동계 쥐 흑색 종 세포의 주입은 폐에서 그들의 전이성 잠재력을 확인하는 방법

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Timmons, J. J., Cohessy, S., Wong, E. T. Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs. J. Vis. Exp. (111), e54039, doi:10.3791/54039 (2016).

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Abstract

Introduction

전이 악성 종양 환자에서 사망의 주요 원인이다. 암세포의 전이성 보급의 과정은 제대로 이해하지만, 전이, 적응의 사이트에있는 혈관에서 인접 조직의 침공, intravasation 림프계와 혈관, 생존에와 전위 순환 시스템 내에서, 혈관 외 유출 등 여러 단계를 포함 할 나타납니다 확산 및 보조 종양의 형성에 의해 새로운 사이트의 새로운 새 사이트의 미세하고 식민지에. 일이 생물학적 사건의 각각은 전이성 종양 세포의 변화, 보급 및 생존을 포함한다. 예를 들어, 세포 외 매트릭스와의 성공적인 상호 결합 간엽 표현형으로 종양 세포의 상피 세포의 표현형의 변화는, 인접한 조직에 침투하고, 신체의 다른 부위로 전이 할 수 있도록. 2,3 또한, 이들 전이를 세포체내 먼 부위에 이식 할 때 순환 혈류 내에서 생존하고 호스트로부터의 면역 감시를 회피한다. 4,5 마지막으로, 종양 세포는 이차 종양 증식 형성하기 위해 자신의 미세 환경에 적응한다. 6,7 따라서 전이는 암 환자에서 공통적 현상이지만, 전이성 종양 세포의 치료 개입 의무가있는 취약점 여러 영역을 갖는다.

흑색 종의 면역 원성 자연과 면역 최근 관심을 감안할 때, 흑색 종에 대한 모델. 점점 더 유용 혼자 미국에서 8, 흑색 종은 연간 약 9,000 명이 사망의 원인입니다. 흑색 종 전이의 9 일반적인 위치는, 뇌 뼈 있습니다 간, 폐. 먼 사이트로의 전이의 대부분은 혈류를 통해 발생한다. 혈액 암세포를 순환하는 면역 클리어런스를 회피 말단 기관의 모세 혈관 층에 도달해야성공적으로 자신을 확립하기 위해 혈관의 내피 세포를 통해 침입. 4-7,10 11

전이의 일반적이고 치명적인 현상을 모방하기 위해, 쥐 B16-BL6 세포주를 만들었습니다. 부모 C57BL / 6 흑색 종 세포 라인 B16-F0의 사망자는 B16-BL6은 방광 막 침투 6 연속 선택 다음 (B16-F10 결과) 정맥 주사에​​서 폐 전이 10 연속 선택의 최종 제품이다. 이와 같이 12는, 특히 정맥 내 주사 할 때 마우스의 전이성 병소의 확립에 대한 신뢰성 흑색 종 세포주이다. (13)

주입 및 B16 / BL6 세포의 성장을 허용하는 둘 이상의 주 뒤에 B57BL / 6 마​​우스의 꼬리 정맥에 B16-BL6 셀의 충분한 양을 주입 후 전이성 병소 폐에 형성된다. 해부 현미경에 의한 안락사 및 검사시의 수개별 초점 선물은 정량 할 수있다. 주입 B16-BL6 셀의 개수가 폐의 표면에 형성 병소의 수와 상관 관계로서 이는 차례로, 복용량 전이 효과를 확립하기 위해 사용될 수있다. 이 모델들은 알려진 전이성 세포 조사 폐, 간 또는 기타 기관에서 신속하고 예측 가능한 확산 설립을 용이 혈류에 직접 도입되는 "실험 전이"로 알려져있다. 이는 종양 세포는 종종 피하 주입 "자발적 전이"대조적이며, 유기 암세포 창고에서 전이가 발생한. 14,15

이는 생쥐의 꼬리 정맥으로 B16 / BL6 셀의 적절한 양을 주입하는 것이 중요하다. 너무 많은, 그리고 폐 전이로 덮여되고 주변 초점이 서로 구별 할 수 있습니다. 너무 적은 및 치료제의 영향으로 인해 본래 VARI으로 식별 할 수없는 것주사 사이의 관리 포인트. C57BL / 6 마​​우스의 폐에 병소의 최적의 수를 얻기 위해서는, 계정에 개인의 distinguishability하면서 폐의 표면에 설치 전이성 병소의 금액 주입 세포 수를 상관 할 필요 초점. 이 프로토콜은 C57BL / 6 마​​우스에 대한 전이 생쥐 흑색 종 모델을 시연 할 예정이다.

Protocol

윤리 정책 : 연구 마우스의 사용은 기본적인 생물학 또는 질병의 최종 처리에 대한 인간의 이해를 발전 있습니다 경우에만 허용됩니다.

1. 주문

  1. 구매 여성 C57BL / 6 마​​우스 (6 세 - 8 주), 그룹 당 5 마우스. 쥐에 대한 몇 가지 일 조정할 수 있습니다.

B16-BL6 셀의 제조 2

  1. 멸균 후드에서 37도 인큐베이터과 장소에서 세포 배양 플레이트를 제거합니다. 플레이트는 B16-BL6 생쥐 흑색 종 세포와 약 70 %의 합류해야합니다. 더 큰 합류는 세포를 전이 가능성을 변경할 수 있습니다.
  2. 1 분 동안 앉아 보자, 접시 당 1 ml의 0.05 %의 트립신 - EDTA를 추가 한 다음 트립신 미디어 솔루션을 대기음.
  3. 접시 당 트립신 1 ML을 추가하고 10 분 동안 인큐베이터에 번호판을 반환합니다.
  4. 멸균 후드로 인큐베이터에서 접시를 이동 한 후, 무 혈청 Rosewell 공원 기념 연구소 Mediu 4를 가하여각각의 판에 m (RPMI).
  5. 멸균, 전동 피펫 세포를 수집합니다. 세포를 파괴하는, 아주 약간의 각도를 누르면 끝으로, 플레이트의 바닥에 전지를 꺼냅니다. 그렇지 토출 바늘 막힘 수도 세포 덩어리의 적절한 분리를 보장하기 위해 여러 번 반복. 회상과 50 ML 원뿔 튜브에 전송할 수 있습니다.
  6. 셀 밀도를 결정하는 혈구를 사용합니다. 상수 B16-BL6 셀의 총 개수를 유지하는 무 혈청 RPMI의 양을 결정하는 것은 0, 0.065, 0.015, 0.25 및 0,500,000 세포 / ㎖의 최종 농도에 도달 할 필요가 있었다.
  7. 마찬가지로 15 ML 원뿔 튜브에 50 ML 튜브에 미디어 나누어지는. 5 분 동안 2,250 XG의 원추형 원심 분리 튜브. 미디어를 가만히 따르다. 무 혈청 RPMI의 적절한 볼륨을 추가하고 hemacytometer를 통해 원하는 세포 밀도를 확인합니다. 추가 RPMI을 추가하거나 회전하고 그에 따라 작은 볼륨 -에 재현 탁하여 densities- 조정합니다.
  8. 나누어지는 500 μL얼음에 표시된 1.8 ml의 튜브에 각각의 세포 현탁액.

3. 꼬리 정맥 주입

  1. 꼬리에 의해 개최 마우스를 가지고, 마우스 제한 수단으로 후방 먼저 안내합니다. 그것은 외부의 꼬리와 제한 수단의 주요 챔버의 몸통으로, 제한 수단의 끝으로 마우스를 잡아 당깁니다. 마우스가 고정 될 때까지 밀어 계속의 제한 수단 플런저를 삽입합니다.
  2. 측면 꼬리 정맥 중 하나가 위쪽으로 향하도록 90도 등 마우스를 회전합니다. 알코올 패드를 사용하여 적극적으로 꼬리 정맥을 가장 잘 보이는 곳에 특히 마우스의 꼬리 쪽 청소.
    참고 : 좋은 조명이 B57BL / 6J 마우스에 효과적인 꼬리 정맥을 시각화 필수적이다. 가열 램프 나 가열 수술 패드는 불필요하지만, 또한 꼬리 정맥의 체적을 증가시킴으로써 도울 것이다.
  3. 멸균 배양 후드에서 2 백만 세포 / ㎖ 튜브에서 세포 배양 배지 300 μl를 수집한다. 의 S를 쓸어 넘겨, 바늘 전환IDE와 주사기에서 거품을 배출, 플런저를 밀어. 250 μL의 최종 부피가 발생하는 문화 RPMI를 꺼냅니다.
  4. 비 지배적 인 손으로 마우스 꼬리를 확장합니다. 비 - 지배적 인 손의 집게 손가락으로 상승 꼬리의 기단부와 엄지 손가락으로 눌려 꼬리의 말단부와 꼬리를 잡고.
    주 : 이러한 방식으로, 꼬리 정맥을 횡 방향 위치에 유지하고, 꼬리의 더 선단 부분에서 가능하면 일치하는 엔트리와 상기 제한 수단의 표면에 평행.
  5. 우선 분 하향 각 말단부를 향해 꼬리 정맥에 주사 바늘을 삽입하고 (바늘을 주사기의 상대 플런저 단부 저하) 상기 삽입시의 꼬리 정맥의 각도와 일치하도록 바늘을 조정 .
  6. 꼬리 정맥에 바늘을 약 1cm를 삽입합니다. 삽입 후, 바늘이 정상 들고 플런저를 푸시하기 시작한다.
    주 : 바늘 꼬리 정맥에있는 경우 및 바늘 끝이 N이고오티는 미디어가 정맥에 방해받지 않고 흘러해야 방해. 효과적인 주사를 정맥에서 혈액 통관을 특징으로한다. 이 저항 또는 기포 주입의 부위에서 형성되기 시작하면, 바늘을 제거하고, 꼬리 정맥을 따라 더욱 인접 위치에서 다시 시도.
  7. 정맥에서 바늘을 제거하고 폐기합니다. 어떤 출혈을 멈추게하는 항목 사이트에 거즈를 잡습니다.
  8. 제한 수단에서 플런저를 제거하고받는 사람 케이지에 마우스를 놓습니다.
  9. 다른 모든 농도에 대해 반복합니다.
    참고 :. 폐 초점 설립은 약 2 소요 - 변화 셀 라인과 초점의 원하는 크기에 따라 함께 3 주 (9)를 중간에서 마우스 과도한 헥헥처럼, 초기 안락사를 보증 할 수 증상을 모니터링해야한다.

4. 폐 초점을 계산

  1. CO 2를 공동 2 챔버에 배치하고 100 % 노출하여 마우스를 안락사
  2. 스티로폼에 마우스를 스플레이. 수술 가위를 사용하여 흉골을 따라 수술 절개를 만들 수 있습니다.
  3. 흉골 절개의 상단에서와 흉곽을 노출, 마우스의 어깨쪽으로 분기 모두 두 개의 추가 절개를합니다.
  4. 폐와 심장을 노출, 몸통에서 갈비뼈를 제거하기 위해, 두 컷, 흉골의 측면을 따라 각합니다.
  5. 수술 핀셋으로 마음을 잡고, 마우스에서 심장과 폐를 확보, 식도와 기관지를 잘라. 더 나은 시각화를 위해, 10 배 배율에서, 해부 현미경 아래에 배치합니다.
  6. 단지 두 개의 폐를 떠나, 폐에서 심장을 해부 및 흉선을 제거합니다.
  7. 해부 범위 아래에있는 폐와 폐의 초점을 계산하기 시작합니다. 각각의 초점은 폐의 표면에 원형, 갈색 강요로 나타납니다.
    1. 에 대한생쥐 간 일관성은 로브 (lobe)의 표면에 병소의 수를 카운트하고, 그 로브 반전. 네 개의 로브의 각 이렇게하면 개별적으로 쉽게 계산이 가능합니다.
  8. 유골을 폐기, 그렇지 않으면, 저장하고 IHC를 수행하는 경우 폐를 수정합니다.

Representative Results

시각적 검사시, 초점면에서의 변화는 명백하다. 해부 현미경 종양의 수를 카운트하는 주입 종양 세포의 수와 생성 수 및 가산 초점 사이의 선형 관계를 생성한다. 주사 셀들의 최적의 개수를 사용하여, 목표는 62,500 개의 세포 / ㎖ 및 125,000 세포만큼 그들 /도 1a에 500,000 세포 / ml로하고, 너무 희박한 덮이지 같이 폐 완전히 포함되지 않는 하나 인 ml의. 이것은 또한 선형 상관 관계 (그림 1B)에 의해 정량화 할 수있다.

그림 1
꼬리 정맥으로 인한 그림 1. 폐 초점은 B16 / BL6 셀을 주조. (A) 폐 초점은 (화살표 아래 담당자 초점) 갈색 원형 대중으로 C57BL / 6 마우스에서 폐의 표면에 가시화 될 수있다. 굴로(각 이미지 위) 주입 된 세포 배양의 성만 때문에 (각 이미지 아래) 폐 초점을 결과의 해당 번호를 수행, 증가한다. 주입 된 세포의 가장 높은 밀도와 마우스에서 폐는 폐 병소의 가장 큰 시각 범위를 가지고있다. 스케일 바는 20mm를 나타낸다. 세포 배양 밀도 폐 병소의 상대 (B)을 열거. hemacytometer의 결정에 따라 125,000 세포 / ml 이상 거의 선형 관계가있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

원거리의 모세관 침대에 자신을 확립 때때로 기본 성장 부위를 회피 전이를 나타내며, 혈액 또는 림프계 같은 경로를 통해 이주 꼬리 정맥 주사로 종양 세포 순환. 14이 프로토콜은 상술 한 차에 대한 모델로서 기능 전이. 주입 B16-BL6 셀의 최적의 수와, 실험자는 암세포 전이에 투여 약물 또는 면역 세포 집단, 후 중화의 상대적 효과를 결정할 수있다.

이 프로토콜은 한계가있다. 순환 성 종양 세포는 전이하는 능력으로 선택 및 주요 조직 적합성 복합체 클래스 1 분자의 낮은 레벨을 갖는, 따라서 비 - 면역 원성 하였다. (12) 또한, 전이의 다수의 갑작 클러스터 도입 환자에서 일반적인 시나리오 달리 여기서, 전이성 종양 세포의 수가 적은주 종양의 위치에서 장시간에 걸쳐 방출. 또한, 정맥 내로 도입 된 종양 세포는 조직 배양에서가 아니라 일차 종양 기원이다. 따라서 이러한 세포는 세포 접착, 마이그레이션, 면역 인식 및받는 기관 설립의 변화에 기인 보조 전이 달리합니다. (15, 16)

대안적인 프로토콜은 일차 종양 생성하고, 생성 된 "자연"폐 전이의 분석 B16 / BL6의 피하 주사 일 것이다. 이러한 "자연"전이가 자신의 '실험'에 비해 더 이질성을 포함하는 것으로 밝혀졌다, 더 밀접하게 인간 환자의 것과 일치. 프로토콜은 전이에 대한 실험적인 화합물의 영향을 판단 할 수있는 능력에 제한된다. 측면 꼬리 정맥 주입으로 혈류로 주입 된 흑색 종 세포의 개수는 H로 근사화 될 수있다emocytometer. "자연스러운"전이 그러나 폐 병소 생성 수에 추가 변수를 추가 종양 사이의 큰 얼룩이있다. 16

결론적으로 꼬리 정맥 B16-BL6 흑색 종 생쥐 모델은 전이의 치료 또는 면역 요법의 영향을 결정하기위한 간단한 모델을 나타낸다. 정맥 순환 성 종양 세포를 주입하여, 연구자들은 어느 정도, 환자의 전이 이후에 복제 할 수있다. 암 환자에서 전이성 종양 세포의 파괴적인 영향을 고려하면,이 모델은 전이의 다단계 과정을 이해하기위한 강력한 도구이다.

Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgments

국립 암 연구소 부여 1R03CA172923에 의해 부분적으로 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin Corning MT25052CV
RPMI 1640 Medium Corning MT15040CM
Phase Contraast Hemacytometer Hausser 02-671-54
Micro-Fine IV Insulin Syringes BD 14-829-1D
Sterile Alcohol Prep Pads Fisherbrand 22-363-750
Mouse Restrainer Braintree Scientific NC9999969 Restrainer choice depends on age/size of mice
Heating Pad Harry Schein NC0012697 Optional

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References

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