حقن خلايا الفئران مسانج الميلانوما لتحديد ما إمكاناتهم الإنتقالية في الرئتين

Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Timmons, J. J., Cohessy, S., Wong, E. T. Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs. J. Vis. Exp. (111), e54039, doi:10.3791/54039 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

ورم خبيث هو السبب الرئيسي للوفاة بين مرضى الأورام الخبيثة. عملية نشر المنتشر من الخلايا السرطانية وغير مفهومة ولكن يبدو أن تنطوي على عدة خطوات، بما في ذلك غزو الأنسجة المجاورة، دخول الوعاء في الأوعية اللمفاوية والأوعية الدموية والبقاء والنبات ضمن نظام الدورة الدموية، والتسرب من الأوعية الدموية في موقع ورم خبيث، والتكيف لالمكروية الجديدة للموقع الجديد، والاستعمار في الموقع الجديد من خلال انتشار وتشكيل الأورام الثانوية 1. كل هذه الأحداث البيولوجية تنطوي على التحول ونشر وبقاء خلايا الورم النقيلي. على سبيل المثال، فإن التحول من النمط الظاهري الظهارية للخلية السرطانية في النمط الظاهري الوسيطة، إلى جانب التفاعل الناجح مع المصفوفة خارج الخلية، تمكنها من غزو الأنسجة المجاورة وmetastasize إلى أجزاء أخرى من الجسم. 2،3 علاوة على ذلك، فإن هذه النقيلي خلايايجب البقاء على قيد الحياة داخل مجرى الدم تعميم والتهرب من مراقبة محصنة من المضيف. 4،5 وأخيرا، عندما زرعت في موقع بعيد داخل الجسم، والخلايا السرطانية يجب أن تتكيف مع المكروية بهم من أجل التكاثر وتشكيل الأورام الثانوية. 6،7 لذلك ، على الرغم من ورم خبيث هو ظاهرة شائعة بين مرضى السرطان، وخلايا الورم النقيلي لها مجالات متعددة من الضعف التي هي قابلة للتدخل العلاجي.

ونظرا لطبيعة مناعة من سرطان الجلد، والفائدة الأخيرة في المناعية، ونماذج لسرطان الجلد مفيدة على نحو متزايد. 8 في الولايات المتحدة وحدها، سرطان الجلد هو سبب ما يقدر بنحو 9000 حالة وفاة سنويا. 9 مواقع مشتركة من ورم خبيث سرطان الجلد هي العظام والدماغ والكبد، والرئتين. غالبية الانبثاث إلى مواقع بعيدة تحدث من خلال مجرى الدم. تعميم الخلايا السرطانية في الدم يجب أن تهرب من إزالة المناعي، والوصول إلى سرير شعري من جهاز القاصي وغزو ​​من خلال الخلايا البطانية في الأوعية الدموية من أجل إثبات وجودها بنجاح. 4-7،10، 11

لمحاكاة الظواهر الشائعة وضراوة من ورم خبيث، تم إنشاء الفئران B16-BL6 خط الخلية. والمتوفي من الوالدين C57BL / 6 خط خلية سرطان الجلد B16-F0، B16-BL6 هو المنتج النهائي من 10 اختيارات متتالية لورم خبيث في الرئة من الحقن في الوريد (مما أدى إلى B16-F10)، تليها 6 اختيارات متتالية لاختراق غشاء المثانة. 12 وعلى هذا النحو، بل هو خط خلية سرطان الجلد يمكن الاعتماد عليها لإقامة بؤر المنتشر في الماوس، وخاصة عندما تم حقنها عن طريق الوريد. 13

بعد حقن كمية كافية من B16-BL6 الخلايا في الوريد ذيل B57BL / 6 الماوس، تليها أسبوعين أو أكثر للسماح للزرع ونمو الخلايا B16 / BL6، وبؤر المنتشر يشكل في الرئتين. على القتل الرحيم والتفتيش من قبل تشريح المجهر، وعدد منفرد بؤر الحاضر يمكن أن يكون كميا. وهذا، بدوره، يمكن استخدامها لإنشاء تأثير جرعة ورم خبيث، وعدد الخلايا B16-BL6 حقن يرتبط مع عدد من البؤر تشكلت على سطح الرئتين. ويعرف هذا النموذج ب "ورم خبيث التجريبي"، حيث يتم إدخال الخلايا المعروفة النقيلي مباشرة إلى مجرى الدم، وتسهيل انتشار سريع ويمكن التنبؤ به وإنشاء في الرئتين، الكبد، أو جهاز آخر من التحقيق. هذا هو على النقيض من "ورم خبيث عفوية،" حيث يتم زرع الخلايا السرطانية، وغالبا ما تحت الجلد، والانبثاث تنشأ من إلقاء عضويا الخلايا السرطانية. 14،15

ومن المهم أن حقن كمية مناسبة من الخلايا B16 / BL6 في الأوردة ذيل الفئران. كثيرة جدا، وسيتم تغطية الرئتين مع الانبثاث وسوف البؤر المجاورة لا يمكن تمييزها عن بعضها البعض. عدد قليل جدا، وسوف تأثير عامل علاجي يكون غير مدرك بسبب الأصيل فاريبالجمع بين الحقن. من أجل الحصول على العدد الأمثل من بؤر على الرئتين من C57BL / 6 الفئران، فمن الضروري ربط عدد من حقن الخلايا مع كمية من بؤر النقيلي أنشئت على سطح الرئتين مع الأخذ بعين الاعتبار distinguishability الفردية البؤر. وهذا البروتوكول يبرهن على وجود نموذج سرطان الجلد المنتشر الفئران لC57BL / 6 الفئران.

Protocol

بيان الأخلاق: استخدام الفئران في البحث هو مقبول فقط في الحالات التي تكون فيها قد دفع التفاهم بين البشر من علم الأحياء أو نحو العلاج في نهاية المطاف من المرض.

1. الترتيب

  1. شراء أنثى C57BL / 6 الفئران (سن 6-8 أسابيع)، 5 الفئران في المجموعة. تسمح عدة أيام للفئران لضبط.

2. إعداد الخلايا B16-BL6

  1. إزالة لوحات زراعة الخلايا من الحاضنة 37 درجة ومكان في غطاء العقيمة. وينبغي أن تكون لوحات ما يقرب من 70٪ متموجة مع خلايا سرطان الجلد في الفئران-B16 BL6. والتقاء أكبر قد يغير الخلايا إمكانات النقيلي.
  2. إضافة 1 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA لكل لوحة، اتركيه لمدة 1 دقيقة، ثم نضح الحل التربسين وسائل الإعلام.
  3. إضافة 1 مل من التربسين في لوحة والعودة لوحات الحاضنة لمدة 10 دقيقة.
  4. بعد انتقاله لوحات من الحاضنة إلى غطاء العقيمة، إضافة 4 مل من مصل خالية Rosewell من الحديقة التذكارية معهد ميديوم (RPMI) إلى كل لوحة.
  5. جمع الخلايا مع معقمة، ماصة الآلية. إخراج الخلايا ضد الجزء السفلي من لوحة، مع تلميح الضغط في زاوية طفيف جدا، لتفتيت الخلايا. كرر عدة مرات من أجل ضمان الفصل الكافي من كتل الخلايا، والتي قد تسد إلا إبرة طرد. يتذكر ونقل إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  6. استخدام عدادة الكريات لتحديد كثافة الخلية. الحفاظ على العدد الكلي للخلايا B16-BL6 ثابت، وتحديد حجم خالية من المصل RPMI اللازم للوصول إلى تركيزات النهائي من 0، 0.065، 0.015، 0.25، و 0.5 مليون خلية / مل.
  7. على قدم المساواة قسامة وسائل الإعلام في أنبوب 50 مل إلى 15 مل أنابيب مخروطية. أنابيب الطرد المركزي المخروطية في 2250 x ج لمدة 5 دقائق. صب سائل الإعلام. إضافة حجم مناسب من المصل خالية RPMI والتأكد من كثافة الخلايا المطلوبة عبر عدادة الكريات. ضبط densities- بإضافة إضافية RPMI أو الغزل وإعادة التعليق في volume- أصغر وفقا لذلك.
  8. قسامة 500 ميكرولتركل تعليق خلية في المسمى 1.8 مل أنابيب على الجليد.

3. الذيل الوريد حقن

  1. خذ الماوس، الذي عقد من ذيله، وتوجيهها الخلفي لأول مرة في رادع الماوس. مع الجذع في القاعة الرئيسية للرادع، مع ذيل خارجها، وسحب الماوس نحو نهاية رادع. إدراج رادع، الغطاس، والاستمرار في دفع حتى الفأر هو آمن.
  2. تدوير الماوس 90 درجة من هذا القبيل أن أحد الأوردة الذيل الأفقي تواجه صعودا. باستخدام وسادة الكحول، بقوة تنظيف جوانب من ذيل فأر، وخاصة حيث الوريد الذيل هو الأكثر وضوحا.
    ملاحظة: الإضاءة الجيدة ضرورية من أجل ذيل فعال الوريد التصور على B57BL / 6J الفئران. مصابيح الحرارة أو منصات جراحة ساخنة، في حين ليس من الضروري، سوف يساعد أيضا عن طريق زيادة حجم الوريد الذيل.
  3. في غطاء الثقافة العقيمة، وجمع 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلية من 2 مليون خلية أنبوب / مل. عكس إبرة، عبها الصورةبيئة تطوير متكاملة ودفع المكبس، لإخراج فقاعات من الحقنة. إخراج ثقافة RPMI أن يؤدي إلى الحجم النهائي من 250 ميكرولتر.
  4. تمديد الماوس الذيل مع جهة غير المهيمنة. عقد الذيل مع نهاية القريبة من الذيل مرتفعة مع السبابة من اليد غير المسيطرة، والجزء الأعلى من الذيل الاكتئاب مع الإبهام.
    ملاحظة: في هذه الطريقة، يتم عقد الوريد الذيل في وضع جانبي، موازية لسطح رادع، مع إدخال المنسجمة ممكن في الجزء الأكثر البعيدة من الذيل.
  5. ادخال الإبرة في الوريد الذيل، في نهاية البعيدة، في زاوية الهبوط دقيقة لتبدأ، ومن ثم ضبط الإبرة لتتناسب مع زاوية من الوريد الذيل على مزيد من الإدراج (خفض نهاية المكبس من حقنة المتعلقة إبرة) .
  6. ادخال الإبرة حوالي 1 سم في الوريد الذيل. بعد الإدراج، والبدء في دفع المكبس، وعقد إبرة ثابتة.
    ملاحظة: إذا كانت الإبرة في الوريد الذيل ونهاية الإبرة نعرقلة التمديد يجب على وسائل الإعلام تتدفق دون عوائق في الوريد. يتميز حقن الفعلي من إزالة الدم من الوريد. إذا كان هناك مقاومة، أو يبدأ فقاعة لتشكيل في الموقع في الحقن، وإزالة الإبرة وحاول مرة أخرى في مكان أكثر الداني على طول الوريد الذيل.
  7. إزالة الإبرة من الوريد وتخلص منه. عقد الشاش ضد دخول موقع لوقف أي نزيف.
  8. إزالة المكبس من رادع ووضع الماوس في قفص المتلقي.
  9. أكرر للجميع التركيزات أخرى.
    ملاحظة: الرئة إنشاء بؤر يستغرق حوالي 2-3 أسابيع، مع التباين باختلاف خط الخلية والحجم المطلوب من بؤر 9 في غضون ذلك، ينبغي رصد الفئران عن الأعراض التي يمكن أن تبرر القتل الرحيم في وقت مبكر، مثل يلهث المفرط.

4. عد الرئة بؤر

  1. الموت ببطء الماوس عن طريق وضع في غرفة CO 2 وفضح إلى 100٪ CO 2
  2. وسع الماوس على الستايروفوم. باستخدام مقص جراحي، إنشاء شق جراحي على طول القص.
  3. جعل اثنين من الشقوق إضافية، سواء من الجزء العلوي من شق عظمة القص والمتفرعة نحو الكتفين من الفأرة، وفضح القفص الصدري.
  4. جعل اثنين من التخفيضات، كل على طول الجانبين الوحشية للقص، لإزالة القفص الصدري من الجذع، وتعريض الرئتين والقلب.
  5. عقد القلب مع ملاقط جراحية، وقطع المريء والقصبة الهوائية، وتحرير القلب والرئتين من الفأرة. وضع تحت المجهر تشريح، في 10X التكبير، لتحسين التصور.
  6. تشريح القلب من الرئتين وإزالة الغدة الصعترية، ولم يتبق سوى الرئتين اثنين.
  7. مع الرئتين تحت نطاق تشريح، والبدء في الاعتماد على بؤر الرئة. يجب أن تظهر كل بؤر كما تعميما، الحشو البني على سطح الرئتين.
    1. إلىالاتساق بين الفئران وحساب عدد من البؤر على سطح شحمة الأذن، وثم قلب أن الفص. فعل كل من الفص أربع يسمح بشكل فردي لتسهيل الفرز.
  8. حفظ وإصلاح الرئتين إذا أداء IHC، وإلا، ونبذ ما تبقى.

Representative Results

على الفحص البصري، والاختلاف في بؤر السطح هو واضح. يجب حساب عدد من الأورام تحت المجهر تشريح تسفر عن وجود علاقة خطية بين عدد من الخلايا السرطانية حقن وعدد من الناتج وبؤر معدود. استخدام العدد الأمثل من الخلايا عن طريق الحقن، والهدف هو واحد حيث لم تتم تغطية الرئتين تماما، كما هي في 500000 خلية / مل في الشكل 1A، والتي لا تغطيها قليلة جدا، كما هي على 62500 خلية / مل و 125000 خلية / مل. وهذا هو أيضا قابل للقياس عن طريق الارتباط الخطي (الشكل 1B).

شكل 1
الشكل 1. الرئة البؤر الناتجة من الذيل الوريد حقن الخلايا B16 / BL6. (A) الرئة بؤر يمكن تصور على سطح الرئتين من C57BL / 6 الفئران كما الجماهير دائرية البني (بؤر تمثيلي تحت السهام). كما أوكارإيتي الثقافة حقن الخلايا (فوق كل صورة) يزيد، لذلك لا عدد مماثل من الناتج بؤر الرئة (تحت كل صورة). الرئتين من الماوس وفقا لأعلى كثافة من حقن الخلايا لديها أكبر تغطية مرئية من بؤر الرئة. تمثل الحانات مقياس 20 ملم. (ب) تعداد بؤر الرئة بالنسبة للكثافة زراعة الخلايا. هناك علاقة خطية تقريبا فوق 125000 خلية / مل، على النحو الذي يحدده عدادة الكريات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تعميم الخلايا السرطانية من حقن الوريد الذيل تمثل الانبثاث تتهرب من المواقع النمو الابتدائي والهجرة من خلال طرق مثل مجرى الدم أو الجهاز الليمفاوي، وأحيانا وضع أنفسهم في الأسرة الشعرية من أماكن بعيدة. 14 البروتوكول المذكورة أعلاه نموذجا للمرحلة الثانوية الانبثاث. مع العدد الأمثل من الخلايا B16-BL6 حقن، ويمكن المجربون تحديد أثر النسبي للعقار تدار أو السكان الخلايا المناعية، بعد تحييد، على ورم خبيث الخلايا السرطانية.

هذا البروتوكول لديه قيود. وقد تم اختيار الخلايا السرطانية المنتشرة لقدرتها على metastasize، وبالتالي غير قابلة للمناعة، وجود مستويات أدنى من التوافق النسيجي الرئيسي من الدرجة المعقدة 1 الجزيئات. 12 وعلاوة على ذلك، وإدخال مفاجئ ومتفاوت من عدد كبير من الانبثاث هو عكس السيناريو النموذجي في المرضى حيث أعداد صغيرة من خلايا الورم النقيليتبدد على مدى فترة طويلة من الزمن من موقع الورم الرئيسي. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا السرطانية قدم عن طريق الوريد هي من زراعة الأنسجة وليس من أصل الورم الرئيسي. لذلك، وهذه الخلايا هي عكس الانبثاث الثانوية التي تنتج عن تغيرات في التصاق الخلايا، والهجرة، والاعتراف المناعة، والمتلقي إنشاء الجهاز. 15،16

ومن شأن بروتوكول بديل يكون حقن تحت الجلد B16 / BL6 لتوليد الأورام الأولية وتحليل الناتج الانبثاث الرئة "عفوية". تم العثور على هذه الانبثاث "عفوية" لاحتواء المزيد من التجانس من نظرائهم "التجريبية"، مطابقة بشكل وثيق أولئك المرضى من البشر. بروتوكول يحد في قدرتها على تحديد تأثير مركب تجريبي على ورم خبيث. مع الجانبي حقن الوريد الذيل، وعدد من خلايا سرطان الجلد حقنها في مجرى الدم ويمكن أن يقترب عبر حemocytometer. مع ورم خبيث "عفوية"، ولكن، هناك قدر أكبر من التجانس بين الأورام، إضافة متغير إضافي لعدد من الناتج بؤر الرئة. 16

في الختام، يمثل الذيل الوريد B16 BL6 نموذج سرطان الجلد الفئران نموذج بسيط لتحديد تأثير العلاج أو العلاج المناعي على ورم خبيث. عن طريق حقن الوريد تعميم الخلايا السرطانية، يمكن للباحثين تكرار، إلى حد ما، والمرضى بعد ورم خبيث. وبالنظر إلى الآثار المدمرة للخلايا الورم النقيلي في مرضى السرطان، وهذا النموذج هو أداة قوية لفهم عملية متعددة الخطوات من ورم خبيث.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

بدعم جزئي من منحة المعهد الوطني للسرطان 1R03CA172923.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin Corning MT25052CV
RPMI 1640 Medium Corning MT15040CM
Phase Contraast Hemacytometer Hausser 02-671-54
Micro-Fine IV Insulin Syringes BD 14-829-1D
Sterile Alcohol Prep Pads Fisherbrand 22-363-750
Mouse Restrainer Braintree Scientific NC9999969 Restrainer choice depends on age/size of mice
Heating Pad Harry Schein NC0012697 Optional

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
  2. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119, (6), 1420-1428 (2009).
  3. Stetler-Stevenson, W. G., Aznavoorian, S., Liotta, L. A. Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis. Annu Rev Cell Biol. 9, 541-573 (1993).
  4. Allard, W. J., Matera, J., Miller, M. C., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant disease. Clin Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
  5. Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., et al. Cancer immunoediting: from iimmunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol. 3, 991-998 (2002).
  6. Hugo, H., Ackland, M. L., Blick, T., et al. Epithelial-mesenchymal and mesenchymal-epithelial transition in carcinoma progression. J Cell Physiol. 213, 374-383 (2007).
  7. Kang, Y., Massague, J. Epithelial-mesenchymal transitions: Twist in development and metastasis. Cell. 118, 277-279 (2004).
  8. Hodi, S. F., et al. Improved survival with Ipilimumab in patients with metastatic melanoma. NEJM. 363, (13), 711-723 (2002).
  9. Ekwueme, D. U., Guy, G. P., Li, C., Rim, S. H., Parelkar, P., Chen, S. C. The health burden and economic costs of cutaneous melanoma motality by race/ethnicity-United States. J. Am. Acad. Dermatol. 65, 5 Supple 1 133-143 (2011).
  10. Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumor. Bio.Volume. 35, 8483-8523 (2014).
  11. Weinberg, R. A. Is metastasis predetermined. Mol. Oncol. 1, (3), 263-264 (2007).
  12. Ishiguro, T., Nakajima, M., Naito, M., Muto, T., Tsuruo, T. Identification of genes differentially expressed in B16 murine melanoma sublines with different metastatic potentials. Cancer Res. 56, (4), 875-879 (1996).
  13. Clark, E. A., Todd, R. G., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406, 532-535 (2000).
  14. Terranova, V. P., Hic, S., Diflorio, R. M., Lyall, R. M. Tumor cell metastasis. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 5, (2), 87-114 (1986).
  15. Elkin, M., Vlodavsky, I. Tail vein assay of cancer metastasis. Curr Protoc in Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.2 (2001).
  16. Hagedorn, H. G., Bachmeier, B. E., Nerlich, A. G. Synthesis and degradation of basement membranes and extracellular matrix and their regulation by TGF-beta in invasive carcinomas (Review). Int. J. Oncol. 18, (4), 669-681 (2001).
  17. Hart, I. The selection and characterization of an invasive variant of the B16 melanoma. Am J Pathol. 97, (3), 587-600 (1979).
  18. Overwijk, W. W., Restifo, N.P. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma. Curr Protoc Immunol. 20, (1), (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics