Generation af Microtumors Brug 3D Menneskelig Biogel Kultur System og Patient-afledte glioblastomaceller for Kinomic Profilering and Drug respons Testing

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gilbert, A. N., Shevin, R. S., Anderson, J. C., Langford, C. P., Eustace, N., Gillespie, G. Y., Singh, R., Willey, C. D. Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing. J. Vis. Exp. (112), e54026, doi:10.3791/54026 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

De mest almindelige primære intrakranielle maligne hjernetumorer er klasse III astrocytomer og grad IV glioblastoma multiforme (glioblastom eller GBM). Disse tumorer tilbyde dårlige prognoser med median et-års overlevelse mellem 12 - 15 måneder med nuværende behandlinger for GBM i USA 1-3. Multimodalitet terapier omfatter kirurgi, stråling, og kemoterapi herunder temozolomid (TMZ) og kinase-målrettede midler. Kinase signalering ofte dysreguleret i GBM, herunder delmængder af tumorer med forstærkning eller aktiverende mutationer i epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), stigninger i blodpladeafledt vækstfaktorreceptor (PDGFR) signalering, øget phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) og tumor understøtter angiogen signalering gennem karendotelvækstfaktor Receptor (VEGFR) samt andre kinase drevet veje 4-6. Nuværende in vitro og in vivo modeller ofte mister disse repræsentative ændringer <sup> 7. Derudover har genetisk profilering ikke tilbudt de forventede fordele, der kan afspejle, at genetiske og epigenetiske ændringer ikke altid forudsige ændringer i niveauet af protein-aktivitet, hvor de fleste kinase målrettet midler virker direkte, og hvor terapier med andre virkningsmekanismer kan handle indirekte.

Den traditionelle immortaliseret cellelinie, som kan passeres ad infinitum har længe været standard til prøvning lægemidlet på grund af deres lette vedligeholdelse og reproducerbarhed. Men denne model lider af en høj næringsstof (og kunstige) vækstmiljø, der selekterer for hurtigt voksende celler, der afviger meget fra den oprindelige tumor. Som sådan har der været en betydelig interesse i at udvikle mere realistiske modelsystemer, der afspejler en mere kompleks tumor biologisk system som er til stede i patienten. Tumorxenoplantater udviklet direkte fra en primær tumor dyrket i mus ( "xenoline," patient-afledt xenograft eller PDX) bestemde en mere reflekterende modelsystem, især i fastsættelsen af kræftmedicin, som de er følt til mere pålideligt forudsige klinisk succes. 8. På trods af den mere reflekterende biologi, disse modeller er dyre og er vanskelige at etablere og vedligeholde. Desuden er de ikke egnede til high-throughput undersøgelser. Behovet for bedre at udvikle biologiske modeller, der mere præcist afspejler molekylære ændringer i de primære tumorer, og at profilere og teste disse modeller bruger direkte målinger af kinase aktivitet, ikke surrogat genetiske markører, er klar.

Det er velkendt, at i modsætning til to-dimensionel (2D) monolagskulturer, kan 3D eller flercellede assay modeller giver mere fysiologisk relevante endpoints 9-11. Fælles 3D kultur tilgange involverer matrix-coatede mikrobærere og celle klumpformet formation. Tumor sfæroider kan genereres via cellulære sammenlægning hjælp spinner kolbe pHEMA plade og hængende drop teknikker. Begrænsninger for tisse tilgange omfatter: manglende evne til nogle celler til at danne stabile sfæroider, variation i væksten og udfordringer med blandede celletyper. Alternativt mange syntetiske (hydrogel, polymer) og animalsk afledte Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix fra muse sarkomer, bovint kollagen) matrixer er blevet udviklet til 3D kulturundersøgelser 12-14. Muse EHS matrix benyttes flittigt men kendt for at fremme cellevækst og differentiering in vitro og in vivo 15.

For at replikere 3D tumorbiologi, blev en human biomatrix system udviklet af Dr. Raj Singh et al. 16. Den naturlige, vækstfaktor-fri human Biogel tillader 3D kultur stilladser (perler, skiver), der støtter langsigtet dyrkning af flere celletyper. En serie af 3D human Biogel kultur designs er etableret til undersøgelse tumorvækst, adhæsion, angiogenese og invasion egenskaber. Fordele og egenskaber af humant Biogel sammenlignet med fællesmuse EHS-geler er sammenfattet i tabel 1 og tabel 2.

Kilde: Menneskelig Amnions (Pooled væv)
Patogenfri, IRB-fritaget / godkendt
ECM natur: Ikke-denatureret Biogel (GLP-produktion)
Nøgle
komponenter:
Col-I (38%), laminin (22%), col-IV (20%), col-III (7%), entactin & HSPG (<3%)
GF-fri: Målbart EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-angiogene, Ikke-giftige)

Tabel 1: Egenskaber af menneskelige Biogel Sammenlignet med Common EHS Gels.

Menneskelig Biogel EHS geler
Naturlig human matrix Rekonstitueret mus matrix
Kontrolleret cellevækst & differentiering Kan fremme cellevækst & differentiering
Fysiologisk genekspression Variabel genekspression
3D vævslignende kulturmodel Plade-baseret model kultur

Tabel 2: Fordele ved menneskelige Biogel Sammenlignet med Common EHS Gels.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Alle xenograft terapi evalueringer blev udført ved hjælp af en ortotopisk tumor model for glioblastom på en protokol godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg.

1. Isolering af Patient-afledt GBM xenograft Cells

  1. Fremstilling af reagenser
    1. Re-udgøre collagenase-I i sterilt vand til en koncentration på 5 mg / ml og sterilt filter. Opbevares i 1 ml alikvoter ved -20 ° C (slutkoncentration er 50 ug / ml i 100 ml enzymopløsning).
    2. Opløs 100 ug epidermal vækstfaktor (EGF) i 2 ml steril phosphatbufret saltvand (PBS). Opbevares i 100 pi (5 ug / 100 pi) alikvoter ved -20 ° C i en endelig koncentration på 10 ng / ml.
    3. Opløs 100 ug FGF-β i 2 ml sterilt PBS. Opbevares i 100 pi (5 ug / 100 pi) alikvoter ved -20 ° C i en endelig koncentration på 10 ng / ml.
    4. Tilføj følgende til en 500 ml flaske Neurobasal Media (NBM) at forberede komplet NBM: 10 ml B-27 tillæg uden vitamin A, 5 ml N2 supplement, 100 pi EGF, 100 pi fibroblast vækstfaktor (FGF) -Grundmetaller, 5 ml amphotericin B, 0,5 ml gentamycin, 5 ml L-glutamin.
    5. Forbered frisk enzym løsning ved at kombinere: 98,5 ml PBS, 1 ml collagenase-1, 0,5 ml 10x trypsin / EDTA og der steriliseres ved filtrering gennem 0,22 um pore-filter.
    6. Forbered eller opnå et lille volumen sterilt Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) / F12 cellekulturmedium med 7% føtalt bovint serum (FBS) og 1 x PBS uden calcium eller magnesium.
  2. Tumor Disaggregering
    BEMÆRK: athymiske nu / nu mus, der tidligere injiceret med tumorceller i højre flanke og lades fra en håndgribelig tumormasse er nødvendig for denne procedure. I de her viste eksempler, vi brugte patient-afledte xenograft GBM celler, JX10 og JX12 17.
    1. Steriliseres arbejdsområde ved sprøjtning 2% klorhexidin og oprette arbejdsområde with nødvendige instrumenter / transaktioner, herunder disponibel chuck, pincet, skalpel, glas petriskål, enzymopløsning, PBS, og chlorhexidin (se figur 2a).
    2. Aflive mus / mus, der huser en flanke tumor. Målet for en 20% / min forskydningshastighed på CO 2 ved anvendelse af 30% CO2. Efter musen viser åndedrætsstop, opretholde CO2 flow i ca. 1 min (typisk 3 min i alt). Mus fjernes fra kammeret og cervikal dislokation udføres som en sekundær eutanasi bekræftelse. Spray dyret med 3% chlorhexidin at rense huden.
    3. Hold musen stabil, gør halvcirkelformet hudincision ~ 1,5 cm fra tumormassen (flanke implanteret tumor) under anvendelse af en steril engangs skalpel med # 11 blad begynder craniale til tumormassen og indskæring mod bugen af ​​musen og rundt til den kaudale ende.
    4. Reflect huden over tumor masse hjælp fingre med blid trækkraft på caudale ende af snittet og derefter skubbe på hudenoverfladen for at løfte tumor at have bedste adgang uden at røre tumoren (se figur 2B).
    5. Brug stump dissektion med pincet til forsigtigt fri tumormasse fra bugvæggen og fra huden (se figur 2C).
    6. Transfer tumor masse med pincet til steril glas petriskål (Brug IKKE plastik retter til at forhindre brud under hakning) og ordentligt kassere slagtekroppen og placere disse instrumenter til side.
    7. Brug nyt sæt sterile instrumenter (skalpel med # 11 klinge, semi-buede pincet) til debridere tumorvæv af nekrotisk væv og membranøs vært bindevæv dækker tumor.
    8. Anbring 15 ml enzym opløsning i en steril ventileret-trypsinbehandling kolbe med omrører og begynder omrøring langsomt i hætten.
    9. I en steril glas petriskål, vask høstede tumorer 3 - 5 gange med sterilt PBS for at fjerne overskydende blod (kan hælde eller bruge sprøjten til at skylle dem med PBS). Forsigtigt vippe skålen og pipette eller aspirere vask materiale. Mince finely anvendelse af to # 11 skalpelblade (se figur 2D).
    10. Tilsættes 14 ml enzymopløsning til hakket tumor og pipette forsigtigt op og ned 2 - 3 gange. Overførsel blandingen til udluftet-trypsinbehandling kolbe og omrøres langsomt i 20 minutter. Forbered 5 50 ml koniske rør ved tilsætning 1,5 ml FBS til hver for at neutralisere trypsin i trin 1.2.11.
    11. Efter 20 min, indsamle 14 ml celle løsning fra trypsinbehandling kolbe og tilsættes til et rør med FBS. Tilføj 14 ml frisk enzymopløsning til kolbe og fortsætte omrøring.
    12. Centrifuger indsamlede celler ved 150 xg i 8 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten. Tilsættes 45 ml komplette NBM til pelleten, bland forsigtigt, og gentag centrifugeringen at skylle serum. Re-suspendere pellet i 5 ml komplet NBM og hold på is.
    13. Gentag trin celle høst for i alt 5 høsten, der kombinerer alle høstede-celler i en enkelt konisk rør på is.
    14. Placer en 40 um cellefilter på toppen af ​​en 50 ml konisk rør. Prep than cellefilter ved at lede 10 ml DMEM / F12 + 7% FBS gennem og derefter vask med 10 ml PBS.
    15. Tilsæt langsomt cellesuspension til si, så den kan dryppe igennem (se figur 2M). Løft forsigtigt fanen af cellen si i mellem hver ny tilføjelse til at bryde enhver vakuum og tillade de suspenderede celler at passere frit (se figur 2 N).
    16. Centrifugeres den filtrerede cellesuspension som ovenfor. Resuspender i 10 ml komplet NBM og tælle at bestemme det samlede antal af levedygtige celler under anvendelse af 0,04% trypanblåt og et hæmocytometer. Hold celler på is indtil microtumor generation.

2. Suppleant Tissue Disaggregering Protocol

  1. Automatiseret væv dissociator og opdeling system.
    1. Placer opdeling rør ind i den cellulære dissociator, vælge programmet "Tumor _02_02", og tryk på start og køre for 32 sek. Overførsel rør til rotator, sted i 37 ° C inkubator i 40 min.
    2. Centrifuge suspenderes-celler ved 150 xg i 8 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten. Mens centrifugering af cellerne, der er nedsat reagenser til behandling af cellesuspensionen. Tilsæt 10 ml serum-frit NBM og forsigtigt triturat suspension.
    3. Efter centrifugering opnå en cellepellet indeholdende ~ 10 - 30 x 10 6 levedygtige celler (~ 0,3 ml). Resuspenderede pellet i 10 ml serumfrit NBM (se figur 2O). Bestem de levedygtige celler ved udelukkelse assay (Se trin 3.2.2).

3. Microtumor Generation

  1. Fremstilling af reagenser
    1. Forbered komplet NBM som i 1.1.4 og forberede neutraliseret High Density menneskelige Biogel (HuBiogel) (HDHG på 3 mg / ml) pr intern protokol. Lignende Biogel matricer kan ligeledes anvendes.
  2. Microtumor Produktion og Kultur
    1. Opnå frisk dissocierede PDX celler som enkelt celle suspension i komplet NBM, på is.
    2. Bland cellen suspension med et tilsvarende volumen af trypan blå opløsning (0,4% i PBS) og analysere ved anvendelse hæmacytometer til bestemmelse celleantal og levedygtighed ved trypanblåteksklusion 18. Fjern volumen for at generere 50.000 celler / microtumor hvor volumen = (50.000 celler / tumor * # tumorer) / (levedygtige celletal / 1 ml) og anbringes i en frisk konisk rør.
    3. Koncentrer cellerne ved centrifugering ved 150 xg i 8 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes, og resuspender cellepelleten med iskold HDHG løsning i en endelig forhold på 1 del celler i FBS og 4 dele HDHG.
    4. Anvende et elektronisk multikanalpipette at dispensere 10 pi pr pin celle-HDHG blanding på en 96-polet stålplade (med hydrofob coating) for at generere microtumors (2 mm perler, der hver indeholder 50.000 celler).
    5. Placer 3D tumor perler inde vævskultur inkubator (37 ° C, 5% CO2, befugtet) i 15 minutter for at gelere perlerne.
    6. Efter gelering, overføre microtumors (10 μL) til en brugerdefineret suspensionskultur kammer (50 ml) eller stor mængde dyrkningsskål (10 cm) indeholdende komplet NBM hjælp af det elektroniske multi-kanal pipette og brugerdefinerede pin-enhed.
    7. Efter 1 - 2 dage i vævskultur inkubator, overføre microtumors til 96-brønds dyrkningsplader indeholdende 50 pi NBM / brønd med en bred mund dispensering pipette og udføre forskellige assay og analyse protokoller.
  3. Drug behandling og vedligeholdelse af microtumors
    1. Vælg endelige koncentrationer for test af lægemidler.
      BEMÆRK: Hvis lægemidlet har kendt virkningsfuldhed i 2D kultur vælge 2x IC50 som koncentrationen midterste dosis og vælg 3-fold seriefortyndinger over og under i alt 5 dosisniveauer. For eksempel, hvis IC50 er 9 pM for lægemidlet i 2D kultur, vælg 2 pM, 6 pM, 18 pM, 54 pM, og 162 uM som slutkoncentration for test af lægemidler.
    2. Forbered 2x dosering lægemiddelopløsning i komplet NBM fra dimethyl sulfoxide (DMSO) lager. Fortynd dosering opløsning i 1% DMSO medium til fremstilling af en 5-dosis, 3 gange seriel fortynding.
    3. Der tilsættes 50 pi dosering løsning på microtumor brønd indeholdende 50 pi i assayplader at opnå en endelig DMSO-koncentration på 0,5%. Gentag for hver gentagelse (f.eks 4) ved hver dosis lægemiddel bestemt i 3.3.1.
    4. Opretholde kulturer i 37 ° C, 5% CO2, befugtet vævskultur inkubator i 1 - 14 dage. Feed kulturer to gange om ugen ved forfriskende medier og narkotika løsning som ovenfor.

4. Morfologisk og fænotypisk analyse af Microtumors

  1. Bestem cellemorfologi i microtumors anvendelse af standard levende cellefarvning.
    1. Forbered 1 mM bestand af Calcein-AM i DMSO. Alikvot og opbevares ved -20 ° C.
    2. Ved ønskede kultur intervaller (1, 7, og 14 dage), tilsættes Calcein-AM opløsning fremstillet i PBS (uden Ca / Mg) til 96-brønds plade i 1 uM slutkoncentration.
    3. inkuber20 min i et 37 ° C, 5% CO2, befugtet inkubator, og billedet ved hjælp af et fluorescensmikroskop ved 2X, 4X, og 10X (excitation: 450 - 490 nm båndpas, emission: 515 nm lang pasning, dikroisk 500 nm) .
  2. Microtumor Vækst / Proliferation Assay
    1. MTT pulver i PBS opløses (uden Ca / Mg) til fremstilling af 12 mM stamopløsning. Sterilfilter, portion, og opbevares ved -20 ° C.
    2. Ved ønskede kultur intervaller (1, 7 og 14 dage), tilsættes 20 pi MTT-opløsning til 96-brønds plade pr 100 pi kulturvolumen. Inkuber 2 timer i vævskultur inkubator.
    3. Forbered frisk lysis opløsning af 10% SDS i 0,01 M HCI og tilføj samme mængde til kulturvolumen til plader. Inkubér forseglede plader natten over i 37 ° C inkubator.
    4. Absorbansen aflæses ved 570 nm under anvendelse af en multi-pladelæser.
  3. Microtumor Forberedelse til Kinomic Analyse
    1. Forbered lysepuffer ved præ-nedkøling til 4 ° C og derefter tilsætte en 1: 100-forhold hver af 100x ProTEIN Phosphatase Inhibitor (PPI) og 100x Protein proteasehæmmer (PI). Bland godt og holde på is.
    2. Transfer 2 microtumors til hver af tre 1,5 ml mikrocentrifugerør. Fjern supernatanten og tilsæt 40 ​​pi lysepuffer indeholdende PPI og PI til hvert rør og lyserer i 30 minutter ved 4 ° C.
    3. Pipette prøver kraftigt for at bryde tumor perler. Centrifuger ved 16.000 xg i 10 minutter ved 4 ° prøver C og opbevares ved -80 ° C indtil kinomic analyse.

5. Kinomic profilering Microtumors

  1. Proteintyrosinkinase (PTK) profilering
    1. Optø reagenser (10x proteinkinase (PK) puffer og 2% bovint serumalbumin (BSA)) til 4 ° C Load PK buffer (300 pi 10x PK buffer lager i 2,7 ml dH2O) i sprøjten i position # 2 på profilering perron.
    2. Åbn kinaseassay program og indlæse PTK-protokol-filen og tryk på 'START', udfyldelse prøver inden softwer program efter scanning chips. Placer chips onto profilering platform og belastning 25 pi 2% bovint serumalbumin (BSA) pr array og derefter trykke LOAD at begynde softwarestyret protokol blokerende trin.
    3. Fortynd 6 uM 100 mM ATP lager med 54 pi dH2O at gøre 10 mM adenosintriphosphat (ATP). Når softwaren begynder den 3. og sidste vask trin (synlig på skærmen) bringe 15 ug lysat bragt op til 28 pi med dH 2 O, mix og tilføje til array.
    4. Forbered PTK Master Mix (MM) (i op til 12 prøver). Tilføj 32,6 pi dH2O at rekonstituere dithiothreitol (DTT) og tilsæt 6 pi DTT og 60 pi 10x PK opløsning, til PTK-MM1 rør (allerede indeholder 60 pi 10x BSA).
    5. Vent 'Load' prompt i kinaseassay software vises derefter tilføje 126 ul PTK-MM1, 60 pi PTK additiv, og 60 pi 10 mM ATP til MM2 (indeholder tidligere opdelt i portioner 4,5 pi PY20 FITC antistof) og blandes.Tilføj 16 pi af denne PTK mester mix til hver prøve lysat rør og pipette mix 5 gange.
    6. Sørg dækglas er ren og derefter tilføje 35 pi lysat / master mix pr array, tæt karrusel låg, og tryk på LOAD-knappen.
  2. Serin / threonin-kinase (STK) profilering:
    1. Optø reagenser (10x PK buffer, 10x STK puffer og 2% BSA) til 4 ° C. Load PK buffer (300 pi i 2,7 ml dH 2 0) i sprøjten position # 1, 1:10 og STK puffer (300 pi i 2,7 ml dH 2 0) i sprøjten position # 2.
    2. Åbn kinaseassay software program, og indlæse STK protokol filen og tryk på START, udfyldelse prøver inden for programmet efter scanning chips. Placer chips onto profilering platform og belastning 25 pi 2% BSA pr vifte, og tryk LOAD for at starte softwaren kontrollerede protokol blokerende trin.
    3. Fortynd 6 uM 100 mM ATP med 54 pi dH 2 O. Under sidste (3.) vasketrinnet mix2 ug lysat og opdrage til 32,6 pi med dH 2 O, mix og tilføje til array.
    4. Gør STK mester mix: Tilføj 70 pi 10x PK til STK-MM1 rør (indeholder 7 pi 100x BSA), og derefter tilføje 42 pi dH 2 O til STK-MM1 rør.
    5. Vent 'Load' prompt i kinaseassay software derefter: Tilføj 18 pi 10 mM ATP til STK-MM1 og tilføje 9 pi MM1 til hver prøve lysat. Bland godt.
    6. Sørg dækglas er ren og tilsæt 35 pi lysat / master mix pr array, tæt karrusel låg, og tryk på LOAD.
    7. Under Final (3.) Vask Step tilføje 1,05 pi STK-FITC sekundært antistof til DMAB rør (indeholder 3,03 pi STK primært antistof mix), tilsættes 39,6 pi AB Buffer til DMAB, tilsættes 356,0 pi dH 2 O til DMAB, tilsættes 30 ul til DMAB til hvert array, og tryk på LOAD .
  3. Analyse af Kinomic data 19,20
    1. Åbn analyse software og indlæse billedanalyse App. seLect billede mappe, der indeholder stregkodede og tid-stemplet hele array-billeder til PTK eller STK data, skal du vælge artikelnummer matchede vifte layout fil (86.312 for PTK og 87102 for STK), og belastning tidligere genereret vifte annotation fil.
    2. Kontroller korrekt gridding af alle billeder, og køre Eksponeringstid Skalering App. Statistisk sammenligne eksponering / hældning log2 transformerede værdier, og validere med forvask kinetiske kurver 19-21.
    3. Kør opstrømskinase forudsigelse software til at forespørge ændrede kinomic profiler mellem betingelserne for opstrømskinaser 22,23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har vist, at 3D Biogel dyrkningssystem understøtter en langsigtet vækst og funktion af flere celletyper. I denne samarbejdsprojekt, er patient-afledt GBM xenolines (PDX) anvendes til fremstilling af hundredvis af microtumors. Dissocierede celler (3 x 10 5) eller neurosfærer (40 - 50) blev indlejret i Biogel perler (2 mm) og efter hurtig gelering de dyrkes i et NB-medier fyldt brugerdefinerede bioreaktor. Cellulær levedygtighed (Calcein-AM), vækstprofil (MTT), og kinomic aktivitet vifte-baseret analyse blev bestemt. PDX microtumors opretholdt flercellet organisation og høj levedygtighed (> 80%) for> 3 uger. Vi mener, at dette in vivo-lignende biologi skyldes vedligeholdelse af 3D-celle-matrix arkitektur (ikke muligt med 2D eller klumpformet kultur). Det er også observeret, at 3D-tumorer er vanskelige at fremstille med skrøbelige gelatinøse protein stillads, muligvis på grund af mangel på kollagen I 14. En arbejdsgruppe ordning for microtumor produktion ved hjælp PDX celler og 3D Biogel systemet er opsummeret i figur 1 og dissociationsprocessen er afbildet i figur 2.

Gennem levende celler via Calcein-AM, bestemmes vi cellevækst og levedygtighed samt virkningerne af lægemidler på GBM celler afledt fra PDX tumor JX10, som indikeret ved et fald i fluorescens, signalering celledød. Tumorvækst blev målt på dag 0, 7 og 14 for microtumors udviser kontinuerlig vækst som vist i figur 3A. Denne microtumor, JX10, er kendt for at være resistente over for TMZ. Ved udsættelse for 1 - 10 uM TMZ blev minimal vækst suppression bemærket (figur 3B). Imidlertid teste PDX tumor JX12, som er kendt for at være følsomme over for TMZ, demonstrerede følsomhed ved MTT-assay på 14 dage, der blev bekræftet af Calcein-AM imaging (figur 4).

er.within-side = "1"> For at udforske mulige mekanismer resistens, vi målte kinase signalering i TMZ resistente microtumors (JX10). Kinomic profiler til 144 tyrosin og 144 serin / threonin phosphopeptidsøjler mål blev fanget for DMSO og 10 pM TMZ behandlede microtumors. Kinomic fosforylering intensitet for alle peptid mål per cyklus, og pr flere gange eksponering blev fanget (data ikke vist). Et repræsentativt Heatmap viser peptider, der væsentligt havde ændret intensiteter med 10 pM TMZ behandling (p <0,05, uparrede studerende T-test) vises i figur 5A. Kinomic profiler, der er blevet omformet i TMZ behandlet JX10 microtumors blev analyseret under anvendelse af opstrømskinase forudsigelse software, der er konstateret SYK, LCK, og CTK kinaser som hævet i TMZ behandlede prøver i forhold til DMSO (figur 5B). Serin / threonin kinome opstrømskinase analyse blev ligeledes udført (figur 5C).

indhold "fo: holde-together.within-side =" 1 "> figur 1
Figur 1:. Working Ordning for Microtumor Production GBM-PDX tumorer adskilles fra den murine vært, og enkelte celler er indlejret i Biogel matrix til at danne microtumors. Analyser udføres derefter på microtumors. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. Dissociation af PDX tumorceller Tumorer fjernet fra værten mus og hakket før blanding med enzymopløsning (AG). Dissociation vises efter 40 min (H). Tumorcelleresistens dissociator vises (I). Triturering i medier og filtrering (JN) er vist med en ende result på 0,3 ml pellet (O) indeholdende 29,5 x 10 6 levedygtige celler (P), som danner sfæroider i NBM i 24 timer (Q). Scale bar er 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Vækst af Microtumors JX10 microtumor vækst målt ved optisk tæthed (OD) af MTT og repræsentative billeder over 14 dage, både basalt (A), og som svar på 1-10 pM TMZ behandling (B).. Billeder er vist ved 4X forstørrelse (skala bar = 500 um). Standardafvigelse er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 4
Figur 4:. Vækst af Microtumors JX12 microtumor vækst målt ved OD MTT og repræsentative billeder over 14 dage, både basalt (dag 1), og som svar på 0, 1, eller 10 uM TMZ behandling (skala bar = 500 um). Standardafvigelse er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Kinomic Profiler af TMZ Behandlet Microtumors Heatmap af eksponering integreret værdier (log 2 transformerede skråninger (x 100) 10, 20, 50, 100, og 200 ms median signal minus baggrund eksponeringsværdier) vises for en markant TMZ-ændret. ændrede peptider (p <0,05). Rød indikerer øget, og blå indikerer faldet i forhold til DMSO betyde pr peptid. TMZ ændrede profiler blev sammenlignet ved anvendelse af opstrømskinase forudsigelse software og ændrede kinaser. Normaliseret kinase Statistik (NKS) score> 1,0 og specificitet score> 1,3 (rød) betragtes meget ændret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske skridt i protokollen overvejende vedrører microtumor generation, samt dosering narkotika og vedligeholdelse. Fordi microtumor perler er skrøbelig og let revet, er der behov ekstrem omhu i begge udviklingsstadier i et assay og vedligeholdelse. Hvis der opstår en fejl under en af ​​disse processer, kan eksperimentel fortolkning blive kompromitteret, forårsager udvidelse eller unødvendig gentagelse af forsøgene eller endda udelukkelse af data.

Ændringer og fejlfinding, især af microtumor udviklingsprocessen, omfattede design og produktion af en brugerdefineret hydrofobt værktøj til brug for at gøre microtumor perler. Dette værktøj giver mulighed for hurtigere og mere præcis produktion af microtumors. Derudover små modifikationer af vedligeholdelse af microtumors bidraget til at fremskynde processen med at ændre medium og doseringsudstyr cellerne. Flere af disse modifikationer er inkluderet, men var ikke begrænset til, anvendelse af en multikanalelektronisk pipette til at fjerne og udskifte medium fra de 96 brønde og forblanding friske narkotika dosering løsninger og arrangere 2x løsninger i en tilsvarende 2 plade ml 96 brønde.

Større optimeringer for dyrkningsbetingelser i 3D-modellering omfatter fastsættelsen af ​​passende doser for lægemiddelstoffer, da der er en dårlig sammenhæng mellem 2D modellering og 3D-modellering. Derfor, for at seriefortyndinger etablere en dosis titreringskurven ofte er nødvendig for at bevæge en 2D modelsystem til 3D microtumor model.

Potentielle spørgsmål at overveje med microtumor generation fra xenoline tumorceller høstet fra en mus omfatter bakteriel eller svampeangreb inkonsekvent tilgængelighed af primære xenolines, som unikke vækst egenskaber i mus kan producere forskelle i høst og varians i celle udbytter fra separate dissociationer. Med hver cellelinie, antallet af celler modtagne og tilsvarende, hvor mange microtumors kan produceres will variere. Som sådan er der et behov for at prioritere hvilke analyser er nødvendige, og hvilke der er "frivillig" bør microtumor udbyttet være utilstrækkelig. Potentielle begrænsninger med kinomic profilering af microtumors omfatter vanskeligheden ved at korrigere for inert proteinholdigt materiale lastning, som prøver er indlæst på en sådan måde at korrigere for BCA bestemt proteinniveauer, der måske ikke skelner mellem Biogel baserede proteiner (ECM-proteiner) og ved den cellulær kinase komponent, der er beregnet til at blive målt. Måling af brutto- microtumor masse via Calcein-AM, eller ved hjælp af en husholdning protein som en korrektionsfaktor kan afbøde dette, selv om problemer med husholdning protein niveauer i tumorer at blive ændret, kan forvirre dette. For kort tid-retters signalering eksperimenter, antager lige store (kinase indeholder levende celler nummer) og parret behandlede og ubehandlede prøver, dette er mindre af et problem.

Med denne forskning, er målet at tilvejebringe en mere omkostningseffektiv effektiv og sygdom-repræsentativ præklinisk model for præcis medicinsk behandling test i forhold til ortotopisk patient-afledte xenotransplantater, den nuværende guldstandarden model for GBM test. I de seneste år har adskillige grupper forsøgt at modellere in vivo GBM miljø for drug testformål. Nogle grupper har simpelthen forsøgt at dyrke GBM tumorceller i ikke-differentierende betingelser for at bevare GBM stamceller eller mindst hjerne tumorfremkaldende celler (BTIC) 24,25. Disse tumorsphere eller neurosfære kulturer kan bruges til test af lægemidler og sandsynligvis bedre end traditionelle modeller. Men da de stadig mangler tumor-stroma samspil, der er bevaret i vores microtumor modellen, tumorsphere tilgang er stadig begrænset. Andre grupper har forsøgt at anvende tekniske principper for at forbedre GBM modeller 26-28. Disse metoder har omfattet strømningskamre, variable ECM-proteiner og tumorcelle / Normal celleblandinger. Mens lovende, næsten alle disse reports har brugt udødeliggjorte cellelinier med de tidligere nævnte forbehold. Som sådan mener vi, at PDX-baserede microtumor model beskrevet her er mere klinisk relevant.

I fremtiden kunne microtumor model anvendes enten en sand tumor avatar eller et "proband 'system. Med probanden systemet, PDX udviklet sig fra en bestemt patient ikke direkte informere klinikeren om den specifikke patients terapi, som med tumoren avatar system. I stedet er en patients tumor "matchede" til en allerede eksisterende, velkarakteriseret (både molekylært og fænotypisk) PDX 29. Faktisk kunne denne model fungere som en 'gå til' avatar eller opholde sig i en proband bibliotek som en sammenlignende profil. Med traditionelle avatarer, vokser en patients tumorceller i mus parallelt med patientens behandling er ikke kun tidskrævende, da det kan tage flere måneder for den primære passage, men også dyrt, som at teste flere dtæppe behandlinger i mus generere en overvældende pris. For at bekæmpe dette, kan den primære patient tumor implanteres direkte i Biogel matrix. Med microtumors, kunne genereres resultater hurtigt og til en lavere pris.

Som probanden model, kunne microtumor kinome dataprofiler og lægemiddelrespons tilføjes til en probanden 'bibliotek, "sammen med profiler og data fra tidligere 3D in vitro-modeller, eksisterende PDXs, dyreforsøg, andre patienter osv. I teorien kunne patientens tumorceller så være 'omically «(genomisk, kinomically, transcriptomically, etc.) matches til en tilsvarende eksisterende microtumor profil til at bestemme præcis behandling for det bedst mulige resultat.

Sammenfatning: Her identificerer vi, at disse microtumor modeller kan anvendes til at måle både fænotypiske vækst og kan forespørges på både det basale kinaseaktivitet niveau og som reaktion på lægemiddelbehandling, der kan være nyttigesom en translationel værktøj til yderligere præklinisk forskning. er bydende nødvendigt for effektiv lægemiddeludvikling udvikle nøjagtige, og molekylært gyldige testbare modeller for humane tumorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Støttet af NIH R21 tilskud (PI: C. Willey, CA185712-01), Brain Tumor SPORE award (PD: GY Gillespie, P20CA 151.129-03) og SBIR kontrakt (PI: R. Singh, N43CO-2013-00.026).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase-I  Sigma-Aldrich CO130
Trypsin EDTA (10x) Invitrogen 15400-054 
Neurobasal-A Life Technologies 10888-022
N-2 Supplement Life Technologies 17502-048 1x final concentration
B-27 Supplement w/o Vitamin A Life Technologies 12587-010 1x final concentration
Recombinant Human FGF-basic Life Technologies PHG0266 10 ng/ml final concentration
Recombinant Human EGF Life Technologies PGH0315 10 ng/ml final concentration
L-Glutamine Corning Cellgro Mediatech 25-005-CI 2 mM final concentration
Fungizone Omega Scientific FG-70 2.5 µg/ml final concentration
Penicillin Streptomycin Omega Scientific PS-20 100 U/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin final concentration
Gentamicin Life Technologies 15750-060 50 ng/ml final concentration
MTT Life Technologies M6494 prepared to 5 mg/ml in PBS and sterile filtered, 1 mg/ml in well
SDS Fisher BP166 for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01 M HCl, 5% in well
HCl Fisher A144SI-212 for MTT lysis buffer, prepared to 0.01 M with SDS, 5 mM in well
Calcein AM Life Technologies C1430 1 mM in DMSO stock, 2 µM in PBS staining solution, 1 µM in well
Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail  Pierce ThermoScientific 78420 1:100 ratio in MPER 
Halt's Protein Protease Inhibitor  Pierce ThermoScientific 87786 1:100 ratio in MPER
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) Pierce ThermoScientific PI78501
Trypan Blue Pierce ThermoScientific 15250-061
DMSO Fisher BP231 for dissolution of calcein AM & compounds
Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg Lonza 17-517Q diluted to 1x with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture)
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg Corning Cellgro Mediatech 20-030-CV diluted to 1x with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash)
10% Neutral Buffered Formalin Protocol 032-060
Trypan Blue Pierce ThermoScientific 15250-061
High Density Hubiogel Vivo Biosciences HDHG-5
Halt's Protein Phosphatase Inhibitor Pierce 78420
Halt's Protein Protease Inhibitor Pierce 87786
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) Thermo Scientific 78501
Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip PamGene 86312
PTK kinase buffer PamGene 36000 300 µl 10x PK buffer stock in 2.7 ml dH2O, catalog number for PTK reagent kit
ATP PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
PY20- FITC-conjugated antibody PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
PTK Additive PamGene 32114
PTK-MM1 tube (10x BSA) PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip PamGene 87102
STK kinase buffer PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
FITC-conjugated Secondary Antibody PamGene 32203
STK-MM1 tube (100x BSA) PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
STK Antibody Buffer PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
Equipment
#11 Blades, sterile Fisher 3120030
#3 scalpel handles, sterile Fisher 08-913-5
100 mm glass Petri dishes Fisher 08-748D
Semicurved forceps Fisher 12-460-318
Trypsinizing flask Fisher 10-042-12B
Magnetic stirrer Fisher 14-490-200
3/4" stir bar Fisher 14-512-125
B-D cell strainer  Fisher #352340
B-D 50 ml Centrifuge tube Fisher #352098
PamStation 12 PamGene
BioNavigator 6.0 kinomic analysis software  PamGene
Evolve Kinase Assay Software PamGene
UpKin App software (upstream kinase prediction) PamGene
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Rotary Cell Culture System (RCCS) Synthecon RCCS-D with 10 ml disposable HARV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64, (6), 479-489 (2005).
  2. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359, (5), 492-507 (2008).
  3. Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10, (75), (2012).
  4. Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15, (5), 302-310 (2015).
  5. Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5, (10), 782-792 (2004).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17, (1), 98-110 (2010).
  7. De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27, (14), 2091-2096 (2008).
  8. Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16, (3), 545-554 (2012).
  9. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424, (6951), 870-872 (2003).
  10. Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20, (4), 314-327 (2014).
  11. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, (10), 839-845 (2007).
  12. Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4, (7), 518-524 (2005).
  13. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20, (1), 45-53 (1999).
  14. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10, (9), 1886-1890 (2010).
  15. Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3, (5), 315-321 (1990).
  16. Uab Research Foundation. Biologically active native biomatrix composition. US patent. Siegal, G. P., Singh, R., Foundation, T. U. R. 7727550 B2 (2010).
  17. Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12, (7), 2264-2271 (2006).
  18. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
  19. Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111, (3), 468-474 (2014).
  20. Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9, (12), 116388 (2014).
  21. Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103, (3), 380-387 (2012).
  22. Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10, (9), 0139267 (2015).
  23. Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
  24. Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3, (10), 1124-1136 (2012).
  25. Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6, (8), 948-952 (2015).
  26. Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33, (17), 4353-4361 (2012).
  27. Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34, (30), 7408-7417 (2013).
  28. Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
  29. Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25, (4), 273-280 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics