Multicolor Fluorescentie detectie voor Droplet Microfluidics Met behulp van optische vezels

1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco
Published 5/05/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Cole, R. H., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers. J. Vis. Exp. (111), e54010, doi:10.3791/54010 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Droplet microfluidics een platform voor high throughput biologie door compartimentering van experimenten in een groot aantal van de waterige druppeltjes gesuspendeerd in een drager olie 1. Druppeltjes zijn gebruikt voor toepassingen die variëren van eencellige analyse 2, digitale polymerasekettingreactie (PCR) 3, en enzym evolutie 4. Fluorescerende assays zijn de standaard manier van detectie voor druppel microfluidics, als hun heldere signalen en een snelle time respons verenigbaar is met het opsporen van sub-nanoliter druppel volumes bij kilohertz tarieven zijn. Veel toepassingen vereisen fluorescentiedetectie ten minste twee kleuren simultaan. Zo ons lab voert gewoonlijk PCR-geactiveerde sortering druppel experimenten die detectiekanaal gebruiken voor het resultaat van een test, en gebruikt een secundaire achtergrond kleurstof assay-negatieve druppeltje telbare 5 maken.

Typische detectie stations voor druppel microfluidics zijn based op epifluorescentie microscopen, en vereisen ingewikkelde licht manipulaties's om excitatielicht introduceren van vrije ruimte lasers in microscoop te worden gericht op het monster. Nadat fluorescentie wordt uitgezonden van een druppel, wordt het uitgezonden fluoresceerden licht gefilterd zodat elk detectie-kanaal maakt gebruik van een fotomultiplicatorbuis (PMT) gecentreerd op een golflengte band. Epifluorescentie-microscoop gebaseerde optische detectie systemen een toetredingsdrempel als gevolg van hun kosten, complexiteit en benodigde onderhoud. Optische vezels zorgen voor de middelen om een ​​vereenvoudigde en robuuste detectie systeem te bouwen, omdat vezels handmatig in microfluïdische apparaten kunnen worden geplaatst, waardoor de noodzaak voor-spiegel op basis van licht routing, en waardoor het licht paden te worden gekoppeld met behulp van optische vezel connectoren.

In dit artikel beschrijven we de assemblage en validatie van een compact en modulair systeem ter multicolor fluorescentiedetectie te voeren door gebruik te maken van een reeks van optische vezels eenda enkele fotodetector 6. Optische vezels zijn gekoppeld met individuele lasers en worden normaal opgenomen om een ​​L vormig stroomkanaal regelmatige ruimtelijke offsets. Een fluorescentie verzameling vezel wordt evenwijdig aan de excitatie regio en is verbonden met een PMT. Omdat een druppel passeert de laserstralen op verschillende tijdstippen, gegevens die door de PMT toont een tijdelijke offset waarmee de gebruiker onderscheid te maken tussen de uitgezonden nadat de druppel wordt opgewekt door elke afzonderlijke laserbundel fluorescentie. Deze tijdelijke verschuiving elimineert de noodzaak om uitgezonden licht te scheiden om afzonderlijke PMT's met behulp van een reeks dichroïsche spiegels en banddoorlaatfilters. Om de effectiviteit van de detector te valideren, kwantificeren we fluorescentie druppeltjes populaties inkapselen van kleurstoffen van verschillende kleuren en concentratie. De gevoeligheid van het systeem werd onderzocht voor een kleur fluoresceïne detectie en geeft de mogelijkheid tot druppeltjes met concentraties beneden detecteren 0,1 nM, een 200x gevoeligheid vertovement vergeleken met recente vezel gebaseerde benaderingen in de literatuur 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SU8 Master Fabrication

  1. Ontwerp de microfluïdische structuren voor drie lagen fabricage met behulp van design software en hebben de ontwerpen gedrukt door een verkoper aan printplaat film met 10 micrometer resolutie. De details van apparaatontwerp worden gegeven in een aangrenzende referentie 6 en het kanaal geometrieën zijn weergegeven in figuur 1. De lagen moeten omvatten uitlijnmerktekens om legeren features uit elke fabricage laag 8.
  2. Plaats een pre-gereinigde 3 inch diameter silicium wafer op een spin coater en zet de stofzuiger om het aan te brengen op de boorkop. Breng 1 ml SU8-3050 in het midden van de wafel en centrifugeren gedurende 20 sec bij 500 tpm, vervolgens 30 sec bij 1750 rpm, die een laagdikte van 80 pm.
  3. Verwijder de wafer en bakken op 135 ° C verwarmingsplaat gedurende 30 min. Laat de wafer afkoelen tot kamertemperatuur alvorens naar de volgende stap.
  4. Expose de gecoate wafer aan de 1 ste laag masker onder een gecollimeerde 190 mW, 365 nm LED voor 3 minuten. Na de belichting, plaatst u de wafer op een 135 ° C kookplaat gedurende 1 minuut, daarna afkoelen tot kamertemperatuur voordat u verder gaat met de volgende stap.
  5. Plaats de wafer op de spin coater en zet de stofzuiger om het aan te brengen op de boorkop. Breng 1 ml SU8-3050 in het midden van de wafel en centrifugeren gedurende 20 sec bij 500 tpm, vervolgens 30 sec bij 5000 rpm, wat resulteert in een laag die een extra dikte van 40 urn verschaft.
  6. Verwijder de wafer en bakken op een 135 ° C kookplaat gedurende 30 minuten, daarna afkoelen tot kamertemperatuur voordat u naar de volgende stap.
  7. Lijn de 2 e laagmasker op de geometrie patroon in 1.3 en bloot de gecoate wafer aan een gecollimeerde 190 mW, 365 nm LED voor 3 min. Na blootstelling, te plaatsen op een 135 ° C kookplaat gedurende 4 min 30 sec, daarna afkoelen tot kamertemperatuur voordat u verder gaat met de volgende stap.
  8. Plaats de wafer op de spin coater en zet de stofzuiger om het aan te brengen op de boorkop. Breng 1 ml SU8-3050 in het midden van de wafel en centrifugeren gedurende 20 sec bij 500 tpm, vervolgens 30sec bij 1000 rpm, wat resulteert in een laag die een extra dikte van 100 urn verschaft.
  9. Verwijder de wafer en bakken op een 135 ° C kookplaat gedurende 30 minuten, daarna afkoelen tot kamertemperatuur voordat u naar de volgende stap.
  10. Lijn de 3 e laagmasker op de geometrie patroon in 1.3 en bloot de gecoate wafer aan een gecollimeerde 190 mW, 365 nm LED voor 3 min. Na blootstelling, te plaatsen op een 135 ° C kookplaat 9 min, daarna afkoelen tot kamertemperatuur voordat u verder gaat met de volgende stap.
  11. Ontwikkeling van de maskers door onderdompeling in een geroerd bad van propyleenglycolmonomethyletheracetaat gedurende 30 min. Was de wafer in isopropanol en bakken op 135 ° C gedurende 1 min kookplaat. Plaats de ontwikkelde meester in een 100 mm petrischaal voor polydimethylsiloxaan (PDMS) gieten.

2. PDMS Device Fabrication

  1. Bereid 10: 1 PDMS door het combineren van 50 g siliconen basis met 5 g hardingsmiddel in een plastic beker. De inhoud met een draaiend gereedschap uitgerust met een roerstokje. degterwijl het mengsel in een exsiccator gedurende 30 minuten of totdat alle luchtbellen worden verwijderd.
  2. Giet de PDMS tot een dikte van 3 mm over de master te geven en plaats terug in de exsiccator voor verdere ontgassen. Zodra alle luchtbellen worden verwijderd bak de inrichting bij 80 ° C gedurende 80 min.
  3. Snijd het apparaat uit de mal met behulp van een scalpel en leg ze op een schone ondergrond met de patroon naar boven en pons de vloeibare in- en uitlaten met een 0,75 mm biopsie punch. Het apparaat moet worden gesneden zodat de 120 urn en 220 urn lang geometrieën zijn vanaf de zijkant van het apparaat.
  4. Plasma behandelen apparaat, met kenmerk naar boven, samen met een voorgereinigde 2 inch bij 3 inch glasplaatje bij 1 mbar O2 plasma gedurende 20 seconden in een 300 W plasma cleaner. Bond de PDMS inrichting door het plaatsen van het patroon van het PDMS apparaat op de met plasma behandelde zijde van het glaasje. Plaats het apparaat in een 80 ° C oven en bak de samengestelde inrichting voor 40 min.
  5. Render de kanalenhydrofobe via een injectiespuit aan het apparaat met een gefluoreerde oppervlakte behandelingsvloeistof spoelen. Onmiddellijk bak de inrichting bij 80 ° C gedurende 10 minuten om het oplosmiddel te verdampen.

3. Voorbereiding van optische componenten

  1. Bereid de laser excitatie vezel door het verwijderen van de isolatie van de laatste 5 mm van een 105 micrometer kern, 125 urn bekleding, NA = 0,22 optische vezel.
  2. Bereid de 2 e kleuren laser excitatie vezel door het herhalen van 3.1 voor een 2e identieke vezels.
  3. Bereid de vezel voor het verzamelen van de fluorescentie-signaal door het herhalen van 3.1 voor een 200 urn kern, 225 urn bekleding, NA = 0,39 optische vezel.
  4. Inspecteer de uiteinden van de vezels - als de tips niet eindigen in een plat vlak, re-klieven de uiteinden met een vezel schrijver.
  5. Bevestig een laser vezel koppelaar een 50 mW, 405 nm laser en bevestig één van de 105 urn kernvezels de laser. Richt de gestripte uiteinde op de sensor van het laservermogenmeter, en gebruik maken van de fijnafstelling van de laser koppeling naar het laservermogen te maximaliseren.
  6. Herhaal 3,5 voor een 50 mW, 473 nm laser.
  7. Monteer een 446/510/581/703 nm quad banddoorlaatfilters op de PMT gebruik lens buizen laserlicht te blokkeren en te verzenden uitgezonden fluorescentie. Bevestig fiber koppeling zodat het licht reist door de filters alvorens naar de PMT.
  8. Bevestig de vezel van 3,3 tot het apparaat geassembleerd in 3.7.

4. Offline Mixed Emulsion Generation

  1. Het verkrijgen van een stroom aandacht microfluidics dropmaker apparaat met een 60 micrometer x 60 micrometer opening.
  2. Vul een 1 ml spuit met HFE 7500 olie met 2% ionische fluorsurfactans 9.
  3. Vul een reeks van 1 ml injectiespuiten met de volgende combinaties van fluoresceïne (FITC) en dextran-geconjugeerde blauwe kleurstoffen (CB) in PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM CB en 10 nM FITC / 100 nM CB.
  4. Monteer de dropmaker apparaat op het podium van een omgekeerde micro'sgaan en de waterige en olie spuiten op spuitpompen. Stel de spuiten om de apparaten met PE-2 buizen.
  5. Running spuitpompen 500 ul / uur voor de olie- en 250 ul / uur voor het waterige oplossingen, creëren een mengsel van 80 urn druppeltjes met de oplossingen van 4,3. Voor elk type waterige monster, gebruik dan een frisse dropmaker apparaat om kruisbesmetting te voorkomen. Verzamel ~ 200 ul emulsie van elke kleurstofcombinatie in een lege injectiespuit.
  6. Na de 4 druppels types zijn verzameld in een enkele verzameling spuit, meng de emulsie door herhaaldelijk draaien van de spuit.
  7. Herhaal stap 4,2-4,6 met waterige oplossingen die 0,1, 1, 10 en 100 nM FITC in PBS.

5. Optical Fiber Insertion

  1. Plaats de microfluïdische chip vervaardigd in stap 2 op het podium van een omgekeerde microscoop gekoppeld aan een digitale camera die in staat <100 psec sluitersnelheden.
  2. aandachtig werken vanaf de zijkant, insert de vezel gekoppeld aan de 473 nm laser in de verste stroomopwaartse 120 um kanaal, zorg niet om door te prikken aan de hoofdstroom kanaal.
  3. Steek de vezel gekoppeld aan de 405 nm laser in de verste stroomafwaartse 120 micrometer hoog zijkanaal, waardoor vezels tussenruimte van 300 micrometer.
  4. Plaats de PMT-gekoppelde vezel in de 220 urn lang kanaal loodrecht op de twee laser excitatie vezels.

6. Fluorescentie Detectie van Mixed emulsies

  1. Monteer een 5 ml injectiespuit gevuld met HFE 7500 met 2% ionische fluorsurfactant de afstandhouder olie inlaat van de detectie-inrichting met PE-2 buizen.
  2. Monteer de spuit met de gemengde FITC / CB-emulsie op een verticaal georiënteerd spuit pomp en koppel om het apparaat druppel herinjectie inlaat met behulp van PE-2 buizen. Sluit een lengte van PE-2 buizen van de afrit apparaat naar een afvalcontainer.
  3. Vul het apparaat door het uitvoeren van elk van de pompen bij 1000 ul / uur totdat beideolie druppeltjes worden gezien regelmatig worden gecombineerd in de inrichting en stroomt stroomafwaarts.
  4. Regel het debiet zodanig dat de afstandhouder olie draait op 6000 pl / uur en de druppels bij 100 pl / uur, wat een aanzienlijke afstand tussen druppeltjes reizen door de detectie regio.
  5. Zet de lasers, start het data-acquisitie programma, en pas de PMT winst voor signalen die meer dan 100x de basislijn lawaai verdieping zijn voorzien. Stel het laservermogen zodat alle doublet pieken zijn duidelijk zichtbaar op één lineair geschaald timetrace.
  6. Verwerven van 60 sec van het PMT voltage timetrace op tenminste 20 kHz. Importeer de gegevens in de computer programma zoals Matlab en meet de hoogtes van de pieken van de opgenomen doubletten met behulp van het programma aangepast computergebruik script.
    LET OP: Deze wordt verstrekt als aanvullende informatie.
  7. Herhaal stap 6,2-6,7 met behulp van de FITC-only gemengde emulsie gemaakt in 4.7, met de 405 nm laser uitgeschakeld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vervaardiging van een PDMS apparaat waarmee het inbrengen van optische vezels vereist een meerstaps fotolithografie procedure kanalen van variërende lengte (figuur 1) te maken. Eerst wordt een 80 urn groot laag van SU-8 gesponnen op een siliciumwafel gevormd en met behulp van een masker om de fluïdumverwerking geometrie. Vervolgens wordt een additionele 40 um laag van SU-8 gesponnen op de wafel en gevormd met behulp van een tweede masker om functies 120 urn lang laserfiber insertie kanalen vormen te creëren. Last, 100 urn meer SU-8 wordt gesponnen op de wafer, en gedessineerde tot 220 micrometer lang detectie fiber inbrengen kanalen geven. De master wordt ontwikkeld en gebruikt om een ​​PDMS apparaat, dat op zijn beurt gebonden is aan een glasplaatje vormen. De uiteindelijke fabricage bevat 80 micrometer lang stromingsgeometrie, bereikbaar via gaatjes in de bovenkant van het toestel en 120 pm en 220 pm lang glasvezel kanalen toegankelijk via de zijkant van deapparaat.

De geometrie van de inrichting gebruikt voor detectie wordt getoond in figuur 2. Extern gegenereerde 80 urn emulsies worden opnieuw geïnjecteerd in een daling herinjectie poort en gescheiden door afstandhouder olie voordat ze uitmonden in een L vorm detectiekanaal. Twee-laser gekoppelde vezels ingebracht in 120 micrometer lang kanalen bieden excitatie bij discrete ruimtelijke locaties in het stroomkanaal. Omdat de multimode vezels ingebracht in deze kanalen een 125 urn buitendiameter en een 105 urn kerndiameter, wordt de gehele doorsnede van het stromingskanaal verlicht met laserlicht. In ons apparaat maakt het opsporen stromingskanaal een abrupt 90 graden bocht na de laatste laser excitatie regio dicht optische toegang voor een 225 micrometer OD vezel gebruikt om uitgezonden fluorescentie sporen te creëren. De grotere vezel wordt gebruikt vanwege de hoge numerieke apertuur (NA = 0,39), wat vergelijkbaar is met een standaard microscoop objectief.

Een druppel die door de detectiekanaal tegenkomt excitatie discrete gebieden voor elk van de laser gekoppelde optische vezels (figuur 3A). De single PMT gekoppeld aan de detectie-vezel platen uitgezonden fluorescentie met een tijdelijke verschuiving van de kaarten om de excitatie bron. Een druppel die kleurstoffen die exciteren bij 473 nm (gebied "1" in figuur 3A) en 405 nm (gebied "2" in figuur 3B) bevat, de resulterende PMT signaal bevat een signaal doublet met een piek scheiding die correleert met de tijd die een druppel van de ene excitatiegebied naar de volgende. Door tijdelijk coderen spectrale gegevens op deze wijze wordt de behoefte aan verdere lichtfiltering PMT en apart voor elke fluorofoor kleur geëlimineerd. Figuur 3B toont signaal doubletten voor een trein van 4 druppels met verschillende kleurstof combinaties. De eerste piek in de dubbele overeenkomens aan de uitgezonden na excitatie door 473 nm laser in het gebied "1" en de tweede piek correspondeert met fluorescentie uitgezonden fluorescentie na excitatie door 405 nm laser in het gebied "2".

De werkzaamheid van de detectiemethode werd getest door het detecteren van een gemengde emulsie van druppeltjes met kleurstoffen die exciteren bij 405 nm (blauw dextran-geconjugeerde, CB) en 473 nm (fluoresceïne, FITC). Droplets werden stroomde door de detectie regio's op ongeveer 50 Hz en gegevens werden genoteerd voor 60 sec, dan post-verwerkt met een computer programma script. De gegevens worden uitgezet in figuur 4 en toont duidelijke scheiding tussen de vier opnieuw geïnjecteerd druppel types. Omdat het detectiesysteem geen onderscheid tussen de verschillende kleuren van uitgezonden licht, is elke druppel beschreven door zijn maximale totale fluorescentie nadat ze enthousiast in regio "1" (piek 1) en in regio 2 (piek 2).

(Figuur 5). De gegevens tonen het vermogen om kleurstof concentratie die bereik van 0,1 tot 100 nM FITC op een enkele detector met dezelfde detectie detecteert.

Figuur 1
Figuur 1. Multi-layer fotolithografie. De microfluïdische apparaat wordt gefabriceerd door het creëren van een meester met drie verschillende functie hoogtes. Eerst wordt een 80 urn groot laag van SU-8 spinde en gevormd met een masker voor de fluïdumkanalen. Next, 40 urn meer SU-8 wordt gesponnen op tot 120 micrometer lang functies worden gevormd met een 2 e maskeren door beide van de SU-8 lagen aan de geometrie opleveren tot 125 micrometer lang optische vezels tegemoet te komen. Hierna 100 urn meer SU-8 wordt gesponnen op en patroon met een 3 e masker tot 225 micrometer lang functies opleveren. Na het ontwikkelen, PDMS molding, en plasma hechting aan glas, de resulterende apparaat bevat grote kanalen bereikbaar vanaf de zijkant voor fiber inbrengen, naast de standaard meegeleverde fluïdumkanalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Device ontwerp en optische lay-out. De vloeibare delen van de inrichting bestaan ​​uit een druppel reinjector en een olie afstandhouder, gekoppeld aan een L-vormig kanaal. Vezels gekoppeld met individuele lasers worden normaal toegevoegd aan de stromingsrichting. Een detectie vezel loodrecht op de laserfibers opgenomen ter fluorescerend licht op te vangen. Dit licht wordt gefilterd door abandpass filter, alvorens te worden ontdekt door een enkele PMT. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Temporal codering van multicolor informatie. (A) Druppeltjes stromen door excitatie regio's "1" en "2" op verschillende tijdstippen, verschaffen tijdsverschuiving dat de identificatie van het uitgestraalde licht maakt. (B) Gegevens uit een trein van 4 verschillende druppeltjes die door de detectie-kanaal. De eerste piek van elk doublet overeenkomt met de uitgezonden na excitatie in het gebied "1" en de tweede piek in elke dubbele overeenkomt met de uitgezonden na excitatie in het gebied "2" fluorescentie fluorescentie. De hoogte van druppel pieken evenredig de hoeveelheid kleurstof opgewonden bij eenbepaalde golflengte, tenzij spectrale bloeding optreedt als gevolg van het gebruik van kleurstoffen met overlappende excitatiespectra. De breedte van de pieken worden bepaald door de hoeveelheid tijd die het duurt een druppel naar traverse een excitatie regio. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Meerkleurig detectie van een gemengde populatie druppel. Scatter plot toont maximale intensiteiten druppel voor druppel een gemengde populatie na excitatie en emissie van een 473 nm laser (piek 1) en een 405 nm laser (piek 2). De druppels bevatten combinaties van fluoresceïne (FITC) en cascade blauw (CB) in nM concentraties. Klik hier om een grotere versie van deze fotofiguur.

figuur 5
Figuur 5. Een kleur detectie op zeer gevarieerd druppel bevolking. Histogram van de emissies door een gemengde druppel bevolking met 0,1-100 nM van fluoresceïne na excitatie door een 473 nm laser. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Glasvezel detectie vereist de aanpassing van de optische vezels met betrekking tot vloeistof kanalen. Omdat onze apparaat maakt gebruik van gidskanalen gefabriceerd met multilayer fotolithografie, plaatsing van maskers met ten opzichte van elkaar is van groot belang. Indien de vezel geleidingskanalen te dicht bij het vloeistofkanaal, is er een risico van lekkage; als de gids kanalen bevinden zich te ver weg of niet goed uitgelijnd, kan de fluorescentie signaal verzameld door de detectie vezel aanzienlijk worden verminderd. Goede afstemming kan worden geholpen door het ontwerpen uitlijning merken, zoals concentrische cirkels in maskers om samen worden geplaatst tijdens de foto patroonvorming. Bovendien handmatige invoer van glasvezel in de inrichting is een delicaat proces met het potentieel om de uiteinden van de vezels breken in de inrichting, waardoor ze onbruikbaar. Beteugeling van vezel tegen het glaasje gebonden aan de PDMS apparaat en het invoegen van de vezels langzaam met inachtneming met de microscoop worden sleutels tot successful fiber inbrengen. Ten slotte herinjectie voorgevormde emulsies moet plaatsvinden met een minimale hantering. Idealiter zodra de emulsie wordt gemaakt en direct afgezet in een lege injectiespuit, mag het niet worden overgedragen totdat het wordt gebruikt voor druppel herinjectie.

Multicolor detectie vereist dat de pieken in het signaal doublet worden onderscheiden van elkaar verschillen en de signalen voor opeenvolgende druppels niet overlappen. De detectie opstelling die we hier gebruiken gebruiken twee 125 urn optische vezels gescheiden bij een hart op hartafstand van 300 urn, die een onverlicht gebied van ~ 175 urn tussen excitatie regio. Hierdoor kan een 80 um druppel worden geëxciteerd door één lichtbron tegelijk en verzekert dat elk van de pieken in een doublet is uitsluitend het gevolg van een type laser excitatie. Ontwerpen waarbij de afstand tussen de excitatie regio's is gelijk aan de druppeldiameter geven problematische signalen met overlappende emissiepiek doubletten. THij breedte van een signaal doublet correleert met de tijd die het duurt voordat de voorrand van een druppel op de eerste excitatie gebieden voer het tijdstip waarop de achterlopende rand van de druppel aan de uiteindelijke excitatiegebied, een afstand van ~ 500 urn in de reactie apparaat dat we beschrijven. Om het onderscheid van aangrenzende gedetecteerd druppeltjes handhaven signaalpaden doubletten worden gescheiden door een lage signaalgebied ten minste even breed als het signaal doublet. Voor de hier beschreven configuratie worden 80 um druppels afstand minimaal 1 mm.

Hoewel veelkleurige detectie met één fotodetector maakt aanzienlijke besparingen in termen van kosten en complexiteit in vergelijking met standaard technieken, is er een verlies van stevigheid omdat uitgestraalde licht wordt gefilterd door golflengte. Dit kan problematisch zijn bij het detecteren druppels die meerdere fluoroforen dat prikkelen bij dezelfde golflengten bevatten, omdat de fluorescentie bron onderscheiden. Deze beperkingen kunnen worden overcome door het uitvoeren van experimenten met overlappende excitatie profielen, of door het ontwerpen van experimenten waarbij spectraal randen dan niet optreedt in een "kanaal" wanneer een gevoelige test wordt uitgevoerd. Dit is compatibel met vele druppel microfluïdische detectie toepassingen, waarbij een heldere achtergrond kleurstof wordt toegepast om de aanwezigheid van een druppel aan te geven en een tweede fluorofoor wordt gebruikt om het resultaat van een moleculair biologische assay 10,11 rapporteren.

Vergeleken met standaardtechnieken, onze benadering heeft twee belangrijke voordelen: 1) ruimtelijk geregistreerde excitatie gebieden overbodig ingewikkelde licht filteren, en 2) het gebruik van optische vezels neemt de behoefte aan een microscoop en optische hardware direct licht. Omdat we te pakken gemeenschappelijke technische problemen met microfluïdische detectiesystemen, hebben eerdere onderzoekers methoden om soortgelijke problemen aan te pakken ontwikkeld. Bijvoorbeeld, Martini et al. Frequentie-encode multicolor fluorescentie geregistreerddoor een enkele detector door het projecteren van een excitatie bron via uniek gevormde "streepjescode" filtert 12. Ons gebruik van een samengestelde optische vezel maakt het gebruik van een soortgelijke codeerschema temporele middels standaard, uit voorraad componenten. Uit de literatuur blijkt optische tal van optische koppeling technieken die meer worden gecontroleerd dat de eenvoudige vezels inbrengen dat we beschrijven. Bliss et al. Gebruiken vloeistof gevulde optische golfgeleiders voor de zorgvuldig gecontroleerde aflevering en het verzamelen van het licht van specifieke microkanaal locaties 13, Martinez Vasquez et al. Gebruiken golfgeleiders laser geëtst in fused silica substraten excitatielicht 14 en Vishnubhatla et al leveren. Zijn staat nauwkeurig fabriceren vezels inbrengen kanalen met een combinatie van laserbestraling en chemische etsen 15. Elk van deze technieken vereisen extra stappen dan die welke de basis vloeibare architectuur van een microfl fabricerenuidic chip. Hoewel deze fabricage procedures voor zeer gevoelige detectie toepassingen zijn, hebben wij gevonden dat vezels inbrengen in een kanaal gevormd PDMS is voldoende voor de meeste dagelijkse toepassingen in ons laboratorium. Het detectiesysteem kon FITC concentraties beneden detecteren 100 pM in 80 urn druppeltjes, ongeveer gelijk aan de detectie van ~ 17.000 fluorofoor moleculen. Deze gevoeligheid is geschikt voor de meeste toepassingen detectie in ons laboratorium momenteel een epifluorescentie-systeem, de meest voorkomende daarvan worden PCR-geactiveerde celsortering assay positief druppeltjes die het equivalent van 10 6 11 fluorofoor moleculen. De detectiegevoeligheid tiewerk zich onlangs gemeld gevoeligheden van andere optische vezels gebaseerde systemen - bijvoorbeeld is 200x gevoeliger dan de detectiegrens van 20 nM van Alexa Fluor 488 bij> 100 urn druppeltjes 7.

we is een compact en modulair druppel microfluïdische meerkleurige detectieschema voorgesteld als een alternatief voor duurdere, complexe en volumineuze epifluorescentiemicroscoop systemen. De noodzakelijke detectie componenten die hier gebruikt (lasers, vezels, vezel adapters, filter, en PMT) kan worden gekocht voor <$ 10.000, waardoor de multi-color druppeltje detectie toegankelijk voor een groot aantal onderzoekers, en het toestaan ​​van individuele onderzoekers meerdere detectie stations veroorloven in een laboratorium. Het systeem ook een aantal expertise op basis van belemmeringen voor de toegang, als een zekere mate van vertrouwdheid is nodig om ruimte vrij optische systemen af ​​te stemmen in combinatie met een epifluorescentie microscoop. Daarnaast is de kleine footprint van de detecties opzet maakt het bij uitstek geschikt voor draagbare en diagnostische toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photomasks CadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3035 Microchem Y311074
SU-8 2050 Microchem Y111072
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
1 ml syringes BD 309628
10 ml syringes BD 309604
27 gaugue needles BD 305109
PE 2 polyethylene tubing Scientific Commodities, Inc. B31695-PE/2
Novec 7500 Fisher Scientific 98-0212-2928-5 Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant Synthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dye Life Technologies D-1976
Fluorescein sodium salt Sigma 28803
Quad bandpass filter Semrock FF01-446/510/581/703-25
PMT Thorlabs PMM02
Fiber port Thorlabs PAFA-X-4-A
lens tube Thorlabs SM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
125 μm fiber stripping tool Thorlabs T08S13
225 μm fiber stripping tool Thorlabs T10S13
laser fiber adapter OptoEngine FC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MDL-III-405 Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MLL-FN-473-50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  2. Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8, (5), 870-891 (2013).
  3. Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
  4. Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107, (14), 4004 (2010).
  5. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8, (4), (2013).
  6. Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15, (13), 2754-2758 (2015).
  7. Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
  8. Lithography. Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015).
  9. DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85, (21), (2013).
  10. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882 (2012).
  11. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85, (16), 8016-8021 (2013).
  12. Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12, (23), 5057-5062 (2012).
  13. Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7, (10), 1280-1287 (2007).
  14. Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
  15. Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17, (10), 8685-8695 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats