Kinomic 프로파일 의약품 응답 테스트를위한 3D 인간의를 Biogel 문화 시스템을 사용 Microtumors 및 환자 유래 아교 모세포종 세포의 생성

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Gilbert, A. N., Shevin, R. S., Anderson, J. C., Langford, C. P., Eustace, N., Gillespie, G. Y., Singh, R., Willey, C. D. Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing. J. Vis. Exp. (112), e54026, doi:10.3791/54026 (2016).

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Abstract

Introduction

가장 일반적인 기본 두개 내 악성 뇌 종양은 등급 III 성상 세포종과 등급 IV의 아교 모세포종의 홍반 (아교 모세포종 또는 GBM)입니다. 미국 1-3 GBM 현재 치료와 15개월 -이 종양은 12 사이의 평균 일 년 생존율 가난한 예후를 제공합니다. Multimodality 치료는 테모 졸로 마이드 (TMZ) 및 키나제 타겟 에이전트를 포함한 수술, 방사선, 화학 요법 등이 있습니다. 키나제 신호는 자주 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR)의 증가 신호 증가 포스파티딜 이노시톨-3 키나아제 (PI3K)과의 증폭과 종양의 하위 집합 또는 활성화 돌연변이를 포함, GBM에서 조절 곤란된다 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR)뿐만 아니라 기타 키나아제 중심 경로를 통해 혈관 신생 4-6 시그널링을 지원 종양. 생체 외생체 내 모델은 자주이 대표 변경을 잃을 현재 <SUP> 7. 또한, 유전 적 프로파일 유전 및 후생 유전 학적 변화는 항상 제 타겟팅 가장 키나아제 직접 작용 단백질 활성의 수준에서의 변화를 예측할 수없고, 동작의 다른 메커니즘 요법 여기서 작용할 수 있다는 사실을 반영 예상 이익을 제공하지 간접적으로.

무한히 계대 수있는 전통적인 불멸화 세포주 긴 인한 유지 및 재현성의 용이성에 약물 시험을위한 표준이었다. 그러나이 모델은 빠르게 원래의 종양에서 크게 차이가 세포 성장을 위해 선택하는 고 영양 (인공) 성장 환경에서 겪고있다. 이와 같이, 환자에 존재하는 등의보다 복잡한 종양 생물학적 시스템을 반영보다 현실적인 모델 시스템을 개발하는데 상당한 관심이 있었다. 종양 이종 이식 생쥐에서 자란 차 종양 ( "xenoline,"환자 유래의 이종 이식 또는 PDX) 있습니다 provi에서 직접 개발이들은보다 확실 임상 적 성공을 예측. 8 이상의 반사 생물학 불구 생각대로 데 특히 암 치료제의 설정에서 더 반사 모델 시스템은, 이러한 모델은 고가이며 수립하고 유지하기 어렵다. 또한, 이들은 높은 처리량 연구 의무가 없다. 필요성이 더 더 정확하게 유전자 마커를 대리하지, 기본 종양에서 분자 변화를 반영하고, 프로파일 및 키나제 활성을 직접 측정을 사용하여 이러한 모델을 테스트 생물학적 모델을 개발하기 위해 분명하다.

이 아니라 2 차원 단층 배양과는 달리, 3 차원 또는 다세포 분석 모델보다 생리 관련 엔드 9-11을 제공 할 수 있다고 인식된다. 일반적인 3D 배양 기질 코팅 미세 전달체 셀 타원체 형성을 수반 접근한다. 종양 타원체는 스피너 플라스크, PHEMA 플레이트를 사용하여 드롭 기술을 걸려 휴대 집계를 통해 생성 할 수 있습니다. t에 대한 제한 사항HESE 방법은 다음과 같습니다 : 일부 세포가 혼합 된 세포 유형으로 안정된 회전 타원체, 변동 성장과 도전을 형성 할 수 없음을. 또한, 많은 합성 (하이드로 겔 폴리머) 및 Engelbreth가-홀름 - 떼 행렬이 3D 문화를 위해 개발 된 마우스 육종에서 (EHS) 행렬, 소 콜라겐)이 12 ~ 14을 연구하는 동물 유래. 마우스 EHS 행렬은 광범위하게 사용되고 있지만, 시험 관내 및 생체 (15)에 세포 증식 및 분화를 촉진하는 것으로 알려져있다.

3D 종양 생물학을 복제하기 위해, 인간 biomatrix 시스템 박사 라즈 싱 등. (16)에 의해 개발되었다. 천연 성장 인자없이 인체를 Biogel 여러 종류의 세포의 장기 배양을 지원 3D 배양 지지체 (비드, 디스크)를 허용한다. 3D 인간의를 Biogel 문화 디자인의 일련의 종양 성장, 접착, 혈관 신생과 침략 속성을 공부 설정됩니다. 장점과 인간의를 Biogel의 특성을 일반에 비해마우스 EHS 겔은 표 1표 2에 요약되어있다.

출처: 인간 Amnions (풀링 조직)
병원체가없는, IRB 면제는 / 승인
ECM 자연 : 비 변성를 Biogel (GLP-생산)

구성 요소 :
COL-I (38 %), 라미닌 (22 %), COL-IV (20 %), COL-III (7 %) 및 ​​Entactin HSPG (<3 %)
GF-무료 : 탐지 EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (비 혈관, 비 독성)

표 1 : 일반 EHS 젤에 비해 인간의 등록 정보를 Biogel.

인간의를 Biogel EHS 젤
자연 인간의 행렬 재구성 마우스 행렬
제어 된 세포 증식 및 분화 세포의 성장 및 분화를 촉진 할 수
생리적 유전자 발현 가변 유전자 발현
3D 조직 같은 문화 모델 플레이트 기반 문화 모델

표 2 : 일반 EHS 젤에 비해 인간를 Biogel 장점.

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Protocol

참고 : 모든 이종 이식 치료 평가는 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 아교 모세포종에 대한 동 소성 종양 모델을 사용하여 수행 하였다.

환자 유래 GBM 이종 이식 세포의 1. 분리

  1. 시약의 제조
    1. 5 ㎎ / ㎖ 멸균 필터의 농도로 멸균 콜라게나 제 I을 다시 구성한다. -20 ℃에서 1 mL의 분취 량의 쇼핑몰 (최종 농도가 100 ㎖의 효소 용액을 50 ㎍ / ㎖의 경우).
    2. 이 용액에 100 μg의 표피 성장 인자 (EGF)에 녹여 멸균 인산 완충 식염수 (PBS). 100 μL (5 μg의 / 100 μL) 10 ng를 / ml의 최종 농도 -20 ° C에서 분취에 보관할 것.
    3. 이 용액에 100 μg의 FGF-β 멸균 PBS를 녹여. 100 μL (5 μg의 / 100 μL) 10 ng를 / ml의 최종 농도 -20 ° C에서 분취에 보관할 것.
    4. 로 Neurobasal 메드의 다음 한 500 ml의 병 추가아이오와 (NBM)이 완료 NBM을 준비하는 10 ML의 B-27 보충 비타민 A하지 않고, 5 ml의 N2 보충, 100 μL의 EGF, 100 ㎕의 섬유 아세포 성장 인자 (FGF) - 기본, 5 ml의 암포 테리 신 B, 0.5 ml의 겐타 마이신, 5 ml의 L 글루타민.
    5. 조합하여 신선한 효소 용액을 제조 하였다 : 98.5 ml의 PBS를 1 ㎖의 콜라게나 제 1, 0.5 ml의 10 배 트립신 / EDTA와 0.22 μm의 기공 필터를 통하여 여과하여 멸균.
    6. 준비하거나 소량의 멸균 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 칼슘 또는 마그네슘이없는 7 % 소 태아 혈청 (FBS), 1X PBS와 함께 / F12 세포 배양 배지를 얻었다.
  2. 종양 세분화
    참고 : 이전에 만져서 알 수있는 종양 덩어리에서에 오른쪽 측면에서 종양 세포를 주입하고 사용할 수있는 무 흉선 뉴 / 뉴 마우스는이 절차가 필요합니다. 여기에 표시된 예에서, 우리는 환자 유래의 이종 이식 GBM 세포, JX10과 JX12 (17)을 사용했다.
    1. 2 % 클로르헥시딘을 분사하여 작업 영역을 소독하고 작업 영역 재치를 설정일회용 척, 핀셋, 메스, 유리 페트리 접시, 효소 용액, PBS 및 클로르헥시딘 (그림 2A 참조)을 포함하여 시간에 필요한 악기 / 공급하고 있습니다.
    2. 플랭크 종양을 품고 마우스 / 쥐를 안락사. 30 %의 이산화탄소를 이용하여 CO2를 20 % / min의 변위 율을 목표. 마우스가 호흡 정지를 표시 한 후, 약 1 분 (일반적으로 3 분 총)에 대한 CO 2 흐름을 유지한다. 마우스를 챔버로부터 제거하고 경부 탈구 보조 안락사 확인으로 수행된다. 피부 소독 3 % 클로르헥시딘과 동물을 분무.
    3. 마우스가 정상 채, 수 있도록 반원형 피부 절개 ~ 종양 질량 두개골 시작하여 주위에 마우스의 뱃속으로 절개와 # 11 블레이드 멸균 일회용 메스를 사용하여 종양 덩어리 (측면 이식 종양)에서 1.5 cm 꼬리 끝.
    4. 절개의 꼬리 끝에 부드러운 견인과 손가락을 사용하여 종양 덩어리를 통해 피부를 반영하고 피부에 밀어종양을 터치하지 않고 최선 액세스 할 수있는 종양을 상승시킬 표면 (그림 2B 참조).
    5. 부드럽게 복막 벽에서 피부에서 무료로 종양 덩어리 (그림 2C 참조) 집게와 무딘 절개를 사용합니다.
    6. 멸균 유리 페트리 접시 제대로 시체를 버리고 옆이 악기를 배치 (닦지 동안 파괴 방지하기 위해 플라스틱 접시를 사용하지 마십시오)에 집게로 전송 종양 덩어리.
    7. 멸균 악기의 새로운 세트를 사용하여 괴사 조직 및 멤브레인 호스트 결합 조직 취재 종양의 종양 조직을 괴사 조직을 제거하기 위해 (# 11 블레이드, 반 곡선 집게와 메스).
    8. 교반 막대와 멸균 배출-trypsinizing 플라스크에 15 ml의 효소 솔루션을 배치하고 후드에서 천천히 저어 준다.
    9. (부어 또는 PBS로 씻어하기 위해 주사기를 사용할 수있다)을 초과 혈액을 제거하고 멸균 PBS로 5 회 - 멸균 유리 페트리 접시에서 수확 종양 3 씻는다. 부드럽게 요리와 피펫을 기울거나 세척 물질을 대기음. 말하다 Finely이 # 11 메스 블레이드를 사용하여 (그림 2D 참조).
    10. 3 회 - 부드럽게 위아래로 다진 종양과 피펫에 2 효소 용액의 14 ML을 추가합니다. 전송 혼합물 플라스크를 trypsinizing 통풍과 20 분 동안 천천히 교반합니다. 단계 1.2.11의 트립신을 중화하기 위해 각 1.5 ML의 FBS를 첨가하여 5 50 ㎖ 원뿔형 튜브를 준비한다.
    11. 20 분 후, trypsinizing 플라스크에서 세포 용액을 14 ml의를 수집하고 FBS 하나의 튜브에 추가 할 수 있습니다. 플라스크 교반을 계속하려면 14 ml의 신선한 효소 솔루션을 추가합니다.
    12. 원심 분리기는 실온에서 8 분 동안 150 XG에 세포를 수집하고 상층 액을 버린다. , 펠렛에 완전한 NBM의 45 ML을 추가 부드럽게 혼합 혈청을 씻어 원심 분리를 반복합니다. 5ml를 완료 NBM의 펠렛을 다시 중단하고 얼음에 개최합니다.
    13. 얼음에 하나의 원뿔 튜브에 수집 된 모든 세포를 결합 5 수확의 총 반복 셀 수확 단계.
    14. 50 ML 원뿔 튜브의 상단에 40 μm의 셀 스트레이너를 놓습니다. 준비 t그는 통해 DMEM / F12 + 7 % FBS 10 ㎖를 통과 한 후 10 ml의 PBS로 세척하여 스트레이너 셀.
    15. 천천히 (그림 2M 참조)를 통해 드립 할 수 있도록 스트레이너에 세포 현탁액을 추가합니다. 부드럽게 모든 진공을 깨고 일시 중단 된 세포가 자유롭게 통과 할 수 있도록 각각의 새로운 추가 사이에 셀 스트레이너의 탭을 들어 올립니다 (그림 2N 참조).
    16. 상기와 같이 필터링 된 세포 현탁액을 원심 분리기. 전체 NBM 10ml에 다시 중단하고 0.04 % 블루 트리 판과 혈구를 사용하여 가능한 세포의 수를 결정하기 위해 계산합니다. microtumor 생성 될 때까지 얼음 세포를 잡습니다.

2. 다른 조직 세분화 프로토콜

  1. 조직 dissociator 및 세분화 시스템 자동화.
    1. 프로그램 "종양 _02_02"를 눌러 시작을 선택하고 32 초 동안 실행, 휴대 dissociator로 세분화 튜브를 놓습니다. 전달 튜브는 40 분 동안 37 ° C의 배양기에서 발생하는 회전기.
    2. 원심 분리기는 실온에서 8 분 동안 150 XG에서 세포를 중단하고 상층 액을 버린다. 세포를 원심 분리하는 동안, 세포 현탁액의 처리 시약을 설정. 10 ml의를 무 혈청 NBM 천천히 씹다 정지를 추가합니다.
    3. 30 × 106 생존 세포 (~ 0.3 ㎖) - 원심 분리 후, ~ 10를 함유하는 세포 펠렛을 얻었다. (도 2O을 참조) 10 mL의 무 혈청 NBM에 펠렛을 재현 탁 -. 제외 분석하여 가능한 세포를 결정한다 (단계 3.2.2 참조).

3. Microtumor 세대

  1. 시약의 제조
    1. 1.1.4에서와 같이 전체 NBM을 준비하고 내부 프로토콜 당 (3 ㎎ / ㎖에서 HDHG) 중화 고밀도 인간의를 Biogel (HuBiogel)를 준비합니다. 유사를 Biogel 행렬이 또한 사용될 수있다.
  2. Microtumor 생산 및 문화
    1. 얼음에 완전한 NBM에서 단일 세포 현탁액 등 갓 해리 PDX 세포를 얻습니다.
    2. 셀 스와 믹스트리 판 블루 용액 (PBS에 0.4 %)과 같은 부피를 가진 spension은 트리 판 블루 배제에 의해 셀 (18)의 수 및 생존력을 결정 hemacytometer를 사용하여 분석한다. 50,000 세포를 생성하는 데 필요한 볼륨 / 제거 microtumor 볼륨 = (50,000 세포 / 종양 * # 종양) / (가능한 셀 / 1 ml의 계산)과 신선한 원뿔 튜브에 배치 할 경우.
    3. 상온에서 8 분 동안, 150 × g으로 원심 분리하여 세포를 농축시켰다. 뜨는을 취소하고 FBS 1 부 세포와 4 부 HDHG의 최종 비율로 얼음처럼 차가운 HDHG 솔루션 세포 펠렛을 resuspend.
    4. microtumors (2mm 비즈 50,000 세포를 포함하는 각)를 생성하기 위해 (소수성 코팅) 96 핀 강판에 핀 세포 HDHG 혼합물 당 ​​10 μl를 분배하는 전자 멀티 채널 피펫을 사용합니다.
    5. 구슬을 겔화 15 분 동안 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C, 가습 5 % CO 2) 내부 3D 종양 구슬을 배치합니다.
    6. 겔화 후 (10 μ를 microtumors를 전송상기 전자 멀티 채널 피펫 및 맞춤 핀 장치를 사용하여 전체 NBM 함유 맞춤 현탁 배양 챔버 (50 ㎖) 또는 대량 배양 접시 (10cm로 l)).
    7. 1 일 이후 - 조직 문화 인큐베이터 2 일 50 μL의 NBM / 웰 피펫을 분배 넓은 입을 사용하여 수행하는 다양한 분석 및 분석 프로토콜을 포함하는 96 웰 배양 플레이트에 microtumors을 전송합니다.
  3. 약물 치료와 microtumors의 유지 보수
    1. 약물 테스트를위한 최종 농도를 선택합니다.
      주 : 약물이 2 차원 배양의 효능을 알고있는 경우, 선택 배의 중간 투여 량 농도가 IC (50)가 위아래 5 도즈 레벨 총 희석액을 3 배 선택한다. 이 IC (50)는 2D 문화의 약 9 μm의 경우 예를 들어, 54 μM, 약물 테스트를위한 최종 농도 162 μM을 2 μM, 6 μM, 18 μM 선택합니다.
    2. 디메틸 sulfoxi에서 완전한 NBM에 2 배 약물 투여 솔루션을 준비드 (DMSO) 주식. 5 도즈 3 배 연속 희석액을 제조 1 % DMSO 매체 투약 용액을 희석.
    3. 0.5 %의 최종 DMSO 농도를 달성하기 위해 웰 분석 플레이트에서의 50 μl를 함유 microtumor에 투여 용액 50 μL를 추가한다. 3.3.1에서 결정된 각 약물의 투여 량에서 각각의 복제 (예를 들어, 4)에 대해 반복합니다.
    4. 37 ° C에서 문화를 유지, 5 % CO 2, 1 가습 조직 문화 인큐베이터 - 십사일. 위와 같이 미디어 및 약액를 새로 고침하여 두 번 매주 피드 문화.

4. 형태 학적 및 Microtumors의 표현형 분석

  1. 표준 라이브 세포 얼룩을 사용하여 microtumors의 세포 형태를 결정합니다.
    1. DMSO에 칼 세인-AM의 1 mM의 주식을 준비합니다. -20 ° C에서 나누어지는 및 저장.
    2. 원하는 배양 간격 (1, 7, 14 일)에서 1 μM의 최종 농도를 96 웰 플레이트 (칼슘 / 마그네슘)없이 PBS에서 제조 된 칼 세인 AM 용액을 추가한다.
    3. 품다2 배, 4 배에서 형광 현미경을 사용하여 37 ° C, 5 % CO 2, 가습 인큐베이터 및 이미지에서 20 분, 그리고 10 배 (여자 : 450-490 나노 미터 대역 통과, 방출 : 515 nm의 긴 패스, 500 nm의 이색) .
  2. Microtumor 성장 / 증식 분석
    1. 12 mM의 주식을 준비하기 위해 (칼슘 / 마그네슘없이) PBS에 MTT 분말을 녹여. -20 ° C에서 살균 필터, 나누어지는 및 저장.
    2. 원하는 배양 간격 (1, 7, 14 일)에서, 100 ㎕의 배양 부피 당 96- 웰 플레이트에 MTT 용액 20 μl를 추가한다. 조직 문화 인큐베이터에서 2 시간을 품어.
    3. 0.01 M HCl을 10 % SDS의 신선한 분해 용액을 준비하고 접시에 배양 볼륨에 동일한 금액을 추가합니다. 하룻밤 37 ° C 배양기에서 밀봉 판을 품어.
    4. 멀티 플레이트 리더를 이용하여 570 nm에서의 흡광도를 참조하십시오.
  3. Kinomic 분석을위한 Microtumor 준비
    1. 프로 100 배 각각 100 비율 : 4 ° C에 미리 차게 한 다음 1을 추가하여 용해 버퍼를 준비TEIN 인산 가수 분해 효소 억제제 (PPI)와 100 배 단백질 프로테아제 억제제 (PI). 잘 혼합하고 얼음에 보관하십시오.
    2. 이전 세 1.5 ml의 microcentrifuge 관의 각 2 microtumors. 상층 액을 제거하고 4 ° C에서 30 분 각 튜브를 Lyse에 PPI와 PI를 포함하는 용해 버퍼의 40 μl를 추가합니다.
    3. 피펫 샘플을 적극적으로 종양 구슬을 깰 수 있습니다. kinomic 분석 할 때까지 -80 ° C에서 4 ° C 저장 샘플에서 10 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기.

Microtumors 5. Kinomic 프로파일

  1. 단백질 티로신 키나제 (PTK) 프로파일
    1. 해동 시약 (10 배 단백질 키나제 (PK) 버퍼 2 % 소 혈청 알부민 (BSA)) 프로파일에 위치 # 2 주사기에 4 ° C로드 PK 버퍼 (300 ㎕의 10 배 PK 버퍼 재고 2.7 ml의 DH 2 O)에 플랫폼.
    2. 소프트웨어 내에서 샘플을 주석, 키나아제 분석 소프트웨어 프로그램을 열고 PTK 프로토콜 파일을 눌러 'START'를로드스캔 칩 후 프로그램입니다. 다음 프로파일 링 플랫폼과 부하 2 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 25 μl의 배열 당 위에 배치 칩 단계를 차단 소프트웨어로 제어 프로토콜을 시작 LOAD를 누릅니다.
    3. 10 mM의 아데노신 삼인산 (ATP)를 만들기 위해 54 μL의 DH 2 O 100 mM의 ATP 주식의 6 μM을 희석. 소프트웨어가 3 및 최종 세척 단계 (화면에 표시)를 시작하면 해물의 15 μg의는 DH 2 O와 28 μL까지 가져 가져 혼합 배열에 추가 할 수 있습니다.
    4. (최대 12 샘플) PTK 마스터 믹스 (MM)를 준비합니다. (이미 60 μl의 10 배 BSA를 포함) (DTT)를 디티 오 트레이 톨을 재구성하고 PTK-MM1 관, 6 μL DTT, 60 ㎕의 10 배 PK 솔루션을 추가하는 32.6 μL의 DH 2 O를 추가합니다.
    5. 다음 126 PTK-MM1의 μL, 60 μL의 PTK 첨가제 등을 추가 나타납니다 키나아제 분석 소프트웨어 '로드'프롬프트 될 때까지 기다립니다 60 μl의 10 mM의 MM2에 ATP (4.5 ㎕를 PY20 FITC 항체를 분주 이전 포함)과 혼합한다.각 샘플 해물 튜브와 피펫 믹스 5 번이 PTK 마스터 믹스 16 μl를 추가합니다.
    6. 커버 유리가 깨끗한 지 확인 후 35 μl의 용 해물 / 배열, 가까운 회전 목마 뚜껑 눌러 LOAD 버튼 당 마스터 믹스를 추가합니다.
  2. 세린 / 트레오닌 키나제 (STK) 프로파일 :
    1. 해동 시약 4 ° C까지 (10 배 PK 버퍼, 10 배 STK 버퍼, 2 %의 BSA). 로드 PK 완충액 주사기 위치 # 1, 1:10 STK 버퍼 주사기 위치 # 2로 (2.7 mL의 DH 2 0 300 μL)로 (2.7 mL의 DH 2 0 300 μL).
    2. 스캔 칩 후 프로그램 내에서 샘플을 주석, 키나아제 분석 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 열고 STK 프로토콜 파일과 보도 START를로드합니다. 프로파일 링 플랫폼과 부하 후 25 어레이 당 2 % BSA의 μL, 소프트웨어 제어 프로토콜 차단 단계를 시작 LOAD를 눌러 상에 배치 칩입니다.
    3. 54 μL의 DH 2 O. 100 mM의 ATP 6 μM 희석 최종 (3 차) 세척 단계 믹스 중해물의 2 μg의 및 DH 2 O와 32.6 μL로 불러, 혼합 배열에 추가 할 수 있습니다.
    4. STK-MM1 튜브에 70 μl의 10 배 PK 추가 (7 ㎕의 100 배 BSA를 포함), 다음 STK-MM1 튜브에 42 μL의 DH 2 O를 추가 STK 마스터 믹스합니다.
    5. 다음 키나아제 분석 소프트웨어 '로드'프롬프트 될 때까지 기다립니다 : STK-MM1 18 μl의 10 mM의 ATP를 추가하고 각 샘플 용 해물 9 μL의 MM1를 추가합니다. 잘 섞다.
    6. 커버 유리가 깨끗한 지 확인하고 35 μl의 용 해물 / 배열, 가까운 회전 목마 뚜껑 눌러 LOAD 당 마스터 믹스를 추가합니다.
    7. 최종 (3 차) 세척 단계 중 (3.03 μl를 STK 차 항체 믹스를 포함) DMAB 관에 1.05 μL의 STK-FITC 차 항체를 추가 DMAB에 39.6 μL AB 버퍼를 추가, 추가 356.0 μL의 DH DMAB 2 O는, 각각의 배열에 DMAB 30 μl를 추가하고 보도 LOAD .
  3. Kinomic 데이터 (19, 20)의 분석
    1. 오픈 분석 소프트웨어 및 이미지 분석 응용 프로그램을로드합니다. 자체[선택] 이미지 PTK 또는 STK 데이터를 선택 문서 번호 일치하는 배열 레이아웃 파일 (STK에 대한 PTK에 대한 86312 및 87102)에 대한 바코드와 타임 스탬프 전체 배열 이미지가 들어있는 폴더 및로드는 이전에 배열 주석 파일을 생성합니다.
    2. 모든 이미지의 정확한 리딩을 확인하고 응용 프로그램을 확장 노출 시간을 실행합니다. 통계적으로 노출 / 경사 LOG2 변환 된 값을 비교하고, 예비 세탁 운동 곡선을 19-21으로 확인합니다.
    3. 상류 키나제 22, 23에 대한 조건 사이의 변경된 kinomic 프로필을 조회 할 수 상류 키나제 예측 소프트웨어를 실행합니다.

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Representative Results

우리는 3D를 Biogel 배양 시스템은 여러 종류의 세포 장기 성장 및 기능을 지원하는 것을 보여준다. 이 공동 프로젝트에서, 환자 유래 GBM의 xenolines (PDX)는 microtumors의 수백을 생산하는 데 사용됩니다. 해리 세포 (3 × 10 5) 또는 neurosphere를 (40-50)는를 Biogel 비즈 (2mm)에 포함 된 빠른 겔화 후 그들은 NB-미디어 작성 사용자 정의 생물 반응기에서 배양한다. 세포 생존 능력 (칼 세인-AM), 성장 프로파일 (MTT), 및 kinomic 활동 배열 기반의 분석은 측정 하였다. PDX의 microtumors은> 삼주에 대한 다세포 조직과 높은 생존 능력 (> 80 %)를 유지했다. 우리는이 생체 -like 생물학은 3D 셀 매트릭스 구조의 유지 보수 (2D 또는 회전 타원체 문화 불가능)로 인해 믿습니다. 또한 3D 종양 가능성으로 인해 콜라겐 I (14)의 부족, 허약 한 젤라틴 단백질 골격으로 생산하기 어려운 것이 관찰된다. 마이크에 대한 작업 계획rotumor PDX 세포 및 3D를 Biogel 시스템을 사용하여 생산은도 1에 요약 및 분리 공정을도 2에 도시되어있다.

세포 사멸 신호 전달, 형광의 감소에 의해 나타낸 바와 같이, 칼 세인 AM을 통해 라이브 세포 이미징을 통해 우리는 세포 성장 및 생존뿐만​​ 아니라 PDX 종양 JX10 유래의 GBM 세포에 대한 약물의 효과를 결정 하였다. 도 3a에 도시 된 바와 같이, 종양 성장은 0 일, 7 및 연속 성장을 표시 microtumors 14에서 측정 하였다. 이 microtumor, JX10는 TMZ에 강한 것으로 알려져있다. (1)에 노출되었을 때 - 10 μM TMZ, 최소한의 성장 억제 (그림 3B)를 기록했다. 그러나 TMZ에 민감한 것으로 알려진 시험 PDX 종양 JX12는 칼 세인 AM 영상 (도 4)에 의해 확인 하였다 십사일에 MTT 분석으로 민감도를 보였다.

약물 내성의 잠재적 인 메커니즘을 탐구하기 위해 er.within 페이지 = "1"> 우리는 TMZ 저항 microtumors (JX10)에 키나제 신호를 측정 하였다. 144 티로신, 144 세린에 대한 Kinomic 프로파일 / 트레오닌 포스 포 대상은 DMSO에 대한 캡처 및 10 μM TMZ는 microtumors을 처리 하였다. 모든 펩티드 타겟 Kinomic 인산화 강도 다중 노출 시간 캡처 한 사이클 당 및 당 (데이터는 보이지 않음). 크게 10 μM TMZ 치료와 강도를 변경했다 펩티드 표시하는 대표 히트 맵 (p <0.05, 짝 학생들 T-테스트)도 5a에 표시됩니다. TMZ로 변경 한 Kinomic 프로필 JX10의 microtumors은 DMSO (도 5b)에 대해 샘플을 TMZ 증가로 SYK, LCK 및 CTK 키나제 식별 상류 키나제 예측 소프트웨어 처리하여 분석 하였다 처리 하였다. 세린 / 트레오닌 키나아제 kinome 상류 분석도 (도 5C)을 수행 하였다.

콘텐츠 "FO : 유지-together.within 페이지 ="1 "> 그림 1
그림 1 :. Microtumor 생산 GBM-PDX 종양에 대한 작업 계획이 쥐의 호스트에서 해리하고, 하나의 세포가 microtumors를 형성하기를 Biogel 매트릭스에 포함됩니다. 분석은 다음 microtumors에서 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. PDX 종양 세포 해리 종양 호스트 마우스로부터 제거하고 효소 용액 (AG)와 혼합하기 전에 다진된다. 해리는 40 분 (H) 후에 표시됩니다. 종양 세포 dissociator은 (I) 도시되어있다. 여과 매체 (JN)에서 연마가 종료 resu 도시되어24 시간 (Q)에 NBM 29.5 × 106 생세포 (P)이 구 상체 형태를 함유하는 0.3 ml의 펠릿 (O)의 LT. 스케일 바는 20 μm의입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 :. 십사일 동안 MTT 대표 이미지의 광학 밀도 (OD)로 측정 Microtumors JX10 microtumor 성장의 성장, basally (A), 및 1-10 μM TMZ 처리 (B)에 응답하여 모두. 이미지는 4 배 확대 (스케일 바 = 500 μm의)에 표시됩니다. 표준 편차 지적했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4
그림 4 :. 십사일 동안 MTT 대표 이미지 OD 측정 Microtumors JX12 microtumor 성장의 성장, 두 basally (1 일), 0, 1, 10 μM TMZ 치료 (스케일 바 = 500 μm의)에 응답. 표준 편차 지적했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : TMZ의 Kinomic 프로필 Microtumors을 치료 히트 맵 노출 통합 값의 (LOG2 변환 슬로프 (× 100) 10, 20, 50, 100, 200 밀리 중간 신호를 뺀 배경 노출 값) 크게 TMZ는-변경 표시됩니다. 변경 펩타이드 (P <0.05). 펩타이드 당 평균 레드가 증가 나타내며, 파란색은 DMSO에 상대적으로 감소를 나타냅니다. TMZ 변경된 정보는 상류 키나제 예측 소프트웨어와 변경 키나제를 사용하여 비교 하​​였다. 정규화 키나제 통계 (NKS) 점수> 1.0와 특이도 점수> 1.3 (빨간색)이 매우 변경 간주됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

프로토콜 내에서 중요한 단계는 주로 생성뿐만 아니라 약물 투여 및 유지 microtumor에 관한 것이다. microtumor 비즈 깨지기 쉽게 찢어 때문에, 극도의주의는 분석 및 유지 보수의 발달 단계에 모두 필요합니다. 에러가 이러한 공정 중 하나가 발생했을 경우, 실험 해석 확장하거나 불필요한 반복 실험 데이터 또는 심지어 배제를 초래 손상 될 수있다.

수정 및 문제 해결, 특히 microtumor 개발 과정은 microtumor 구슬을 사용하는 사용자 소수성 툴의 설계 및 제작을 포함했다. 이 도구는 microtumors의 더 빠르고 정확한 생산이 가능합니다. 또한 microtumors 유지 작은 변형 배지를 바꾸고 세포를 투여하는 과정을 가속화하는 것을 도왔다. 이러한 변형 중 일부는 포함하지만, 다 채널을 이용하여, 이에 한정되지 않은전자 피펫으로 제거하고 96- 웰 플레이트로부터 배지를 대체하는 새로운 약물 투여 용액을 미리 혼합하고, 해당 2 mL를 96- 웰 플레이트에 2 × 용액을 배열.

2D 및 3D 모델링 모델링 사이의 불량한 관계가으로 3D 모델링 배양 조건 최적화 주요 약물 화합물에 대한 적절한 투여 량을 결정하는 단계를 포함한다. 따라서, 일련 희석액 도즈 적정 곡선은 종종 차원 microtumor 모델 차원 모델 시스템의 이동에 필요한 설정한다.

마우스에서 수확 xenoline 종양 세포에서 microtumor 발생으로 고려해야 할 잠재적 인 문제는 마우스에서 독특한 성장 특성이 별도의 dissociations에서 세포 수율에 수확 시간과 분산의 차이를 생산할 수있는 박테리아 또는 곰팡이 오염, 차 xenolines의 일관성 가용성을 포함한다. 각 세포주 수신 된 셀의 개수와 마찬가지로, 얼마나 많은 microtumors 제조 할 수와 WI다를 것이다. 이와 같이, 세이가 요구하고있는 사람이 microtumor 수율이 불충분한다 "선택적"이다되는 우선 할 필요가있다. 시료를 Biogel 기반 단백질 (ECM 단백질)과의 것과 구별되지 않을 수 있습니다 BCA 결정 단백질 수준을 보정하는 방식으로로드로 microtumors의 kinomic 프로파일 잠재적 제한, 불활성 단백질 물질 적재에 대한 보정에 어려움을 포함 의도 세포 키나제 성분을 측정한다. 종양의 가사 단백질 수준 문제는이 혼란 할 수 있습니다 변경되고 있지만, 칼 세인-AM을 통해 총 microtumor 질량의 측정, 또는이를 완화 할 수있는 보정 계수 등의 가사 단백질을 사용. 짧은 시간 코스가 동일한 크기 (살아있는 세포 수를 포함 키나제)를 가정, 실험 신호 및 치료 쌍으로 처리되지 않은 시료의 경우, 이것은 문제가되지 않는다.

이 연구의 목적은 비용-E를 제공하는 것이다동소 환자 유래의 이종 이식에 비해 정확한 약물 치료 테스트 ffective 및 질병 대표 전임상 모델 GBM 테스트에 대한 현재 금 표준 모델. 최근 몇 년 동안, 몇몇 그룹은 약물 테스트 용 생체 GBM 환경을 모델링하기 위해 시도했다. 일부 그룹은 단순히 GBM 줄기 세포를 유지하기 위해 비 분화 상태에서 GBM 종양 세포 성장을 시도하거나 적어도 뇌종양 개시 세포 (BTIC) 24,25있다. 이 tumorsphere 또는 neurosphere 문화 약물 검사에 사용되는 전통적인 모델에 가능성이 우수하다 할 수있다. 그들은 여전히​​ 우리의 microtumor 모델에 보존되어있는 종양 기질 상호 작용이 부족하기 때문에 그러나 tumorsphere의 접근 방식은 여전히​​ 제한된다. 다른 그룹은 GBM 모델 26-28을 개선하기 위해 엔지니어링 원칙을 적용하려고했습니다. 이러한 접근 방식은 흐름 챔버 가변 ECM 단백질 및 종양 세포 / 정상 세포의 혼합물을 포함했다. 이 REPO의 거의 모든 약속하면서RTS는 앞서 언급 한주의 사항과 불후의 세포 라인을 사용했다. 따라서, 우리는 여기에 설명 된 PDX 기반 microtumor 모델보다 임상 적으로 관련이 있다고 생각합니다.

미래에, microtumor 모델은 실제 종양 아바타 또는 'proband'시스템 중 하나로서 사용될 수있다. proband 시스템으로, PDX 직접 종양 아바타 시스템으로서, 특정 환자의 치료에 대한 임상을 알리지 않는 특정 환자에서 개발 하였다. 대신, 환자의 종양은 기존의 잘 특징 (분자 모두와 표현형) PDX 29 "일치"입니다. 사실,이 모델은 '이동 -에'아바타 역할 또는 비교 프로파일로 proband 라이브러리에 상주 할 수 있습니다. 기존 아바타로, 환자의 치료에 평행 마우스에서 환자의 종양 세포의 성장은 디 여러 테스트로서뿐만 아니라 시간이 주 통로 몇 개월이 걸릴 수 있으므로, 소비 할뿐만 아니라 비용이 많이 든다마우스의 양탄자 치료는 압도적 인 가격 태그를 생성합니다. 이것을 방지하기 위해, 차 종양은 환자를 Biogel 매트릭스 내로 직접 주입 될 수있다. microtumors으로 결과를 신속하고 저렴한 비용으로 생성 될 수있다.

proband 모델로, microtumor의 kinome 데이터 프로필 및 약물 반응은 체외 모델에서 이전 3D, 기존 PDXs, 동물 실험, 다른 환자 등의 프로필과 데이터와 함께 '라이브러리'는 proband에 추가 될 수있다. 이론적으로, 환자의 종양 세포는 최상의 결과 정확한 처리를 결정하기 위해 'omically'(genomically, kinomically, transcriptomically 등)과 유사한 기존 microtumor 프로파일에 일치 될 수있다.

요약 : 여기서는 이러한 microtumor 모델 모두 표현형 성장을 측정하는데 사용될 수 있고 모두 기저 키나제 활성 수준에서 유용 할 수있다 약물 치료에 대한 응답으로 질의 될 수 있는지를 식별또한 임상 연구를위한 번역 도구로. 인간의 종양에 대한 정확하고 분자 유효 검증 가능한 모델을 개발하는 것은 효과적인 약물 개발을위한 필수적입니다.

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Acknowledgements

, 뇌 종양 SPORE 상 (PD : GY 길레스피, P20CA 151129-03)과 SBIR 계약 (PI : R. 싱, N43CO-2013-00026) : NIH R21 부여 (C. Willey, CA185712-01 PI)에 의해 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase-I  Sigma-Aldrich CO130
Trypsin EDTA (10x) Invitrogen 15400-054 
Neurobasal-A Life Technologies 10888-022
N-2 Supplement Life Technologies 17502-048 1x final concentration
B-27 Supplement w/o Vitamin A Life Technologies 12587-010 1x final concentration
Recombinant Human FGF-basic Life Technologies PHG0266 10 ng/ml final concentration
Recombinant Human EGF Life Technologies PGH0315 10 ng/ml final concentration
L-Glutamine Corning Cellgro Mediatech 25-005-CI 2 mM final concentration
Fungizone Omega Scientific FG-70 2.5 µg/ml final concentration
Penicillin Streptomycin Omega Scientific PS-20 100 U/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin final concentration
Gentamicin Life Technologies 15750-060 50 ng/ml final concentration
MTT Life Technologies M6494 prepared to 5 mg/ml in PBS and sterile filtered, 1 mg/ml in well
SDS Fisher BP166 for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01 M HCl, 5% in well
HCl Fisher A144SI-212 for MTT lysis buffer, prepared to 0.01 M with SDS, 5 mM in well
Calcein AM Life Technologies C1430 1 mM in DMSO stock, 2 µM in PBS staining solution, 1 µM in well
Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail  Pierce ThermoScientific 78420 1:100 ratio in MPER 
Halt's Protein Protease Inhibitor  Pierce ThermoScientific 87786 1:100 ratio in MPER
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) Pierce ThermoScientific PI78501
Trypan Blue Pierce ThermoScientific 15250-061
DMSO Fisher BP231 for dissolution of calcein AM & compounds
Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg Lonza 17-517Q diluted to 1x with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture)
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg Corning Cellgro Mediatech 20-030-CV diluted to 1x with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash)
10% Neutral Buffered Formalin Protocol 032-060
Trypan Blue Pierce ThermoScientific 15250-061
High Density Hubiogel Vivo Biosciences HDHG-5
Halt's Protein Phosphatase Inhibitor Pierce 78420
Halt's Protein Protease Inhibitor Pierce 87786
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) Thermo Scientific 78501
Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip PamGene 86312
PTK kinase buffer PamGene 36000 300 µl 10x PK buffer stock in 2.7 ml dH2O, catalog number for PTK reagent kit
ATP PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
PY20- FITC-conjugated antibody PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
PTK Additive PamGene 32114
PTK-MM1 tube (10x BSA) PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip PamGene 87102
STK kinase buffer PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
FITC-conjugated Secondary Antibody PamGene 32203
STK-MM1 tube (100x BSA) PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
STK Antibody Buffer PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
Equipment
#11 Blades, sterile Fisher 3120030
#3 scalpel handles, sterile Fisher 08-913-5
100 mm glass Petri dishes Fisher 08-748D
Semicurved forceps Fisher 12-460-318
Trypsinizing flask Fisher 10-042-12B
Magnetic stirrer Fisher 14-490-200
3/4" stir bar Fisher 14-512-125
B-D cell strainer  Fisher #352340
B-D 50 ml Centrifuge tube Fisher #352098
PamStation 12 PamGene
BioNavigator 6.0 kinomic analysis software  PamGene
Evolve Kinase Assay Software PamGene
UpKin App software (upstream kinase prediction) PamGene
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Rotary Cell Culture System (RCCS) Synthecon RCCS-D with 10 ml disposable HARV

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References

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