Geração de Microtumors Usando 3D Biogel Humano Sistema de Cultura e células de glioblastoma derivado do paciente para Kinomic Profiling e Testes resposta à droga

Medicine

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Gilbert, A. N., Shevin, R. S., Anderson, J. C., Langford, C. P., Eustace, N., Gillespie, G. Y., Singh, R., Willey, C. D. Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing. J. Vis. Exp. (112), e54026, doi:10.3791/54026 (2016).

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Abstract

Introduction

Os tumores cerebrais primários mais comuns intracranianas malignos são astrocitomas grau III e grau IV glioblastoma multiforme (glioblastoma ou GBM). Estes tumores oferecer prognósticos pobres com sobrevida de um ano médio entre 12 - 15 meses, com terapias atuais para GBM no 1-3 EUA. multimodalidade terapias incluem cirurgia, radiação, e quimioterapia, incluindo temozolomida (TMZ) e agentes alvo-quinase. sinalização cinase é frequentemente desreguladas na MBG, incluindo subconjuntos de tumores com amplificação ou mutações de activação do Factor de Crescimento Epidérmico receptor (EGFR), os aumentos no Crescimento Derivado de Plaquetas do Receptor do Factor (PDGFR) de sinalização, o aumento da fosfatidil-inositol-3-quinase (PI3K) e tumor angiogénico apoio sinalização através do factor de Crescimento endotelial Vascular receptor (VEGFR), bem como outras vias de cinase orientada 4-6. Current in vitro e em modelos in vivo freqüentemente perdem estas alterações representativos <sup> 7. Além disso, a caracterização genética não ofereceu os benefícios esperados que podem refletir o fato de que as alterações genéticas e epigenéticas nem sempre prever as mudanças no nível de atividade da proteína, onde a maioria das quinase agentes visando atuar diretamente, e onde terapias com outros mecanismos de ação pode agir indiretamente.

A linha de células imortalizadas tradicional que pode ser várias passagens ad infinitum tem sido o padrão para testes de drogas devido à sua facilidade de manutenção e reprodutibilidade. No entanto, este modelo sofre de um ambiente de crescimento alta de nutrientes (e artificial) que seleciona para as células que diferem muito do tumor original crescendo rapidamente. Como tal, tem havido um interesse considerável no desenvolvimento de sistemas modelo mais realistas que reflectem um sistema biológico do tumor mais complexo como está presente no paciente. xenoenxertos de tumor desenvolvido directamente a partir de um tumor primário crescido em ratos ( "xenoline," xenoenxerto derivado do paciente ou PDX) provide um sistema modelo mais reflexivo, particularmente no contexto de cancro terapêutica, como eles são sentidos para prever de forma mais confiável de sucesso clínico. 8 Apesar da biologia mais reflexivo, esses modelos são caros e são difíceis de estabelecer e manter. Além disso, eles não são passíveis de estudos de alta produtividade. A necessidade de melhor desenvolver modelos biológicos que refletem com mais precisão as alterações moleculares nos tumores primários, e ao perfil e testar esses modelos utilizando medidas diretas de atividade quinase, não substituto marcadores genéticos, é claro.

É bem reconhecido que ao contrário de duas dimensões (2D) culturas em monocamada, 3D ou modelos de ensaio multicelulares pode fornecer mais fisiologicamente relevantes terminais 9-11. cultura 3D abordagens comuns envolvem microve�ulos revestido de matriz e formação esferóide celular. esferóides de tumor pode ser gerado através da agregação celular utilizando balão giratório, placa pHEMA e pendurando técnicas de gota. Limitações para tabordagens stas incluem: incapacidade de algumas células para formar esferóides estáveis, a variabilidade no crescimento e desafios com mistura de tipos celulares. Em alternativa, muitos sintético (hidrogel, polímero) e animal derivada de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matriz de sarcomas de rato, o colagénio de bovino) matrizes têm sido desenvolvidos para a cultura 3D estuda 12-14. Matriz de rato EHS é extensivamente utilizado, mas conhecido para promover o crescimento e a diferenciação celular in vitro e in vivo 15.

A fim de replicar a biologia do tumor 3D, um sistema de biomatriz humano foi desenvolvido pelo Dr. Raj Singh et ai. 16. O biogel humana livre de fator natural, permite o crescimento de cultura de andaimes 3D (esferas, discos), que suportam o cultivo de longo prazo de vários tipos de células. Uma série de projetos 3D cultura Biogel humana são estabelecidos para estudar o crescimento do tumor, aderência, angiogênese e invasão propriedades. Vantagens e propriedades de Biogel humano quando comparado com comumgéis EHS rato estão resumidas na Tabela 1 e Tabela 2.

Fonte: Âmnions Humano (tecido em pool)
livre de patógenos, o IRB-exempt / aprovado
Natureza ECM: Não desnaturada Biogel (GLP-produção)
Chave
componentes:
Col-I (38%), a laminina (22%), Cl-IV (20%), COL-III (7%), entactina HSPG & (<3%)
-GF livre: Indetectável EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-angiogênico, não-tóxico)

Tabela 1: Propriedades de Biogel Humano, em comparação com comuns EHS Gel.

Biogel humana géis EHS
matriz natural do ser humano matriz do mouse reconstituído
crescimento e diferenciação celular controlada Pode promover o crescimento e diferenciação celular
a expressão do gene fisiológica a expressão do gene variável
3D tecido-como modelo de cultura modelo de cultura à base de chapa

Tabela 2: Vantagens de Biogel Humano, em comparação com comuns EHS Gel.

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Protocol

NOTA: Todas as avaliações de terapia de xenotransplante foram feitas usando um modelo de tumor ortotópico de glioblastoma em um protocolo aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal.

1. Isolamento de células derivadas de GBM xenoenxertos de doentes

  1. Preparação dos Reagentes
    1. Re-constituem colagenase-I em água estéril até uma concentração de 5 mg / ml e de filtro estéril. Armazenar em alíquotas de 1 ml a -20 ° C (concentração final é de 50 ug / ml em 100 ml de solução enzimática).
    2. Dissolve-se 100 ug Fator de Crescimento Epidérmico (EGF) em 2 mL estéril tamponada com fosfato salino (PBS). Armazenar em 100 ul (5 ug / 100 ul) alíquotas a -20 ° C para uma concentração final de 10 ng / ml.
    3. Dissolve-se 100 ug de FGF-β em 2 ml de PBS estéril. Armazenar em 100 ul (5 ug / 100 ul) alíquotas a -20 ° C para uma concentração final de 10 ng / ml.
    4. Adicionar a garrafa seguinte a um 500 ml de Neurobasal MedIA (NBM) para preparar completa NBM: 10 ml de B-27 sem suplemento de vitamina A, 5 ml de suplemento de N2, com 100 ul de EGF, 100 ul de factor de crescimento fibroblástico (FGF) -Basic, 5 mL de anfotericina B, 0,5 ml de gentamicina, 5 ml L-glutamina.
    5. Preparar a solução de enzima fresca através da combinação de: 98,5 ml de PBS, 1 ml de colagenase-1, 0,5 ml de 10x de tripsina / EDTA e esterilizar por filtração através de filtro de poro de 0,22 um.
    6. Preparar ou obter um pequeno volume estéril de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) / meio de cultura celular F12 com soro fetal bovino a 7% (FBS) e 1x PBS sem cálcio ou magnésio.
  2. Desagregação do tumor
    NOTA: rato nu / nu atímicos previamente injectados com células de tumor no flanco direito e deixou-se a partir de uma massa de tumor palpável é necessário para este procedimento. Nos exemplos mostrados aqui, usamos xenotransplante de células GBM derivado do paciente, JX10 e JX12 17.
    1. Esterilizar área de trabalho por pulverização clorexidina 2% e configurar sagacidade área de trabalhoinstrumentos necessários h / fontes incluindo mandril descartável, fórceps, bisturi, uma placa de Petri de vidro, a solução de enzima, PBS, e clorexidina (Ver Figura 2a).
    2. Euthanize rato / camundongos portadores de um tumor no flanco. Alvo para uma taxa de deslocamento / min 20% de CO 2 utilizando 30% de CO 2. Após o rato mostra paragem respiratória, manter o fluxo de CO 2 durante cerca de 1 min (normalmente de 3 minutos no total). Os ratos são removidos da câmara e deslocamento cervical é realizada como uma confirmação eutanásia secundário. Pulverizar o animal com 3% de clorexidina para higienizar a pele.
    3. Enquanto segura o mouse constante, fazer incisão na pele semi-circular ~ 1,5 cm de massa tumoral (flanco implantado tumor) utilizando um bisturi estéril descartável com lâmina # 11 começando cranial à massa tumoral e incisão em direção à barriga do rato e ao redor à extremidade caudal.
    4. Reflita pele sobre a massa tumoral usando os dedos com tração suave na extremidade caudal da incisão e, em seguida, empurrar na pelesuperfície para elevar tumor ter melhor acesso sem tocar o tumor (ver Figura 2B).
    5. Use dissecção romba com uma pinça para gentilmente massa tumoral livre da parede peritoneal e da pele (ver Figura 2C).
    6. massa tumoral de transferência com uma pinça para placa de Petri de vidro estéril (não utilize pratos de plástico para evitar a quebra durante a picagem) e descartar corretamente carcaça e colocar estes instrumentos de lado.
    7. Use novo conjunto de instrumentos esterilizados (bisturi com # 11 lâmina, pinça semi-curvo) para debridar tecido tumoral de tecido necrosado e anfitrião membranoso tumor cobrindo tecido conjuntivo.
    8. Coloque solução de 15 ml de enzima em uma ventilada trypsinizing-frasco estéril com barra de agitação e começar a agitar lentamente no capô.
    9. Num prato de Petri de vidro esterilizada, lavar tumores colhidos 3 - 5 vezes com PBS estéril para remover o excesso de sangue (possa derramar ou utilizar a seringa para lavá-los com o PBS). Incline ligeiramente prato e pipeta ou aspirar o material de lavagem. mince finely usando duas lâminas de bisturi # 11 (veja a Figura 2D).
    10. Adicionar 14 ml de solução de enzima para tumor picada e pipeta suavemente para cima e para baixo 2 - 3 vezes. Transfira a mistura para ventilada trypsinizing balão e agitar lentamente durante 20 min. Prepare 5 tubos cónicos de 50 ml por adição de 1,5 ml de FBS a cada um, a fim de neutralizar a tripsina no passo 1.2.11.
    11. Após 20 min, recolher 14 ml de solução de células da garrafa trypsinizing e adicionar a um tubo com FBS. Adicionar solução de enzima 14 ml fresco no balão e continuar agitação.
    12. Centrifugar as células recolhidas a 150 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante. Adicionar 45 ml de completa NBM ao sedimento, misture delicadamente, e repetir a centrifugação para enxaguar a soro. Re-suspender sedimento em 5 ml NBM completa e mantenha em gelo.
    13. etapas de colheita de células repita para um total de 5 colheitas, combinando todas as células colhidas em um único tubo cônico no gelo.
    14. Coloque um filtro celular de 40 um sobre a parte superior de um tubo de 50 ml. Prep tele célula filtro pela passagem de 10 ml de DMEM / F12 + 7% de FBS e, em seguida, por meio de lavagem com 10 ml de PBS.
    15. Adiciona-se lentamente a suspensão de células de filtro, permitindo que a escorrer através (Ver Figura 2M). Levante cuidadosamente a aba do filtro de células entre cada adição nova para quebrar qualquer vácuo e permitir que as células suspensas para passar livremente (veja a Figura 2 N).
    16. Centrifugar a suspensão de células filtrada como anteriormente. Re-suspender em 10 ml completa NBM e contar para determinar o número total de células viáveis ​​utilizando 0,04% de azul de tripano e um hemocitómetro. células no gelo segure até que a geração microtumor.

2. Tissue Alternate Desagregação Protocolo

  1. Automated Dissociator tecido e o sistema de desagregação.
    1. Coloque o tubo de desagregação no Dissociator celular, selecione a opção "Tumor _02_02" programa e começar a pressionar e correr para 32 seg. tubo de transferência para rotador, coloque em 37 ° C incubadora por 40 min.
    2. Centrifugar as células suspensas-a 150 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante. Enquanto centrifugação das células, os reagentes acima definido para o tratamento da suspensão de células. Adicionar 10 ml NBM sem soro e suspensão suavemente triturado.
    3. Após centrifugação, obter um pellet de células contendo ~ 10 - 30 x 10 6 células viáveis ​​(~ 0,3 mL). Re-suspendeu o sedimento em 10 ml de NBM isento de soro (Ver Figura 2O). Determine as células viáveis ​​por ensaio de exclusão (veja o passo 3.2.2).

3. Microtumor Generation

  1. Preparação dos Reagentes
    1. Prepare completa NBM como em 1.1.4 e preparar neutralizado Alta Densidade Biogel humana (HuBiogel) (HDHG a 3 mg / ml) por protocolo interno. Biogel matrizes similares podem ser usadas também.
  2. Microtumor Produção e Cultura
    1. Obter células PDX recentemente dissociados como a suspensão de célula única em completa NBM, em gelo.
    2. Misture a célula suspension com um volume igual de solução de azul de tripano (0,4% em PBS) e analisar usando hemacitómetro para determinar o número de células e a viabilidade por exclusão com azul de tripano 18. Retirar o volume necessário para gerar 50.000 células / microtumor onde o volume = (50.000 células / * # tumor tumores) / (contagem de células viáveis ​​/ 1 ml) e colocar num tubo cónico de fresco.
    3. Concentra-se as células por centrifugação a 150 xg, durante 8 minutos, à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células com solução HDHG gelada num rácio final de 1 parte em células de FBS e 4 partes HDHG.
    4. Usar uma pipeta de canais múltiplos electrónico para dispensar 10 ul por mistura pino célula-HDHG sobre uma placa de aço com 96 pinos (com revestimento hidrofóbico) para gerar microtumors (2 mm grânulos cada um contendo 50.000 células).
    5. Coloque grânulos tumorais 3d dentro incubador de cultura de tecido (37 ° C, 5% de CO2, humidificada) durante 15 minutos para gelificar os grânulos.
    6. Depois de a gelificação, transferir os microtumors (10 μ; L) para uma câmara de cultura de suspensão por encomenda (50 ml) ou prato grande volume de cultura (10 cm) contendo completa NBM utilizando a pipeta multi-canal electrónico e personalizado pino do dispositivo.
    7. Depois de 1 - 2 dias em cultura de tecidos incubadora, transferir microtumors para placas de cultura de 96-poços contendo / poço usando uma de boca larga distribuição de pipeta e executar vários protocolos de ensaio e de análise de 50 ul de NBM.
  3. Tratamento de Drogas e Manutenção de microtumors
    1. Selecione concentrações finais para testes de drogas.
      NOTA: Se a droga tem eficácia conhecida em cultura 2D, 2x seleccione o IC50 como a concentração de dose média e seleccionar três diluições em série acima e abaixo por um total de 5 doses. Por exemplo, se o IC 50 é de 9 pM para o fármaco em cultura 2D, seleccionar 2 uM, 6 uM, 18 uM, 54 uM e 162 uM concentração final como para o teste de droga.
    2. Preparar a solução de dosagem de drogas 2x em completa NBM de sulfoxi dimetilde (DMSO) de ações. Diluir solução de dosagem em meio DMSO a 1% para preparar uma dose de 5, 3 vezes diluições em série.
    3. Adicionar 50 ul de solução de dosagem para a microtumor poços contendo 50 uL em placas de ensaio para atingir uma concentração final de DMSO de 0,5%. Repita o procedimento para cada repetição (por exemplo, 4) em cada dose do medicamento determinado em 3.3.1.
    4. Manter em culturas de 37 ° C, 5% de CO2, humidificada de cultura de tecidos incubadora de 1 - 14 dias. culturas de alimentação duas vezes por semana, renovando meios de comunicação e solução de droga como acima.

4. Análise morfológica e fenotípica de Microtumors

  1. Determinar a morfologia das células na microtumors utilizando coloração de células vivo padrão.
    1. Prepare Estoque 1 mM de calceína-AM em DMSO. Alíquotas e armazenar a -20 ° C.
    2. Em intervalos de cultura desejadas (1, 7, e 14 dias), adicionar solução de Calceina-AM preparado em PBS (sem Ca / Mg) para placa de 96 poços durante 1 uM de concentração final.
    3. Incubar20 minutos num banho a 37 ° C, 5% de CO2, incubadora humidificada, e imagem usando um microscópio de fluorescência a 2X, 4X, e 10X (excitação: 450-490 nm passa-banda, emissão: 515 nm passe longo, dicróico de 500 nm) .
  2. Crescimento Microtumor / ensaio de proliferação
    1. Dissolve-se pó de MTT em PBS (sem Ca / Mg) para preparar estoque de 12 mM. filtro estéril, alíquota, e armazenar a -20 ° C.
    2. Em intervalos desejados de cultura (1, 7, e 14 dias), adicionar 20 ul de solução de MTT a placa de 96 poços em 100 ul de volume de cultura. Incubar 2 h numa incubadora de cultura de tecidos.
    3. Preparar a solução de lise fresca de SDS a 10% em HCl 0,01 M e adicionar valor igual ao volume de cultura de placas. Incubar as placas selado durante a noite em 37 ° C incubadora.
    4. Ler a absorvância a 570 nm utilizando um leitor de lamelas.
  3. Microtumor preparação para a análise Kinomic
    1. Preparar tampão de lise por pré-refrigeração a 4 ° C e em seguida adicionando uma proporção de 1: 100 de cada Pro 100xtein Fosfatase Inibidor (PPI) e 100x Proteína Inibidor de Protease (PI). Misture bem e manter em gelo.
    2. Transferência microtumors 2 para cada um dos três 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Remover o sobrenadante e adicionar 40 ul de tampão de lise contendo PPI e PI a cada tubo e lise durante 30 min a 4 ° C.
    3. amostras de pipetas vigorosamente para quebrar os grânulos tumorais. Centrifuga-se a 16000 xg durante 10 min a 4 ° C As amostras e armazenar a -80 ° C até à análise kinomic.

5. Kinomic Profiling de Microtumors

  1. A proteína de tirosina-quinase (PTK) perfilamento
    1. Reagentes de descongelamento (10x proteína cinase (PK) de tampão e 2% de albumina de soro bovino (BSA)) a 4 ° tampão C Carga PK (300 ul de estoque de tampão 10x PK em 2,7 ml de dH2O) para a seringa na posição # 2 sobre a caracterização plataforma.
    2. Abra o programa de software de ensaio de cinase e carregar o arquivo protocolo de PTK e pressione "Iniciar", anotando amostras dentro softwsão programa depois de chips de digitalização. Colocar fichas na plataforma de perfis e de carga 25 ul de 2% albumina sérica bovina (BSA) por matriz e pressione LOAD para iniciar o protocolo controlado por software de bloqueio etapa.
    3. Dilui-se 6 uM de estoque de 100 mM de ATP, com 54 uL de dH2O para fazer 10 mM de trifosfato de adenosina (ATP). Quando o software começa o e etapa de lavagem final (visível na tela) trazem 15 ug de lisado trouxe até 28 ul com dH2O, misturar e adicionar à matriz.
    4. Prepare PTK mix master (MM) (para até 12 amostras). Adicionar 32,6 uL de dH2O para reconstituir ditiotreitol (DTT) e adiciona-se 6 ul de DTT, e 60 ul de solução 10x PK, para o tubo de PTK-MM1 (já contém 60 ul de BSA a 10x).
    5. Espere até prompt de 'Load' no software de ensaio de cinase aparece em seguida, adicione 126 mL de PTK-MM1, aditivo PTK 60 ul e 60 ul 10 mM ATP para MM2 (contém previamente aliquotas anticorpo PY20 FITC 4,5 ul) e misturar.Adicionar 16 ul desta mistura de PTK mestre para cada tubo de amostra e mistura lisado pipeta de 5 vezes.
    6. Certifique-se de tampa de vidro é limpo e, em seguida, adicionar 35 mL de lisado / master mix por matriz, feche a tampa do carrossel, e pressione o botão LOAD.
  2. Serina / treonina quinase (STK) Profiling:
    1. reagentes de descongelamento (10x tampão PK, 10x tampão STK, e 2% de BSA) a 4 ° C. PK tampão de carga (300 ul em 2,7 ml de dH 2 0) para a posição da seringa # 1, 01:10 tampão e STK (300 ul em 2,7 ml de dH 2 0) para a posição da seringa 2 #.
    2. Abra o programa de software de computador de ensaio de cinase e carregar o arquivo de protocolo STK e prima START, anotando amostras dentro do programa depois de chips de digitalização. Colocar fichas na plataforma de perfis e de carga 25 ul de BSA a 2% por matriz e pressione LOAD para começar a etapa de protocolo de bloqueio controlado por software.
    3. Diluir 6 M de ATP 100 mM com 54 mL dH2O Durante final (3º) mix etapa de lavagem2 ug de lisado e trazer até 32,6 ul com dH2O, misturar e adicionar à matriz.
    4. Faça STK mistura principal: Adicionar 70 ul 10x PK ao tubo STK-MM1 (contém 7 ul 100x BSA), e depois adicionar 42 mL de dH2O ao tubo STK-MM1.
    5. Espere até prompt de 'Load' no software de ensaio de cinase, em seguida: Adicionar 18 ul de ATP 10 mM a STK-MM1, e adicionar 9 ul MM1 para cada ligado amostra. Misture bem.
    6. Certifique-se de tampa de vidro é limpo e adicionar 35 ul de lisado / master mix por matriz, feche a tampa do carrossel, e pressionar LOAD.
    7. Durante definitiva (3ª) LAVAGEM adicionar anticorpo secundário 1,05 ul STK-FITC ao tubo DMAB (contém 3,03 ul STK mistura anticorpo primário), adicione 39,6 ul AB Buffer para DMAB, adicione 356,0 mL de dH2O para DMAB, adicionar 30 mL de DMAB para cada matriz, e pressione CARGA .
  3. Análise de Dados 19,20 Kinomic
    1. Abra o software de análise e carregar a imagem Análise App. Secionar pasta de imagens contendo imagens de matriz inteira com código de barras e com carimbo de tempo para os dados PTK ou STK, o número combinado arquivo de layout matriz selecione artigo (86.312 de PTK e 87102 para STK), ea carga gerada anteriormente matriz anotação Arquivo.
    2. Verifique gridding correta de todas as imagens e executar Tempo de Exposição Escala App. Estatisticamente comparar valores log2 transformado exposição / inclinação, e validar com pré-lavagem curvas cinéticas 19-21.
    3. Executar o software de previsão quinase a montante para consultar perfis kinomic alterados entre as condições para cinases a montante 22,23.

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Representative Results

Mostrámos que o sistema de cultura 3D Biogel suporta o crescimento a longo-termo e função de vários tipos de células. Neste projeto colaborativo, xenolines GBM derivado do paciente (PDX) são utilizados para a produção de centenas de microtumors. As células dissociadas (3 x 10 5) ou neuroesferas (40 - 50) foram incluídos em grânulos Biogel (2 mM) e após a gelificação rápida que são cultivadas num biorreactor de costume NB-media preenchido. foram determinados a viabilidade celular (calceína-AM), o perfil de crescimento (MTT), e análise baseada em matriz actividade kinomic. microtumors PDX mantida organização multicelular e viabilidade elevada (> 80%) durante> 3 semanas. Acreditamos que este in vivo -como biologia é devido à manutenção da arquitetura de matriz celular 3D (não é possível com 2D ou cultura esferóide). Observa-se também que os tumores 3D são difíceis de produzir com andaime proteína gelatinosa frágil, possivelmente devido à falta de colagénio I 14. Um esquema de trabalho para microtumor produção utilizando células PDX e sistema de Biogel 3D é resumido na Figura 1 e o processo de dissociação é representado na Figura 2.

Através da imagem de células vivas através de calceína-AM, determinou-se o crescimento e viabilidade celular, assim como os efeitos de drogas sobre as células derivadas do GBM PDX JX10 tumor, tal como indicado por uma diminuição da fluorescência, a sinalização da morte celular. O crescimento do tumor foi medido no dia 0, 7 e 14 para microtumors exibindo um crescimento contínuo como mostrado na Figura 3A. Este microtumor, JX10, é conhecido por ser resistente à TMZ. Quando expostas a 1 - 10 ^ M TMZ, supressão do crescimento mínima foi observado (Figura 3B). No entanto, o teste de tumor PDX JX12, que é conhecido por ser sensível à TMZ, demonstrou sensibilidade pelo ensaio MTT em 14 dias que foi confirmado por calceína-AM imagiologia (Figura 4).

er.within-page = "1"> A fim de explorar potenciais mecanismos de resistência aos medicamentos, medimos a sinalização da quinase nas microtumors resistentes TMZ (JX10). perfis Kinomic para 144 tirosina e 144 serina / treonina alvos fosfopeptídeo foram capturados em DMSO e 10 mM TMZ tratada microtumors. intensidade fosforilação Kinomic para todos os alvos de péptidos, por ciclo, e por vários tempos de exposição foi capturado (dados não mostrados). Um representante heatmap exibindo péptidos que tinham alterado significativamente intensidades com 10 uM TMZ tratamento (p <0,05, estudantes teste t não emparelhado) é apresentada na Figura 5A. Perfis Kinomic que foram alteradas em TMZ tratada microtumors JX10 foram analisados ​​utilizando o software de previsão quinase a montante, que identificou quinases SYK, LCK e CTK aumentado em TMZ amostras tratadas em relação ao DMSO (Figura 5B). Análise de serina / treonina-quinase a montante kinome também foi realizado (Figura 5C).

conteúdo "fo: manter-together.within-page =" 1 "> figura 1
Figura 1:. Esquema de trabalho para os tumores GBM Microtumor Produção-PDX são dissociados do hospedeiro murino e as células individuais são incorporados na matriz para formar Biogel microtumors. As análises são então desempenhadas nos microtumors. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2:. A dissociação de células tumorais PDX Os tumores são removidos a partir de ratos hospedeiros e triturada antes de ser misturada com uma solução de enzima (AG). Dissociação é mostrada após 40 min (H). Dissociator célula de tumor é mostrada (I). A trituração em mídia e filtração (JN) é mostrada com um resu finallt de 0,3 ml de sedimento (O) contendo 29,5 x 10 6 células viáveis ​​(P), que formam em esferóides NBM em 24 h (Q). Barra de escala é de 20 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Crescimento de Microtumors JX10 microtumor crescimento medido por densidade óptica (OD) de MTT e imagens representativas ao longo de 14 dias, tanto basal (A), e em resposta a 1-10 uM TMZ tratamento (B).. As imagens são mostradas em uma ampliação de 4X (barra de escala = 500 mm). Desvio padrão indicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4
Figura 4:. Crescimento de Microtumors JX12 microtumor crescimento medido por DO de MTT e imagens representativas ao longo de 14 dias, tanto basal (Dia 1), e em resposta a 0, 1, ou 10 uM tratamento TMZ (barra de escala = 500 pm). Desvio padrão indicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: Perfis Kinomic de TMZ Microtumors Tratada Heatmap de valores integrados-exposição (log2 pistas transformadas (x 100) de 10, 20, 50, 100, e 200 ms valores medianos expor o fundo de menos de sinal) são exibidos para significativamente TMZ-alterado. péptidos alterados (p <0,05). O vermelho indica aumentou, e azul indica diminuiu em relação ao DMSO significa per peptídeo. perfis alterados TMZ foram comparados usando o software de previsão quinase a montante e cinases alteradas. Normalizada Kinase Estatística (NKS) escore> 1,0 e especificidade pontuação> 1.3 (vermelho) são considerados altamente alterados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

As etapas críticas no âmbito do protocolo predominantemente relacionados com microtumor geração, bem como a administração de drogas e de manutenção. Porque as contas microtumor são frágeis e facilmente rasgado, extremo cuidado é necessário em ambas as fases de desenvolvimento de um ensaio e manutenção. Se ocorrer um erro durante qualquer um destes processos, a interpretação experimental pode ser comprometida, causando extensão ou repetição desnecessária dos experimentos ou mesmo exclusão de dados.

Modificações e solução de problemas, especialmente do processo de desenvolvimento microtumor, incluiu a concepção e produção de uma ferramenta personalizada hidrofóbico para o uso de fazer as contas microtumor. Esta ferramenta permite a produção mais rápida e precisa de microtumors. Além disso, pequenas modificações para a manutenção dos microtumors contribuiu para acelerar o processo de mudança de forma de dosagem e as células. Várias destas modificações incluem, mas não se lhes limitando, usando um multicanalpipeta electrónico para remover e substituir o meio das placas de 96 cavidades e pré-mistura de soluções frescas de dosagem de drogas e arranjando as soluções 2x numa placa de 2 ml de 96 poços correspondente.

Principais otimizações para condições de cultura em modelagem 3D inclui determinar as dosagens apropriadas para os compostos de drogas, já que há uma relação pobre entre a modelagem 2D e modelagem 3D. Portanto, diluições em série para estabelecer uma curva de titulação da dose é muitas vezes necessário para mover um sistema modelo 2D para o modelo microtumor 3D.

problemas potenciais a considerar com geração microtumor a partir de células tumorais xenoline colhidas a partir de um camundongo incluem a contaminação bacteriana ou fúngica, disponibilidade irregular de xenolines primários, como propriedades únicas de crescimento em ratos pode produzir diferenças no tempo de colheita e variância em colheitas de células de dissociações separadas. Com cada linha celular, o número de células recebidas, e Wi semelhante, quantas microtumors pode ser produzidovai variar. Como tal, existe uma necessidade de priorizar quais testes são necessários e quais são "opcionais" devem o rendimento microtumor ser insuficiente. limitações potenciais com o perfil kinomic de microtumors incluem a dificuldade na correcção para inerte carregamento material proteico, como amostras são carregadas de forma a corrigir para os níveis de proteína BCA determinada, que pode não distinguem entre proteínas Biogel base (proteínas ECM) e as do componente quinase celular que se destina a ser medido. Medição da massa microtumor bruta via calceína-AM, ou usando uma proteína arrumação como um fator de correção pode atenuar este, apesar de problemas com os níveis de proteína de limpeza em tumores sejam alterados podem confundir isso. Por pouco tempo-curso sinalização experimentos, assumindo igualmente porte (quinase contendo o número de células vivas) e emparelhado tratado e amostras não tratadas, isso é menos de um problema.

Com esta pesquisa, o objetivo é proporcionar uma melhor relação custo-emodelo pré-clínico FICAZ e doença-representante para testes de terapia medicamentosa precisas em comparação com xenotransplantes ortotópicos derivado do paciente, o modelo atual padrão ouro para testes GBM. Nos últimos anos, vários grupos têm tentado modelar o ambiente GBM in vivo para fins de teste de drogas. Alguns grupos simplesmente tentou crescer células tumorais GBM em condições não diferencial para preservar células estaminais ou células GBM, pelo menos, tumor cerebral iniciador (BTIC) 24,25. Estas culturas de neuroesferas tumorsphere ou pode ser usado para o teste de drogas e são susceptíveis superior aos modelos tradicionais. No entanto, uma vez que eles ainda não têm a interação tumor-estroma, que é preservada em nosso modelo microtumor, a abordagem tumorsphere é ainda limitada. Outros grupos tentaram aplicar princípios de engenharia para melhorar os modelos GBM 26-28. Estas abordagens incluem câmaras de fluxo, proteínas ECM variáveis ​​e de células tumorais / misturas de células normais. Embora promissor, quase todos esses reports usaram imortalizadas linhas de células com as ressalvas mencionadas anteriormente. Como tal, acreditamos que o modelo baseado microtumor-PDX descrita aqui é mais clinicamente relevante.

No futuro, o modelo microtumor poderia ser usado como um avatar do tumor verdadeiro ou um sistema de 'probando'. Com o sistema probando, a PDX desenvolvido a partir de um paciente em particular não informar directamente o clínico em relação à terapêutica do paciente específico que, como com o sistema de avatar do tumor. Em vez disso, o tumor de um paciente é "combinados" com um pré-existente, bem caracterizado (ambos molecularmente e fenotipicamente) PDX 29. Na verdade, este modelo poderia servir como um avatar 'go-to' ou residir em uma biblioteca proband como um perfil comparativo. Com avatares tradicionais, o crescimento de células tumorais de um paciente em camundongos em paralelo ao tratamento do paciente não é apenas demorado, uma vez que pode levar vários meses para a passagem primária, mas também caros, como testar vários dterapias tapete em camundongos gerar uma etiqueta de preço esmagadora. Para combater isto, o tumor primário paciente pode ser implantado directamente na matriz de Biogel. Com os microtumors, os resultados podem ser rapidamente gerados e a um custo menor.

Como um modelo proband, os perfis de dados microtumor kinome e resposta à droga pode ser adicionado em um proband 'biblioteca', juntamente com os perfis e dados de 3D ​​anterior modelos in vitro, PDXs existentes, estudos com animais, outros pacientes, etc. Em teoria, as células tumorais do paciente poderia, então, ser 'omically' (genomically, kinomically, transcriptomically, etc.) corresponde a um perfil semelhante microtumor existentes para determinar o tratamento preciso para o melhor resultado possível.

Resumo: Aqui identifica-se que esses modelos microtumor pode ser usado para medir tanto o crescimento fenotípica e pode ser consultado em ambos o nível de actividade de quinase basal e em resposta ao tratamento com medicamentos que podem ser úteiscomo uma ferramenta de translação de mais pesquisa pré-clínica. Desenvolvimento de modelos testáveis ​​válidos precisos e molecularmente para tumores humanos é um imperativo para o desenvolvimento eficaz da droga.

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Acknowledgements

Suportado pelo NIH conceder R21 (PI: C. Willey, CA185712-01), prêmio Tumor SPORE Brain (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) e contrato SBIR (PI: R. Singh, N43CO-2013-00.026).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase-I  Sigma-Aldrich CO130
Trypsin EDTA (10x) Invitrogen 15400-054 
Neurobasal-A Life Technologies 10888-022
N-2 Supplement Life Technologies 17502-048 1x final concentration
B-27 Supplement w/o Vitamin A Life Technologies 12587-010 1x final concentration
Recombinant Human FGF-basic Life Technologies PHG0266 10 ng/ml final concentration
Recombinant Human EGF Life Technologies PGH0315 10 ng/ml final concentration
L-Glutamine Corning Cellgro Mediatech 25-005-CI 2 mM final concentration
Fungizone Omega Scientific FG-70 2.5 µg/ml final concentration
Penicillin Streptomycin Omega Scientific PS-20 100 U/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin final concentration
Gentamicin Life Technologies 15750-060 50 ng/ml final concentration
MTT Life Technologies M6494 prepared to 5 mg/ml in PBS and sterile filtered, 1 mg/ml in well
SDS Fisher BP166 for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01 M HCl, 5% in well
HCl Fisher A144SI-212 for MTT lysis buffer, prepared to 0.01 M with SDS, 5 mM in well
Calcein AM Life Technologies C1430 1 mM in DMSO stock, 2 µM in PBS staining solution, 1 µM in well
Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail  Pierce ThermoScientific 78420 1:100 ratio in MPER 
Halt's Protein Protease Inhibitor  Pierce ThermoScientific 87786 1:100 ratio in MPER
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) Pierce ThermoScientific PI78501
Trypan Blue Pierce ThermoScientific 15250-061
DMSO Fisher BP231 for dissolution of calcein AM & compounds
Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg Lonza 17-517Q diluted to 1x with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture)
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg Corning Cellgro Mediatech 20-030-CV diluted to 1x with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash)
10% Neutral Buffered Formalin Protocol 032-060
Trypan Blue Pierce ThermoScientific 15250-061
High Density Hubiogel Vivo Biosciences HDHG-5
Halt's Protein Phosphatase Inhibitor Pierce 78420
Halt's Protein Protease Inhibitor Pierce 87786
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) Thermo Scientific 78501
Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip PamGene 86312
PTK kinase buffer PamGene 36000 300 µl 10x PK buffer stock in 2.7 ml dH2O, catalog number for PTK reagent kit
ATP PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
PY20- FITC-conjugated antibody PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
PTK Additive PamGene 32114
PTK-MM1 tube (10x BSA) PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip PamGene 87102
STK kinase buffer PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
FITC-conjugated Secondary Antibody PamGene 32203
STK-MM1 tube (100x BSA) PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
STK Antibody Buffer PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
Equipment
#11 Blades, sterile Fisher 3120030
#3 scalpel handles, sterile Fisher 08-913-5
100 mm glass Petri dishes Fisher 08-748D
Semicurved forceps Fisher 12-460-318
Trypsinizing flask Fisher 10-042-12B
Magnetic stirrer Fisher 14-490-200
3/4" stir bar Fisher 14-512-125
B-D cell strainer  Fisher #352340
B-D 50 ml Centrifuge tube Fisher #352098
PamStation 12 PamGene
BioNavigator 6.0 kinomic analysis software  PamGene
Evolve Kinase Assay Software PamGene
UpKin App software (upstream kinase prediction) PamGene
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Rotary Cell Culture System (RCCS) Synthecon RCCS-D with 10 ml disposable HARV

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References

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