equivalente à detecção de ~ 17.000 moléculas de fluoróforo. Esta sensibilidade é adequada para a maioria das aplicações de detecção no nosso laboratório que actualmente utilizam um sistema à base de epifluorescência, o mais comum dos quais sendo PCR-activado separação de células positivas de gotículas de ensaio contendo o equivalente de 10 6 moléculas de fluoróforo 11. A sensibilidade de detecção também se compara favoravelmente com recentemente relatado sensibilidades de outros sistemas à base de fibras ópticas - por exemplo, é 200x mais sensível do que o limite de detecção de 20 nM de Alexa Fluor 488 relatados em> 100 uM gotículas 7.

WE têm apresentado um esquema de detecção de gota compacto e modular, de microfluidos de multi-cor como uma alternativa para sistemas baseados em microscópio de epifluorescência mais caros, complexos, e volumosos. Os componentes de detecção necessários usados ​​aqui (lasers, fibras, adaptadores de fibra, filtrar e PMT) podem ser comprados de <US $ 10.000, fazendo a detecção gota multi-cor acessível a um grande número de investigadores, e permitindo que os investigadores individuais de suportar múltiplas estações de detecção num laboratório. O sistema também remover algumas barreiras à base de conhecimentos para a entrada, como é exigido um grau de familiaridade para alinhar os sistemas ópticos de espaço livre em conjunto com um microscópio de epifluorescência. Além disso, o tamanho reduzido da configuração detecções torna ideal para aplicações portáteis e de diagnóstico.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photomasks CadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3035 Microchem Y311074
SU-8 2050 Microchem Y111072
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
1 ml syringes BD 309628
10 ml syringes BD 309604
27 gaugue needles BD 305109
PE 2 polyethylene tubing Scientific Commodities, Inc. B31695-PE/2
Novec 7500 Fisher Scientific 98-0212-2928-5 Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant Synthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dye Life Technologies D-1976
Fluorescein sodium salt Sigma 28803
Quad bandpass filter Semrock FF01-446/510/581/703-25
PMT Thorlabs PMM02
Fiber port Thorlabs PAFA-X-4-A
lens tube Thorlabs SM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
125 μm fiber stripping tool Thorlabs T08S13
225 μm fiber stripping tool Thorlabs T10S13
laser fiber adapter OptoEngine FC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MDL-III-405 Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MLL-FN-473-50

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References

  1. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  2. Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8, (5), 870-891 (2013).
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