Multicolore fluorescenza Detection per Droplet microfluidica tramite fibre ottiche

1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco
Published 5/05/2016
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Bioengineering

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Summary

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Cole, R. H., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers. J. Vis. Exp. (111), e54010, doi:10.3791/54010 (2016).

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Abstract

Introduction

Microfluidica gocciolina forniscono una piattaforma per alta biologia throughput compartimenti esperimenti in un gran numero di goccioline acquose sospese in un olio vettore 1. Goccioline sono stati utilizzati per applicazioni vari come singola analisi cella 2, la reazione a catena della polimerasi digitale (PCR) 3, ed enzimi evoluzione 4. saggi fluorescenti sono la modalità standard di rilevamento per microfluidica di gocce, come i loro segnali luminosi e tempo di risposta veloce sono compatibili con la rilevazione dei volumi goccioline sub-nanolitri a tassi kilohertz. Molte applicazioni richiedono il rilevamento della fluorescenza per almeno due colori simultaneamente. Per esempio, il nostro laboratorio esegue comunemente PCR-attivata esperimenti gocciolina ordinamento che utilizzano un canale di rilevamento per il risultato di un test, e utilizza uno sfondo tintura secondaria per rendere gocciolina test negativo numerabile 5.

stazioni di rilevamento tipiche per microfluidica droplet sono based su microscopi epifluorescenza, e richiedono complicati sistemi di manipolazioni di luce per introdurre luce di eccitazione da laser spazio libero nel microscopio ad essere focalizzata sul campione. Dopo fluorescenza viene emessa da una goccia, la luce emessa fluoresced è filtrato in modo che ciascun canale di rilevamento utilizza un tubo fotomoltiplicatore (PMT) centrata su una banda di lunghezze d'onda. sistemi di rilevamento ottico epifluorescenza microscopio a base di fornire una barriera all'ingresso a causa della loro spese, la complessità e la manutenzione necessari. Fibre ottiche forniscono i mezzi per costruire un sistema di rilevamento semplificata e robusta, in quanto le fibre possono essere inseriti manualmente in dispositivi microfluidici, eliminando la necessità di instradamento specchio luce-based, e consentendo percorsi di luce da interfacciare tramite connettori di fibre ottiche.

In questo articolo, si descrive l'assemblaggio e la validazione di un sistema di compatto e modulare per eseguire il rilevamento della fluorescenza multicolore utilizzando una vasta gamma di fibre ottiche unda singola cellula fotoelettrica 6. Le fibre ottiche sono accoppiati alle singole laser e sono inseriti normale ad un canale di flusso a forma di L in offset spaziali regolare. Una fibra raccolta fluorescenza è orientato parallelamente alle regioni di eccitazione ed è collegato ad un singolo PMT. Poiché una gocciolina passa attraverso i raggi laser in tempi diversi, i dati registrati dal PMT mostra un temporale di offset che consente all'utente di distinguere tra la fluorescenza emessa dopo la gocciolina viene eccitato da ciascun fascio laser distinti. Questo spostamento temporale elimina la necessità di separare la luce emessa PMT separate mediante una serie di specchi dicroici e filtri passa-banda. Per convalidare l'efficacia del rivelatore, abbiamo quantificare la fluorescenza nelle popolazioni gocciolina incapsulanti tinture di colore e concentrazione diversa. La sensibilità del sistema è studiato per il rilevamento singolo colore fluoresceina, e dimostra la capacità di rilevare goccioline con concentrazioni fino a 0,1 nM, una sensibilità impr 200xovement rispetto agli approcci a base di fibre recenti riportati in letteratura 7.

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Protocol

1. SU8 Maestro Fabrication

  1. Progettare le strutture microfluidica per la fabbricazione di tre strati che utilizzano software di progettazione e hanno i disegni stampati da un fornitore su pellicola circuito con risoluzione di 10 micron. I dettagli della progettazione dei dispositivi sono forniti in un riferimento collegato 6 e le geometrie dei canali nella figura 1. Gli strati dovrebbero includere segni di allineamento per aiutare colloca caratteristiche di ogni strato fabbricazione 8.
  2. Posizionare un wafer di silicio del diametro di 3 pollici di pre-pulizia su un dispositivo a induzione giro e accendere il vuoto di apporre al mandrino. Applicare 1 ml di SU8-3050 al centro della fetta e centrifugare per 20 sec a 500 rpm, poi 30 sec a 1.750 rpm, fornendo uno spessore di 80 micron.
  3. Rimuovere il wafer e cuocere su una piastra C 135 ° per 30 min. Lasciare il wafer raffreddare a RT prima di passare alla fase successiva.
  4. Esporre il wafer rivestito alla st maschera 1 strato sotto un collimato 190 mW, 365 nm LED per 3 min. Dopo l'esposizione, posizionare il wafer su una piastra C 135 ° per 1 min, poi raffreddare a RT prima di procedere alla fase successiva.
  5. Posizionare la cialda sul dispositivo a induzione di spin e accendere il vuoto di apporre al mandrino. Applicare 1 ml di SU8-3050 al centro della fetta e centrifugare per 20 sec a 500 rpm, quindi 30 secondi a 5000 rpm, risultando in un livello che fornisce uno spessore supplementare di 40 micron.
  6. Rimuovere il wafer e cuocere su una piastra C 135 ° per 30 minuti, poi raffreddare per RT prima di passare alla fase successiva.
  7. Allineare la maschera di livello 2 ° sulla geometria di fantasia in 1.3 ed esporre il wafer rivestito per un collimato 190 mW, 365 nm LED per 3 min. Dopo l'esposizione, posto su una piastra C 135 ° per 4 minuti e 30 secondi, poi raffreddare per RT prima di procedere alla fase successiva.
  8. Posizionare la cialda sul dispositivo a induzione di spin e accendere il vuoto di apporre al mandrino. Applicare 1 ml di SU8-3050 al centro della fetta e centrifugare per 20 sec a 500 rpm, poi 30sec a 1.000 giri, risultando in un livello che fornisce uno spessore supplementare di 100 micron.
  9. Rimuovere il wafer e cuocere su una piastra C 135 ° per 30 minuti, poi raffreddare per RT prima di passare alla fase successiva.
  10. Allineare la maschera di livello 3 ° sulla geometria di fantasia in 1.3 ed esporre il wafer rivestito per un collimato 190 mW, 365 nm LED per 3 min. Dopo l'esposizione, posto su una piastra C 135 ° per 9 minuti, poi raffreddare per RT prima di procedere alla fase successiva.
  11. Sviluppare le maschere immergendo in un bagno agitata di propilenglicole monometiletere acetato per 30 min. Lavare il wafer in isopropanolo e cuocere su una piastra C 135 ° per 1 min. Posizionare il maestro sviluppato in una capsula di Petri 100 mm per polidimetilsilossano (PDMS) stampaggio.

2. PDMS fabbricazione di dispositivi

  1. Preparare 10: 1 PDMS combinando 50 g di base siliconica con 5 g di catalizzatore in una tazza di plastica. Mescolare il contenuto con un utensile rotante dotato di un bastoncino. degquando la miscela in un essiccatore per 30 minuti, o fino a quando tutte le bolle d'aria vengono rimosse.
  2. Versare il PDMS per dare uno spessore di 3 mm sopra il master e inserire di nuovo nel essiccatore per un ulteriore degasaggio. Una volta che tutte le bolle vengono rimossi, cuocere il dispositivo a 80 ° C per 80 min.
  3. Tagliare il dispositivo dallo stampo utilizzando un bisturi e posto su una superficie pulita con il lato modellato e pugni gli ingressi e le uscite fluidici con un pugno biopsia 0,75 millimetri. Il dispositivo deve essere tagliato in modo che i 120 micron e 220 micron geometrie alte sono accessibili dal lato del dispositivo.
  4. Plasma trattare il dispositivo, con il lato caratteristica, insieme con un pre-puliti 2 pollici da 3 pollici vetrino a 1 mbar O 2 al plasma per 20 secondi in un pulitore di plasma di 300 W. Incollare il dispositivo PDMS ponendo il lato modellato del dispositivo PDMS sul lato plasma trattata del vetrino. Posizionare il dispositivo in forno a 80 ° e cuocere il dispositivo montato per 40 min.
  5. Render i canaliidrofobica utilizzando una siringa per sciacquare il dispositivo con un fluido di trattamento superficiale fluorurato. cuocere immediatamente il dispositivo a 80 ° C per 10 minuti per evaporare il solvente.

3. Preparazione di componenti ottici

  1. Preparare la fibra di eccitazione laser rimuovendo l'isolamento dall'ultima 5 mm a 105 micron nucleo, 125 rivestimento micron, NA = 0,22 fibra ottica.
  2. Preparare il 2 ° laser a colori in fibra di eccitazione ripetendo 3.1 per un 2 ° fibra identici.
  3. Preparare la fibra per raccogliere il segnale di fluorescenza ripetendo 3.1 di 200 micron nucleo, 225 rivestimento micron, NA = 0,39 fibra ottica.
  4. Ispezionare le punte di tutte le fibre - se le punte non terminano in una superficie piana, ri-fendere le estremità con uno scriba fibra.
  5. Attaccare un accoppiatore fibra laser a 50 mW, 405 nm laser e collegare uno dei 105 micron fibre nucleo al laser. Dirigere il fine spogliato verso il sensore della potenza del lasermetro, e usare le regolazioni fini del copulante laser per massimizzare la potenza del laser.
  6. Ripetere 3.5 per un laser nm 50 mW, 473.
  7. Montare un 446/510/581/703 nm filtri passa-banda quad sulla PMT utilizzando tubi di lenti per bloccare la luce del laser e trasmettere fluorescenza emessa. Fissare fibra accoppiatore in modo che la luce viaggia attraverso i filtri prima di colpire il PMT.
  8. Fissare la fibra da 3,3 all'unità assemblati in 3.7.

4. Offline misto Emulsione Generation

  1. Ottenere un dispositivo di microfluidica dropmaker fuoco flusso con un 60 micron x 60 micron orifizio.
  2. Riempire una siringa da 1 ml con HFE 7500 oli con 2% fluoro ionico 9.
  3. Riempire una serie di 1 ml siringhe con le seguenti combinazioni di fluoresceina (FITC) e destrano coniugato coloranti blu (CB) in PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM CB, e 10 nM FITC / 100 nM CB.
  4. Montare il dispositivo dropmaker sul palco di un micro invertitifar fronte e le siringhe acquosi e olio su pompe a siringa. Coppia le siringhe ai dispositivi che utilizzano PE-2 tubi.
  5. Esecuzione pompe a siringa a 500 microlitri / hr per l'olio e 250 microlitri / hr per le soluzioni acquose, crea una miscela di 80 micron goccioline contenenti le soluzioni da 4.3. Per ogni tipo di campione acquoso, utilizzare un dispositivo dropmaker fresca per evitare contaminazioni. Raccogliere ~ 200 ml di emulsione da ogni combinazione colorante in una siringa vuota.
  6. Dopo 4 tipi goccioline sono stati raccolti in una singola siringa raccolta, mescolare l'emulsione ripetutamente ruotando la siringa.
  7. Ripetere i passaggi 4,2-4,6 con soluzioni acquose contenenti 0,1, 1, 10, e 100 nM FITC in PBS.

5. Fibra ottica Inserimento

  1. Posizionare il chip microfluidico fabbricato nella fase 2 sul palcoscenico di un microscopio invertito accoppiato con una fotocamera digitale in grado di <100 msec tempi di posa.
  2. Lavorare con attenzione di lato, Insert la fibra accoppiata al laser 473 nm in 120 canale più lontano upstream micron, facendo attenzione a non forare attraverso il canale di flusso principale.
  3. Inserire la fibra accoppiata al laser 405 nm nel 120 micron canale di alta lato più a valle, fornendo la spaziatura fibra di 300 micron.
  4. Inserire la fibra PMT-accoppiato nel 220 micron di altezza canale normale per le due fibre di eccitazione laser.

6. Rilevazione fluorescenza di emulsioni misti

  1. Montare una siringa da 5 ml riempito con HFE 7500 con 2% fluoro ionico all'ingresso dell'olio distanziale del dispositivo di rilevazione con PE-2 tubi.
  2. Montare la siringa contenente il misto FITC / CB emulsione su una pompa a siringa con orientamento verticale e di coppia di ingresso di gocce di reiniezione del dispositivo utilizzando PE-2 tubi. Collegare un tratto di tubo PE-2 dall'uscita dispositivo ad un contenitore per rifiuti.
  3. Prime dispositivo eseguendo ciascuna delle pompe a 1.000 ml / h fino a quando entrambipetrolio e goccioline sono visti da combinare regolarmente nel dispositivo e che scorre a valle.
  4. Regolare le portate in modo tale che l'olio distanziale corre a 6.000 ml / hr e le goccioline a 100 l / h, che fornisce notevole spaziatura tra le goccioline che viaggiano attraverso la regione di rilevamento.
  5. Accendere i laser, avviare il programma di acquisizione dei dati, e regolare il guadagno PMT per fornire segnali che sono più di 100 volte il rumore di fondo della linea di base. Regolare la potenza del laser in modo che tutti i picchi doppietto sono chiaramente visibili una singola, timetrace linearmente scalato.
  6. Acquisire 60 sec del timetrace tensione di PMT ad almeno 20 kHz. Importare i dati in programma di calcolo come Matlab e misurare le altezze dei picchi dei doppietti registrati utilizzando lo script del programma di calcolo personalizzato.
    NOTA: Questo è fornito come informazioni supplementari.
  7. Ripetere i passaggi 6,2-6,7 con il FITC solo emulsione mista creata in 4.7, con il laser 405 nm spento.

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Representative Results

Realizzazione di un dispositivo PDMS che permette l'inserimento di fibre ottiche richiede una procedura di fotolitografia multistep per creare canali di diversa altezza (figura 1). Innanzitutto, un 80 micron alto strato di SU-8 è filata su un wafer di silicio e modellato usando una maschera per creare la geometria gestione dei fluidi. Quindi, un ulteriore strato di 40 micron di SU-8 è filata sul wafer, e modellato usando una seconda maschera per creare caratteristiche che formeranno 120 micron laser altezza canali inserimento fibra. Ultimo, 100 micron più SU-8 è filata sul wafer, e modellato per dare 220 micron di rilevamento di altezza canali di inserimento fibra. Il master è sviluppato e utilizzato per modellare un dispositivo PDMS, che è a sua volta legato ad un vetrino. La fabbricazione finale contiene 80 micron geometria del flusso di altezza, si accede tramite fori nella parte superiore del dispositivo e 120 micron e 220 micron canali in fibra ottica ad alto fusto si accede attraverso il lato delladispositivo.

La geometria del dispositivo utilizzato per il rilevamento è mostrato in Figura 2. Esternamente generati 80 micron emulsioni sono ri-iniettato in un porto goccia reiniezione e distanziati da olio spacer prima che confluiscono in un canale di rilevamento L forma. Due fibre laser accoppiati sono inseriti in 120 micron canali alti forniscono eccitazione a posizioni spaziali discreti nel canale di flusso. Poiché le fibre multimodali inserite in questi canali hanno un diametro esterno 125 micron e un diametro di nucleo 105 micron, l'intera sezione trasversale del canale di flusso è illuminata dalla luce laser. Nel nostro dispositivo il canale di flusso di rilevazione fa una brusca rotazione di 90 gradi dopo l'ultima regione di eccitazione laser per creare un facile accesso ottico per una fibra OD 225 micron utilizzato per rilevare la fluorescenza emessa. La fibra più grande viene utilizzato per la sua elevata apertura numerica (NA = 0,39), che è simile ad un obiettivo standard di microscopio.

Una goccia che scorre attraverso il canale di rilevamento rileva regioni discrete eccitazione davanti a ciascuna delle fibre ottiche laser accoppiato (Figura 3A). Il singolo PMT accoppiato ai record in fibra di rilevazione fluorescenza emessa con uno spostamento temporale delle mappe alla fonte di eccitazione. Per una gocciolina che contiene coloranti che eccitano a 473 nm (regione "1" nella figura 3A) ed a 405 nm (regione "2" nella figura 3B), il segnale PMT risultante contiene un segnale doppietto con una separazione dei picchi che correla con la tempo necessario una gocciolina di muoversi da una regione di eccitazione al successivo. Con codifica temporalmente dati spettrali in questo modo, la necessità di ulteriore filtraggio luce e PMT separate per ciascun colore fluoroforo viene eliminata. La Figura 3B mostra doppietti segnale di un treno di 4 gocce con diverse combinazioni di tintura. Il primo picco nel doppio corrispondonos alla fluorescenza emessa dopo l'eccitazione dal laser 473 nm nella regione "1" e il secondo picco corrisponde a fluorescenza emessa dopo l'eccitazione dal laser 405 nm nella regione "2".

L'efficacia del sistema di rilevamento è stato testato rilevando una emulsione mista di goccioline contenenti coloranti che eccitano a 405 nm (destrano coniugato blu, CB) ed a 473 nm (fluoresceina, FITC). Goccioline sono stati scorreva attraverso le regioni di rilevazione a circa 50 Hz e dati sono stati registrati per 60 secondi, poi post-elaborati con uno script del programma di calcolo. I dati sono tracciati nella figura 4 e mostra netta separazione tra i quattro tipi di goccioline ri-iniettato. Poiché il sistema di rilevamento non distingue tra diversi colori della luce emessa, ogni goccia è descritto attraverso fluorescenza massima totale dopo essere eccitato in regione "1" (picco 1) e nella regione 2 (picco 2).

(figura 5). I dati mostrano la capacità di rilevare la concentrazione di colorante che comprese tra 0,1 e 100 nM FITC su un singolo rivelatore con le stesse impostazioni di rilevamento.

Figura 1
Figura 1. multistrato fotolitografia. Il dispositivo di microfluidica è fabbricato con la creazione di un maestro con tre diverse altezze caratteristica. Innanzitutto, un 80 micron alto strato di SU-8 è avvitato o modellata utilizzando una maschera per i canali di fluido. Successivamente, 40 micron più SU-8 è filata su e 120 micron caratteristiche ad alto fusto sono modellati con un 2 ° maschera attraverso entrambi i SU-8 strati di cedere la geometria di ospitare 125 micron fibre ottiche ad alto fusto. Dopo questo, 100 micron altro SU-8 è filata su e modellato con una maschera 3 ° a cedere 225 micron caratteristiche ad alto fusto. Dopo aver sviluppato, stampaggio PDMS, e incollaggio plasma per il vetro, il dispositivo risultante contiene grandi canali accessibili dal lato per l'inserimento di fibre, oltre ai canali fluidi standard, chiusi. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. Dispositivo di progettazione e il layout ottica. Le porzioni fluidici del dispositivo sono costituiti da un reinjector gocciolina e un distanziale olio, accoppiato ad un canale a forma di L. Fibre accoppiati alle singole laser sono inseriti normale alla direzione del flusso. Una fibra rilevamento viene inserito perpendicolarmente alle fibre laser per raccogliere luce fluorescente. Questa luce è filtrata attraverso abandpass filtro, prima di essere rilevato da un unico PMT. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. codifica temporale delle informazioni multicolore. (A) Goccioline fluiscono attraverso regioni di eccitazione "1" e "2" in tempi diversi, fornendo time shift che permette l'identificazione della luce emessa. (B) I dati da un treno di 4 gocce differenti che scorre attraverso il canale di rilevamento. Il primo picco di ciascun doppietto corrisponde alla fluorescenza emessa dopo l'eccitazione nella regione "1" e il secondo picco in ogni doppio corrisponde alla fluorescenza emessa dopo l'eccitazione nella regione "2". L'altezza dei picchi goccioline sono proporzionali alla quantità di colorante eccitato undata lunghezza d'onda, eccetto quando si verifica a causa dell'uso di coloranti con sovrapposizione di eccitazione spettri spurgo spettrale. La larghezza dei picchi sono determinati dalla quantità di tempo che ci vuole una goccia per attraversare una regione di eccitazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. rilevamento multicolore di una popolazione mista gocciolina. Scatter plot mostrando intensità massime gocciolina per una popolazione mista gocciolina dopo eccitazione e di emissione da un laser 473 nm (picco 1) e un laser 405 nm (picco 2). Le gocce contengono combinazioni di fluoresceina (FITC) e blu cascata (CB) a concentrazioni nm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questafigura.

Figura 5
Figura 5. rilevamento unico colore su molto varia popolazione di gocce. Istogramma delle emissioni da una popolazione mista di gocce che contiene 0,1-100 nM di fluoresceina dopo l'eccitazione da un laser 473 nm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

rilevamento a fibre ottiche richiede l'allineamento delle fibre ottiche rispetto ai canali di fluido. Poiché il nostro dispositivo utilizza canali di guida fabbricati con fotolitografia multistrato, collocamento di maschere rispetto all'altro è di grande importanza. Se i canali di guida fibra sono troppo vicino al canale del fluido, vi è un potenziale di fuoriuscita di fluido; se i canali di guida sono situate troppo lontano o disallineata, il segnale di fluorescenza raccolte dalla fibra rilevamento può essere significativamente ridotta. Il corretto allineamento può essere aiutata da progettare segni di allineamento, come cerchi concentrici in maschere per essere posizionato in foto patterning. Inoltre, inserimento manuale delle fibre ottiche nel dispositivo è un processo delicato con il potenziale per rompere le punte delle fibre all'interno del dispositivo, rendendole inutilizzabili. Trattenendo fibra contro il vetrino legato al dispositivo PDMS e inserendo le fibre lentamente osservando al microscopio sono le chiavi per succinserimento fibra essful. Ultimo, reiniezione di emulsioni preformate dovrebbe verificarsi con un minimo di movimentazione. Idealmente, una volta che l'emulsione viene fatta e depositato direttamente in una siringa vuota, non dovrebbe essere trasferito fino al suo utilizzo per la gocciolina reiniezione.

rilevamento multicolore richiede che i picchi in un segnale doppietto essere distinti tra loro e che i segnali da gocce consecutive non si sovrappongano. La configurazione di rilevamento che usiamo qui utilizza una coppia di 125 micron fibre ottiche separate ad una distanza da centro a centro di 300 micron, fornendo una regione non illuminata di ~ 175 micron tra regioni di eccitazione. Questo permette una gocciolina 80 micron a essere eccitato da una sola sorgente luminosa alla volta e garantisce che ciascuno dei picchi in un doppietto è solo a seguito di un tipo di eccitazione laser. Disegni in cui la separazione tra le regioni di eccitazione è simile al diametro delle gocce danno segnali problematici con sovrapposizione doppietti picco di emissione. Tha larghezza di un segnale doppietto correlato al tempo necessario per il bordo di una gocciolina di immettere le prime regioni di eccitazione al momento in cui il bordo posteriore della goccia di lasciare la regione di eccitazione finale, una distanza di ~ 500 micron nel dispositivo descriviamo. Per mantenere distintività di goccioline identificati adiacenti, doppietti segnale devono essere distanziate di una regione a basso del segnale di almeno grande come il doppietto del segnale. Per la configurazione descritta qui, 80 micron goccioline sono distanziate di almeno 1 mm.

Sebbene rilevamento multicolore con un unico fotorivelatore consente notevoli risparmi in termini di costi e complessità rispetto alle tecniche standard, vi è una certa perdita di robustezza perché la luce emessa non è filtrato da lunghezza d'onda. Ciò può essere problematico quando rileva goccioline che contengono più fluorofori che eccitano alle stesse lunghezze d'onda, perché la fonte fluorescenza è indistinguibile. Queste limitazioni possono essere overcome effettuando esperimenti con i profili di eccitazione non sovrapposte, o progettando esperimenti in cui spettrale sanguinano sopra non si verifica in un "canale" in cui viene eseguito un test sensibile. Questo è compatibile con le applicazioni di rilevamento microfluidico molti gocciolina, dove uno sfondo luminoso colorante viene usato per indicare la presenza di una goccia, e un secondo fluoroforo viene utilizzato per segnalare il risultato di un saggio di biologia molecolare 10,11.

Rispetto alle tecniche standard, il nostro approccio ha due vantaggi principali: 1) regioni eccitazione spazialmente registrati eliminano la necessità di filtraggio della luce complicato, e 2) l'uso di fibre ottiche rimuove le esigenze di un microscopio e hardware ottico per luce diretta. Perché ci rivolgiamo problemi tecnici comuni con i sistemi di rilevamento microfluidica, gli investigatori precedenti hanno sviluppato metodi per affrontare preoccupazioni simili. Per esempio, Martini et al. Frequenza-codificare multicolore fluorescenza registratoda un singolo rivelatore proiettando una sorgente di eccitazione attraverso modellato in modo univoco "codice a barre" filtri 12. L'uso di una matrice di fibra ottica permette l'utilizzo di uno schema simile codifica temporale utilizzando standard largo delle componenti scaffale. La letteratura mostra ottici numerose tecniche accoppiamento ottico che sono più controllato che l'inserimento della fibra semplice che descriviamo. Bliss et al. Utilizzare liquido o guide d'onda ottiche per l'erogazione attentamente controllata e la raccolta di luce da specifiche posizioni microcanali 13, Martinez Vasquez et al. Utilizzare guide d'onda inciso al laser in substrati di silice fusa per fornire luce di eccitazione 14, e Vishnubhatla et al. Sono in grado di realizzare con precisione i canali di inserimento della fibra utilizzando una combinazione di irraggiamento laser e chimica incisione 15. Ciascuna di queste tecniche richiedono passaggi aggiuntivi oltre quelli usati per fabbricare l'architettura fluidico base di un microflChip uidic. Mentre possono essere necessarie per applicazioni di rivelazione altamente sensibili queste procedure di fabbricazione, abbiamo trovato che l'inserimento della fibra in un canale PDMS stampata è adeguato per la maggior parte delle applicazioni quotidiane nel nostro laboratorio. Il sistema di rilevamento è in grado di rilevare le concentrazioni FITC fino a 100 pM a 80 micron goccioline, approssimativamente equivalente al rilevamento di ~ 17.000 molecole fluoroforo. Questa sensibilità è adeguato per la maggior parte delle applicazioni di rivelazione nel nostro laboratorio attualmente utilizzando un sistema epifluorescenza basato, il più comune dei quali essendo PCR-attivato cell sorting di goccioline positivi dosaggio contenenti l'equivalente di 10 6 molecole fluoroforo 11. La sensibilità di rilevamento confronta anche favorevolmente recentemente riportato sensibilità degli altri sistemi basati su fibra ottica - per esempio, è 200x più sensibile rispetto al limite di rilevabilità di 20 Nm di Alexa Fluor 488 riportati in> 100 micron goccioline 7.

We hanno presentato un sistema di rilevamento multicolore microfluidica gocciolina compatta e modulare come alternativa ai sistemi basati epifluorescenza microscopio più costosi, complessi e ingombranti. I componenti di rilevazione necessari utilizzati qui (laser, fibre, adattatori di fibra, filtrare e PMT) possono essere acquistati per <$ 10.000, rendendo la rilevazione delle gocce multicolore accessibile a un gran numero di ricercatori, e permettendo ai singoli ricercatori di permettersi più stazioni di rilevamento in un laboratorio. Il sistema rimuove anche alcune barriere competenza-based per l'ingresso, come è richiesto un grado di familiarità per allineare sistemi ottici di spazio libero in combinazione con un microscopio a epifluorescenza. Inoltre l'ingombro della configurazione rilevazioni rende ideale per applicazioni portatili e di diagnostica.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photomasks CadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3035 Microchem Y311074
SU-8 2050 Microchem Y111072
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
1 ml syringes BD 309628
10 ml syringes BD 309604
27 gaugue needles BD 305109
PE 2 polyethylene tubing Scientific Commodities, Inc. B31695-PE/2
Novec 7500 Fisher Scientific 98-0212-2928-5 Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant Synthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dye Life Technologies D-1976
Fluorescein sodium salt Sigma 28803
Quad bandpass filter Semrock FF01-446/510/581/703-25
PMT Thorlabs PMM02
Fiber port Thorlabs PAFA-X-4-A
lens tube Thorlabs SM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
125 μm fiber stripping tool Thorlabs T08S13
225 μm fiber stripping tool Thorlabs T10S13
laser fiber adapter OptoEngine FC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MDL-III-405 Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MLL-FN-473-50

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References

  1. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  2. Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8, (5), 870-891 (2013).
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