1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University, 3School of Electrical and Computer Engineering, Cornell University, 4Department of Biomedical Engineering, Duke University

Published 5/18/2016
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Immunology and Infection

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Summary

ここでは、収穫維持、および病原体関連分子パターン(のPAMPs)とリステリア菌でマウス小腸オルガノイドを治療するためのプロトコルが記載されているだけでなく、遺伝子発現やタンパク質のための適切な正規化技術を重視。

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Rothschild, D. E., Srinivasan, T., Aponte-Santiago, L. A., Shen, X., Allen, I. C. The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (111), e54033, doi:10.3791/54033 (2016).

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Abstract

主要腸オルガノイドを大幅粘膜免疫学の分野に影響を与える可能性があり、貴重なモデル系です。しかし、オルガノイド成長特性の複雑さは、研究者のための重要な注意事項を運びます。具体的には、各個々のオルガノイドの成長パターンは非常に可変であり、培養中の上皮細胞の異種集団を作成します。このような警告と、一般的な組織培養の実践は、単にによる細胞構造の複雑さオルガノイドシステムに適用することはできません。いくつかの正規化技術が適用されない限り、カウントし、このような細胞株として個々に分離された細胞のための一般的な細胞数、のみに基づいてメッキオルガノイドのための信頼できる方法はありません。総タンパク質含量に対して正規化が常駐タンパク質マトリックスによる複合体形成されています。分泌されたコンを評価する際に、セル数、形状、および細胞型の点でこれらの特性を考慮しなければなりませんオルガノイド塊からテント。このプロトコルは、文化に簡単な手順の概要を説明し、微生物病原体や病原体関連分子パターン(のPAMPs)と小腸オルガノイドを治療するために生成されています。それはまた、タンパク質の分析は、そのようなチャレンジ後に行われているときに適用されるべき正規化技術を強調する。

Introduction

収穫する能力と文化の一次オルガノイドは、小腸、大腸、膵臓、肝臓および脳のために説明し、組織の生物学1-5のためのより多くの生理学的に代表的な現象の理解に密接エキサイティングな進歩ですされています。小腸オルガノイドの文化とメンテナンスを記述する最初の方法は、佐藤によって報告されたハンスClevers 1の研究室の外に。一次腸上皮細胞のこの方法、収穫培養前には、上皮細胞の成長を維持する上で制限され、無効であることが判明しました。方法は、最終的に混在し、一次線維芽細胞6の成長につながるようなコラゲナーゼおよびディスパーゼなどの酵素、とのインキュベーションを介した組織の解離が含まれていました。これらの条件は、時間は、上皮細胞の培養を維持するに制限されることになります。上皮細胞が起因してアポトーシスを入力しますようのない上皮細胞ニッチに最小限のは、形成するであろう適切な成長因子又は接触の完全性の損失の欠如は、anokis 7と呼ばれます。 3D-オルガノイド培養システムの出現は、持続的な文化1に腸の細胞型のスペクトルを含む培養一次腸細胞への方法を提供してきました。これらの上皮オルガノイドは、それらがいくつかの分化した細胞で構成されていることである細胞株上の利点を有し、より良いそれらはインビボ 8 由来する器官を模倣します。最終的に「皿の中のミニ腸を成長させる」ためのプロセスは、様々な刺激下での腸上皮の応答を評価するための貴重なツールであることが証明されています。これらの分子パターンは、ホストと微生物9の両方からの多様な応答を調節することができるように微生物病原体関連分子パターン(のPAMPs)との一次腸細胞の相互作用を調査することは、免疫学の分野に関連します。研究者らは今、マウスオルガノイドとこれらの相互作用を探るが、彼らすることができますだけでなく、ウェル2のようなヒトから培養することができます。この技術は飛躍的にオーダーメイド医療を変える可能性を持っており、この技術は、近い将来に可能になることを進歩について推測したくなります。

この方法の全体的な目標は、種々の刺激で文化、拡張のためのプロトコル、および腸オルガノイドの治療を提供することにあります。このような刺激は、最終的なワクチン、細菌のPAMP、生きた病原体、胃腸(GI)癌治療の範囲とすることができます。マウスの腸オルガノイドの単離および培養は、佐藤から適応されています元のメソッドから若干のずれがありますが、このプロトコルを以下のとき、オルガノイド培養される最終製品がまだ達成されています。この方法は、セルnに基づいて分析を行う際に考慮されなければならない不均一なセル構造を操作するとき、適切な正規化のための適切な手法を説明に焦点を当てていますアンバー。

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Protocol

すべての研究が承認され、バージニア工科大学IACUCガイドラインで行いました

1.準備R-Spondin1はHEK293T-Rspo1細胞株からの馴化培地

  1. HEK293T-Rspondin1細胞の生成は、先10に記載されています。種子HEK293T-Rspondin1は1×ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)の40ミリリットル+ 10%ウシ胎児血清(とT-175フラスコ内で、約5〜10%の密集度で8×10 5 -1.7×10 6細胞を分泌細胞増殖培地としてFBS)、および37℃+ 5%CO 2でインキュベートします。
    注:HEK293T-Rspondin1分泌細胞用増殖培地は、R-spondin1馴化培地として機能します。 R-spondin1は、あるいは、500 ng / mlでの最終濃度で使用される組換え増殖因子として購入することができます。
  2. 7日間または明視野顕微鏡で測定95%の集密度に達するまでHEK293T-Rspondin1細胞を成長させます。馴化培地の40ミリリットルを収穫し、50に転送mlのコニカルチューブ。 HEK293T-Rspondin1分泌細胞のT-175フラスコを捨てます。
  3. 遠心分離、細胞破片をペレット化し、4℃で10分間、300×gで馴化培地を含むチューブ。上清を収集し、15ミリリットルチューブにR-spondin1馴化培地、およびアリコートと呼ばれます。短期または長期保存のために-80°Cの分注して-20℃で保管。
    注:解凍したら、R-Spondin1は、馴化培地は、1週間4℃まで保存することができます。

2.オルガノイド増殖培地の調製と収穫小腸陰窩のための試薬 

  1. 収穫前に一日、氷上で凍結されたタンパク質マトリックスを配置し、4℃で一晩解凍。暗号収穫のために使用されるハサミ、ピンセットとガラススライドを解剖オートクレーブ。
  2. 翌日、1×DM 40 mlのストック濃度を添加することによって、サプリメント、成長因子を含むオルガノイド増殖培地40 mlで調製する​​ことによって開始しますEM / F-12。メディアサプリメントは含まれています10mMの2- [4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸(HEPES) - 400μlを、1×グルタミンサプリメント- 400μLを、1×B27、ビタミンAなし- 400μlの、1×N2 - 200μlの、1 mM N-アセチルシステイン- 40μlを、100ng / mlのM-ノギン- 40μL、50 ngの/ mlのM-EGF - 37°Cの水浴中で4μlのと場所の使用まで。水浴中で37℃にR-spondin1の15ミリリットルのアリコートを温めます。
  3. インキュベーター中に配置することにより、少なくとも30分間、37°C​​までのウォーム3滅菌24ウェルプレート。 4℃にマウス1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)+ 2mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)とクールあたり50ミリリットルを準備します。 PBSは4°Cに10%FBSとクールを含む1Xマウス当たり100ミリリットルを準備します。

オルガノイド培養1 3.収穫ハツカネズミ小腸陰窩

  1. げっ歯類用の標準食と利用可能な水で育った生後6-12週のオスC57B6 / Jマウスの年齢を生け贄に捧げますアドリブ機関のガイドラインに従いました。頸椎脱臼に続いてCO 2窒息を介して安楽死させます。
    注:組織の収穫まで氷上に死体を維持し、汚染の危険性を最小限にするために、生物学的安全キャビネットの中で組織の収穫を行います。
    注:雄または雌マウスオルガノイドを生成することができます。
  2. (オプション)70%エタノールに浸漬する前に、毛皮を削除するには、マウスを剃ります。 2分間70%エタノールでマウスを沈めると、ボードに触れるマウスの背側でボードを固定に手足をピン。
  3. マウスの腹の部分に正中線切開を作るために予め滅菌解剖ハサミとピンセットを使用してください。首の付け根に頭蓋を進める生殖器での切開を行います。ピンセットで横方向に皮膚切開を開き、腹膜を露出するようにピニングボードに肌をピン。
  4. はさみを解剖して腹部の腹膜における中線切開を行い、第倍腹部臓器を露出させるために、鉗子、横方向とピニングボードにピンと電子の腹膜。
    注:腹部臓器を切断しないように注意してください。
  5. 胃と盲腸に接続された遠位の接合部に接続された小腸の近位の接合部を切断して鉗子とはさみを解剖して腹腔から小腸を取り出します。氷冷1×PBSの10ミリリットルを含む滅菌ペトリ皿で​​小腸を置きます。
  6. 1ミリリットルピペットを用いてPBS 1×氷冷と小腸の内腔内に含まれるコンテンツをフラッシュします。小腸の管腔内の破片が除去されるまで、この手順を繰り返します。
  7. 3-4ほぼ等しい長さのストリップにはさみを解剖して、小腸をカットして、新しい滅菌ペトリ皿に縦方向にストリップを置きます。各ストリップのために、切開に全長Oを作るために、小腸の管腔内解剖ハサミの刃先を挿入ストリップF。横方向に小腸の内腔を露出させるために切開部を開いた折り畳み鉗子を使用してください。
  8. 優しく小腸の管腔表面に絨毛を削り取るために滅菌ガラススライドを使用してください。はさみを解剖1-2センチの長さのストリップに小腸をカットし、10ミリリットルの氷冷1×PBSを含む50ミリリットルコニカルチューブにこれらのストリップを転送します。
  9. 50mLのコニカルチューブを反転させて穏やかに内容物を混合し、組織コンテンツを50mlコニカルチューブの底に沈殿することを可能にします。吸引1X PBS及び氷冷1×PBS 10mlで組織を洗浄することによってこの3回繰り返すこと。で最終洗浄は、PBSおよび小腸組織セグメント1×10ミリリットルを含む10分間氷上でコニカルチューブを残します。
  10. 1×PBSを吸引除去し、1×PBS + 2 mMのEDTAの25ミリリットルを追加します。 4℃で45分間、氷のバケツにロッキングプラットフォーム上に置きます。組織がインキュベートされているが、6 15ミリリットルコニカルチューブラベル「フラクション#1-6を。」
  11. 組織の内容はチューブの底に沈殿することを可能にします。削除し、「画分1」と表示されたチューブ15ミリリットルの円錐形に上清を移します。ステップ(3.11)を5回振っ1×PBS + 10%FBSを繰り返し、適切に標識されたフラクションチューブに順に上清内容を転送。
  12. 5分間、125×gで遠心分離します。 5ミリリットルで上清と再懸濁ペレットを吸引予め温めておいた1×DMEM / F-12、成長因子なしでは追加されました。
  13. 2分間78×gで遠心分離します。吸引し4の上清ミリリットル、残りの培地1mlに各ペレットを再懸濁します。
  14. 各画分から20ミリリットルを削除し、ガラススライドに追加します。光学顕微鏡下で陰窩および破片を視覚化し、最大のPerceのを達成するために、それに応じて組み合わせるとプールするためにどの画分を決定破片比陰窩のntage。
    注:画分2-6は、陰窩の最大の割合をメッキすることが得られます。プールへの画分は、ほとんどの場合、画分4、および小数6を有する画分5を有する画分3です。
  15. 遠心分離の画分を5分間125×gでめっきされます。上清を吸引し、ペレットの上に残りの50から100μLを残します。
  16. チューブを氷上に維持し、プールした画分にタンパク質マトリックスの1ミリリットルを追加します。上下にピペットでゆっくりと気泡の添加を防止します。
  17. 37℃のインキュベーターから予め温めておいた24ウェルプレートを取り外し、各ウェルの中央にタンパク質マトリックス/陰窩サスペンションの50μlを添加します。タンパク質マトリックス降下が凝固できるようにするために10分間37℃のインキュベーターに播種したプレートを転送します。
  18. ウェル当たりR-spondin1馴化培地の先に調製したオルガノイド増殖培地+50μlを450μlのを追加します。 37°C + 5%CO 2で一晩培養します。
  19. R-spondin1エアコンメディ50〜100μlのを追加毎日ウェルあたり。 3日毎に450μlの/ウェルのステップ2.2で説明した新たに調製したオルガノイド増殖培地で全体オルガノイド増殖培地を交換してください。さらに、ウェル当たりR-spondin1馴化培地の50から100μlを添加します。
    注:タンパク質マトリックス降下は1週間その完全性を維持するが、7日後に継代オルガノイドに進みます。

4.継代オルガノイドすべての7 日目

  1. 4°C継代前の日で一晩氷上でタンパク質マトリックスを解凍します。少なくとも30分間、37°C​​までのウォーム1滅菌24ウェルプレート。ステップ2.2で説明したオルガノイド増殖培地を準備し、使用するまで37℃で維持します。
  2. インキュベーターからオルガノイドプレートを取り外し、氷の上でプレートの継代を開始。 3-4ウェルから10ミリリットルピペットで吸引する増殖培地は開始します。
    注:これは次のステップでタンパク質マトリックスの低下を除去するために使用されるように、10ミリリットルのピペットで吸引されたメディアを保管してください。
  3. などで海賊版ウェル、プレートからのタンパク質マトリックスの低下を除去するために、上下にピペット。 10ミリリットルのピペットの先端で穏やかに掻きは、タンパク質マトリックス降下を取り除くのに役立ちます。 15ミリリットルコニカルチューブにコンテンツを転送します。
  4. 4℃で5分間、125×gで10分間遠心氷上で15ミリリットルにコニカルチューブをインキュベートします。コニカルチューブの底に白い沈殿物を観察します。静かに吸引し、ペレットを上記の100から200μLを残しオルガノイドペレットの上に上清/古いオルガノイド成長培地の大部分を捨てます。
  5. 1mlシリンジに取り付けた23ゲージの針を使用してオルガノイド陰窩を破ります。陰窩を解離させるために10〜15回吸引し、取り出します。過度のピペッティングに気泡の形成を最小限に抑えます。
  6. タンパク質マトリックス500μlのオルガノイドを再懸濁し、新しい予め温めておいた24ウェルプレートにウェル当たり50μlを添加します。 R-spondin1の+50μlの先に調製したオルガノイドの増殖培地450μlを添加しますウェルあたり馴化培地。一晩37℃で培養します。

5.めっきオルガノイド遺伝子発現解析のためのPAMPとリステリア菌とパターン認識受容体の刺激のための14日目

  1. L.うち、連勝に挑戦する2日前BHI寒天プレート上にモノサイトゲネス
  2. 翌日L.を選びますコロニーをモノサイトゲネスおよび200 rpmで振とうしながら37℃で一晩BHIブロスの10ミリリットルに成長しています。
  3. 4°Cオルガノイドチャレンジの前日で一晩氷上でタンパク質マトリックスを解凍します。少なくとも30分間、37°C​​までのウォーム1滅菌24ウェルプレート。ステップ2.2で説明したオルガノイド増殖培地を準備し、使用するまで37℃で維持します。
  4. インキュベーターからオルガノイド文化を外し、オルガノイドの継代を開始。
  5. これはタンパク質マトリックスの低下を除去するために使用されるように、3-4ウェルから吸引するメディアとは、10ミリリットルpipeteに吸引されたメディアを保持します。アップピペットプレートからのタンパク質マトリックスの低下を除去するためにダウン。 10ミリリットルのピペットの先端で穏やかに掻きは、タンパク質マトリックス降下を取り除くのに役立ちます。 15ミリリットルコニカルチューブにコンテンツを転送します。
  6. 15ミリリットルを10分間氷上でコニカルチューブをインキュベートします。 4℃で10分間、125×gで遠心分離します。コニカルチューブの底に白い沈殿物を観察します。そっと背後に残留上清の約100μLを残して上清を吸引除去します。
  7. 氷冷1×PBS 5 mlにオルガノイドペレットを再懸濁し、計数のために10μlのアリコートを削除します。ガラスカバースリップせずに血球計数器の中央に10μlのアリコートを追加します。静かにドロップの上にカバーガラスを重ねます。
    注:スライドガラスが最初に削除されていない場合は、血球計数器は、オルガノイドで詰まるます。
  8. /すべてのグリッドに光学顕微鏡を介して、血球計数器のチャンバ全体をオルガノイドの合計数をカウントし、オルガノイド濃度を決定:numは総オルガノイドのBERは10μlのごとにカウント。
  9. オルガノイドの十分な数がアッセイのために播種することを可能にし、10分間、125×gでこの懸濁液を遠心分離します15ミリリットルコニカルチューブから適切なボリュームを削除します。
    注:24ウェルプレートのウェルあたり40-100オルガノイドの間の範囲は、RNA分析のために十分です。典型的なオルガノイドサイズは直径300ミクロン〜1000ミクロンの範囲であることができます。
  10. 上清を吸引し、気泡を発生させることなく、タンパク質マトリックスの500mlにペレットを再懸濁します。 24ウェルプレートにウェルあたりオルガノイド/タンパク質マトリックス懸濁液の50ミリリットルを追加します。
    注:オルガノイドを再懸濁するために使用されるタンパク質マトリックスの量は、処理条件と技術的反復の数によって異なります。
  11. 各ウェルに(N-アセチルシステインなし)オルガノイドの増殖培地500μl加え、1時間、37℃+ 5%CO 2でインキュベートします。
  12. すなわちフラジェリン(のPAMPの2倍の濃度を準備し、リポ多糖)とL.を生きますモノサイトゲネス 。ライブL.のODを測定します計数のためにBHIプレート上のモノサイトゲネスとステーキ。 1×10 6コロニー形成単位(CFU)/ mlでオルガノイドを扱います。
    注:CFUの決意にODを入力して前オルガノイド刺激に評価されるべきである細菌によって異なります。 L. 0.6≈1×10 9 CFU / mlの例については、OD モノサイトゲネスは、だけでなく、実験の独立前に評価されるべきです。
  13. L.の治療ストックから連続希釈アウトストリーク正確に処理CFU / mlと決定するネス 。著者らは、BHI寒天プレート上で100μlの1×10 8希釈が正確なCFU / mlで決定するためにコロニーをカウントするのに十分であることを見つけます。
  14. L.の熱殺した溶液を調製しますライブL.の1ミリリットルのアリコートを取ることによって、 モノサイトゲネス 10分間5000×gでソリューションや遠心分離機をモノサイトゲネス 。上澄み液と洗浄液を吸引1×PBSの1ミリリットルで細菌ペレット。
    1. 遠心分離L. 10分間、5000×gでモノサイトゲネスとは、1×1mlのPBSにペレットを再懸濁しました。熱はL.を殺します1時間80〜90℃で加熱することにより、1.7ミリリットルポリプロピレンチューブでモノサイトゲネス 。文化熱100μlのアリコートは、Lを殺しましたBHI寒天プレート上モノサイトゲネスには生きた細菌が残っていないことを確認します。
    2. ユーザによって決定所定のウェルに500μlの常駐メディアに適切な2×PAMPおよび/または微生物処理500μlのを追加します。 24時間、37℃+ 5%CO 2でインキュベートします。
      注:常駐メディアの500μlに2xのPAMP /微生物処理の500μlのアリコートを追加すると、1ミリリットルの全容量で1Xに処理濃度をもたらすでしょう。
  15. 翌日、手動L.を数えます治療CFU / mlでの正確な決意のためにコロニーをモノサイトゲネス 。処理されたオルガノイドのプレートから培地を吸引し、ウェルトンを洗います1×PBSでHREE回。
  16. フェノール/クロロホルム11または製造者の指示に従ってRNA抽出キットを介してRNA抽出に進んでください。標準定量RT-PCR 12を用いて遺伝子発現を評価します。

6.メッキオルガノイド上清中のタンパク質分析のためのPAMPとL.モノサイトゲネスチャレンジのための14日目

  1. チャレンジ前二日間、のCaco-2細胞の細胞培養、1xのDMEM + 20%FBSを含むT-75フラスコ内≈1×10 6細胞播種密度を開始し、37℃+ 5でのCaco-2細胞をインキュベート%CO 2。 L.の細菌培養を開始BHIプレート上のモノサイトゲネスとは、37℃で細菌インキュベーターでプレートをインキュベートします。
  2. 翌日L.を選びますコロニーをモノサイトゲネス 、37℃で一晩BHIブロス10ml中に成長します。 4°Cオルガノイドチャレンジの前日で一晩氷上でタンパク質マトリックスを解凍します。
  3. 次の日、暖かい1滅菌96ウェル黒色壁少なくとも30分間37℃でプレート。 N-アセチルシステインステップ2.2で説明し、使用するまで37℃で維持することなく、オルガノイド増殖培地を準備します。インキュベーターからオルガノイド文化を外し、オルガノイドの継代を開始。
    注:典型的なオルガノイドサイズは直径300ミクロンミクロン〜1000の範囲であることができます。
  4. これはタンパク質マトリックスの低下を除去するために使用されるように、3-4ウェルから吸引するメディアとは、10ミリリットルpipeteに吸引されたメディアを保持します。プレートからのタンパク質マトリックスの低下を除去するために、ピペットで再懸濁します。 10ミリリットルピペットで穏やかに掻きは、タンパク質マトリックス降下を取り除くのに役立ちます。 15ミリリットルコニカルチューブにコンテンツを転送します。
  5. 15ミリリットルを10分間氷上でコニカルチューブをインキュベートします。 4℃で10分間、125×gで遠心分離します。コニカルチューブの底に白い沈殿物を観察します。そっと背後に残留100μlの上清を残して上清を吸引除去します。
  6. 氷冷の5ミリリットルでオルガノイドペレットを再懸濁1×PBSは、カウントのために10μlのアリコートを削除します。血球計数器の中央に10μlのアリコートを加え、穏やかにカバーガラスを重ねます。
    注:スライドガラスが最初に削除されていない場合は、血球計数器は、オルガノイドで詰まるます。
  7. 血球計数器/チャンバ全体のすべてのグリッドに光学顕微鏡を介しオルガノイドの合計数をカウントし、オルガノイド濃度を決定する:10ミリリットルごとにカウント合計オルガノイドの数を。
  8. オルガノイドの十分な数がアッセイのために播種することを可能にし、10分間、125×gでこの懸濁液を遠心分離します15ミリリットルコニカルチューブから適切なボリュームを削除します。
    注:オルガノイドを再懸濁するために使用されるタンパク質マトリックスの量は、処理条件と技術的反復の量を変化します。著者は、40から100オルガノイドが分泌タンパク質の分析のために十分であることがわかります。
  9. 上清を吸引除去し、生成することなく、タンパク質マトリックスの500μlの中でペレットを/ウェルの再懸濁気泡。
    注:オルガノイドを再懸濁するために使用されるタンパク質マトリックスの量は、処理条件と技術的反復の量を変化します。
  10. ウェルは、標準曲線の生成のためのCaco-2細胞を播種し、これらが機能するように96ウェル黒色壁の組織培養プレート上に空の少なくとも2列にしておきます。予め温めておいた96ウェル黒色壁の組織培養プレートにタンパク質マトリックス+ウェル当たりオルガノイドの懸濁液50μLを加えます。タンパク質マトリックスが凝固することを可能にするために10分間37℃でプレートを保管。
  11. 各ウェルに(N-アセチルシステインなし)オルガノイド増殖培地100μlのを追加し、1時間、37℃+ 5%CO 2でインキュベートします。
  12. PAMPの2倍の濃度を準備し、L.を生きますモノサイトゲネス。ウェル当たり所定の各処理条件の100ミリリットルを加え、24時間インキュベートします。
  13. 翌日プレート標準曲線ウェル中のCaco-2細胞。滅菌1×PBS、0.25%トリプシンおよび1xのDMEM + 20%FBSトンを加温することにより開始O 37℃。
  14. Caco-2細胞を含有するT-75フラスコを除去し、細胞培養培地を吸引します。 10ミリリットル1×PBSで細胞を洗浄。吸引し、1×PBSは、15分間37℃のインキュベーターで2ミリリットル0.25%トリプシンと場所T-75フラスコを追加します。
  15. 次いで、細胞を剥離したCaco-2細胞に1×DMEM + 20%FBSの8ミリリットルを追加し、15ミリリットルコニカルチューブに移す切り離されていることを確認するために、光学顕微鏡下でフラスコを可視化します。 10μlのアリコートを削除し、血球計数器を用いて光学顕微鏡で細胞をカウントします。
    注:60,000細胞/ウェルの上部セル番号はよく機能し、希釈ダウン/ウェル2,500細胞に標準曲線の生成のために行うことができます。
  16. タンパク質マトリックス中のCaco-2細胞を再懸濁し、適切なウェルにウェル当たり50μlを添加します。タンパク質マトリックスはのCaco-2細胞を37℃で固化することを可能にします。
    注:たCaco-2細胞の増殖培地は、タンパク質マトリックスの凝固後に添加する必要はありません。
  17. 以下オルガノイドアッセイのために24時間の処理時間、吸引およびオルガノイド携帯上清メディアを保存し、氷上に保ちます。 1×PBSでウェルを3回洗浄します。各ウェルのCaco-2標準曲線ウェルを含む100%メタノール100μlのを追加し、オルガノイドを修正するために20〜30分間、4℃または氷上でインキュベートします。
    注:彼らはメタノールを直接追加していることができますようにのCaco-2標準曲線ウェルを、1×PBSで洗浄される必要はありません。
  18. メタノールのインキュベーションの後、PBS 1×氷冷でウェルを3回洗浄します。まで1-2週間4℃でプレートを保管してください。
  19. よく、アルミ箔でプレートをカバーし、4℃で一晩インキュベート1mlあたり1μgの/の濃度で核染色色素を追加します。
  20. (それぞれは350nm / 461nm)核染色色素の励起/発光を測定し、それぞれがたCaco-2細胞の標準曲線によくオルガノイド正規化するために96ウェルプレートリーダーを使用してください。
  21. ELISAなどの下流のアッセイ、に進みます

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Representative Results

腸のオルガノイドを育成するには、このプロトコルを、以下の場合には、特徴的な球体状のオルガノイドは、収穫後に存在するであろう。 R-spondin1馴化培地の添加は、毎日オルガノイドの成長と出芽を開始します。オルガノイドの成長は、 1Aに示されている- F、および1日目に、腸オルガノイドの代表、2、4、5、6と14日目、図1Fは、14日目オルガノイドの不均一な成長特性を示しています。

オルガノイドは、適切な数まで増殖させた後、それらを再プレーティングし、種々のPAMPおよび/または微生物で攻撃することができます。発現解析は、標準的な技術によって行うことができます。これは、以下の分析された炎症性サイトカインIL-18、IL-6、およびTNFαのmRNA発現を示している。図2A-Cに示されていますL.殺さ熱でオルガノイドの24時間の挑戦モノサイトゲネスおよびPAMPのフラジェリン。 IL-18 mRNA発現のサイトカインを評価するための理論的根拠、IL-6、およびTNFαは、これらが病原性チャレンジに応答して上皮細胞によって変調されるための良い候補であったが、これらの炎症性サイトカインの調節は、手法の有効性を示すであろうということでした。

図3Aは、 - Cが常駐タンパク質マトリックス中の破片の最小限のバックグラウンド染色で固定以下の核染色染料と腸オルガノイドの相対的な核染色を示しています。固定および染色のこの方法は、各ウェル中の細胞数の違いを占めるようになるアッセイを標準化するために適用することができます。次いで核で固定し、染色し、タンパク質マトリックスに播種したCaco-2細胞の連続希釈液の標準曲線を生成するとき、これは、図4には明らかです染色色素。 100のR 2値は、細胞数との間の直線関係を示し、蛍光強度を意味し、線形方程式は、細胞数にオルガノイドを正規化するために使用することができます。 図4に示された標準曲線は、ウェルあたり30,000細胞を超えて飽和限界に到達するために開始します。ウェル当たり30,000細胞上の細胞の滴定は、核染色色素の飽和領域を含むように、図4に示されています。正規化の精度向上が飽和限界に達する前に、核染色色素の線形範囲を反映する細胞数を用いて得られます。

図1
図1:単離した後、マウス小腸由来のオルガノイドの成長の小腸オルガノイド成長時間経過。 (A)1日目(B)2日目(C)4日目(D)5日目(E)6日目(F)14日目の画像の各指定日のオルガノイド成長の代表的なものです。スケールバー1000ミクロンと200ミクロンに等しく、B、C、D、およびEスケールバーは、A、B、C、D、およびEスケールバーの右側の画像では100μmに等しいAの左画像200ミクロンに等しいですFのための左右の画像のために、それぞれ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
2:。。24時間PAMPチャレンジに続いて炎症性サイトカインのmRNA発現 リステリア菌を殺したのPAMPと熱で24時間チャレンジした野生型腸オルガノイドの相対的mRNA発現は、(A - C)は、iの倍数変化を表しますそれぞれnflammatoryサイトカインIL-18、IL-6およびTNFα。エラーバーは、標準偏差(SD)を表す。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3:正規化のためのオルガノイドの相対的な蛍光染色固定後とオルガノイドの核染色 (A)オルガノイドの明視野。 (B)核染色色素とオルガノイドの蛍光染色。 (C)明視野および蛍光染色の合成画像。スケールバーは、すべての画像に400ミクロンに等しい。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

"> 図4
図4:のCaco-2細胞から作成した標準曲線三連ウェルから作成した標準曲線細胞播種は、ウェル当たり2,500細胞まで希釈液でウェルあたり60,000個の細胞から始まる範囲を持っていた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5:プロトコルダイアグラムの概要図の1トップパネルには、R-spondin1馴化培地を収穫示しています。図の2-中央のパネルは、収穫するプロトコルおよび培養マウス小腸オルガノイドの態様を示します。図の3ボトムパネルを示しています。(A)14日培養したオルガノイドのメッキ。 PAMP / L.(B)の挑戦モノサイトゲネス、標準曲線を作成するために空いているウェルを残す。(C)PAMPチャレンジ、標準曲線を生成するために、以前に占有されていないウェルでのCaco-2細胞のプレーティングの後。固定および核染色色素を添加した後(D)、標準曲線に対してウェルおよび正規化の励起/発光を測定する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

腸オルガノイドの文化やメンテナンスは、適切な組織培養技術を用いて任意の個人によって習得することが可能な手順です。そこより、従来の単層で増殖する細胞と比較した場合、微妙な継代しているが、これらの微妙な違いを克服することは困難ではありません。この方法の重要なステップは、最適な播種のために十分に高い密度にオルガノイドを成長させることができるという伴います。一般的に細胞株を用いて達成することができる大規模な播種密度は実用的ではないとして実験はオルガノイドでスケールダウンする必要があります。複数の処置群が存在する場合に特に顕著になります。

このプロトコルは、異なる細菌の様々な腸上皮の宿主 - 病原体相互作用を研究するためのステップバイステップの方法を提供することを目的とします ウイルス、および真菌病原体だけでなく、正規化に関して、このシステムを使用してアドレスの難しさ。レポートはそのdescribご利用いただけます電子細菌性病原体サルモネラと腸オルガノイドの相互作用まだ分泌されたサイトカイン13を測定する場合の正規化方法に対応していません。

異なる方法でオルガノイド培養液を正規化する際に発生しているいくつかの困難があります。ビシンコニン酸アッセイを介して分泌タンパク質を正規化します (BCA)はオプションです。 しかし 、オルガノイド培養に必要な成長成分(N2及び/又はビタミンB27)がデータは示しいない)BCAアッセイを妨害するように修飾MTTアッセイ等の細胞生存性ビア正規化は、14に記載されています。 MTTは、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ15の作用による還元に基づいているようしかし、オルガノイドのミトコンドリア代謝活性を変化させる処理は、この技術によって正規化のための不正確な方法をご紹介します。ない上に、メディアからN-アセチルシステイン(NAC)を除去することも必要ですMTT法を介して、正規化が望まれる場合LYは、しかし、NACのような細菌性病原体で処理すると、細菌増殖16を阻害することができる場合。

この手法の利点は、オルガノイドから分泌されたサイトカインおよびタンパク質製品は現在のCaco-2細胞の標準曲線に対して正規化することができるということです。この手法の限界は、非形質転換初代上皮オルガノイドの核染色は、結腸癌細胞株の核染色に対して正規化されるため、正規化相関であるということです。著者らは、核とメタノールと染色の核と固定することを見つけます 染料を染色するのCaco-2細胞の標準曲線に対して有効な正規化手法です。この結腸癌細胞株の増殖特性を正確に核染色を​​用いて、平均蛍光強度を測定し、腸のオルガノイドの増殖特性を模倣していないが、全細胞数に対して正規化するための優れた戦略です。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals S11050 (Section 1, 3, 6) Or equivalent brand
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo (Section 1, 3)
DMEM GE Healthcare Sh30243.01 (Section 1, 6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells
HEK293T-Rspondin1 secreting cell line (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. 
50 ml conical tube Falcon 352070 (Section 1) Or equivalent brand
T-175 Flask Corning 431079 (Section 1) Or equivalent brand 
Protein Matrix Corning 356231 (Section 2, 3, 4, 5, 6) Matrigel Growth Factor Reduced 
HyClone Dulbecco's (DPBS) GE Healthcare SH30264.01 (Section 2, 3)
DMEM/F12  Life Technologies 12634-010 (Section 2, 3) Advanced DMEM/F12
Corning 24 Well TC Plates Corning 3524 (Section 2)
N2 Supplement 100x  Life Technologies 17502-048 (Section 2)
B27 without vitamin A 50x  Life Technologies 12587-010  (Section 2)
Trizol Life Technologies 15596-026 (Section 2)
Glutamine Supplement (Glutamax) Life Technologies 35050-061 (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12
HEPES (1 M) Life Technologies 15630-080 (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 
10 ml Serological Pipet Falcon 357551 (Section 2) Or equivalent brand
Murine Noggin Peprotech 250-38 (Section 2) Stock = 100 mg/ml
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A9165 (Section 2) Stock = 1M
Recombinant Mouse EGF Biolegend 585608 (Section 2) Stock = 500 mg/ml
Rocker Variable Bioexpres (Section 3)
dissecting scissors (Section 3)
forceps (Section 3)
glass slides (Section 3)
dissecting tweezers (Section 3)
25 ml Serological Pipet Falcon (Section 3)
EDTA  Sigma-Aldrich SLBB9821 (Section 3) 0.5 M or alternative TC grade EDTA
Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm Fisher FB0875712 (Section 3) Or equal sized TC dish
1 ml Syringe Becton Dickinson 309659 (Section 4)
Precision Glide Needle Becton Dickinson 305120 (Section 4) 23 G x 1 1/4 (0.6 mm x 30 mm)
Flagellin from Bacillus subtilis Invivogen tlrl-bsfla  (Section 5, 6)
Listeria monocytogenes ATCC 19115 (Section 5, 6) (Murray et al.) 
Hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA (Section 5, 6) Or equivalent brand
BBL Brain Heart Infusion Agar Becton Dickinson 211065 (Section 5)
Bacto Brain Heart Infusion Becton Dickinson 237500 (Section 5)
Caco-2 ATCC HTB-37 (Section 6)
Trypsin  gibco 25200056 (Section 6)
Methanol Fisher A412-4 (Section 6)
SpectraMax M5 Molecuar Devices (Section 6)
96 Well Assay Plate Corning 3603 (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated
Nuclear Staining Dye Life Technologies H1399 (Section 6) Hoechst 33342
T-75 Flask Corning 430641 (Section 6) Or equivalent brand
15 ml conical tube Falcon 352096 (Section1, 3) Or equivalent brand
1.7 ml polypropylene tube Bioexpress C-3262-1 Or equivalent brand
Quick-RNA MiniPrep Zymo Research R1054 Or equivalent brand
TNF-alpha  Applied Biosystems Mm 00443260_g1 Taqman gene expression assay kit
IL-6  Applied Biosystems (Mm 00446190_m1 Taqman gene expression assay kit
IL-1beta Applied Biosystems Mm 00434228_m1 Taqman gene expression assay kit
IL-18 Applied Biosystems Mm 00434225_m1 Taqman gene expression assay kit
18s Applied Biosystems Hs 99999901_s1 Taqman gene expression assay kit
7500 Fast Real Time PCR System Applied Biosystems
Nexus gradient Mastercycler Eppendorf
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix Life Technologies 4352042
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Life Technologies/Applied Biosystems 4368814
Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 ml Life Technologies/Applied Biosystems 4346907
Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein R&D Systems 3474-RS-050 500 ng/ml
chloroform Sigma-Aldrich C7559

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References

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