Iniezione di cellule singenici del topo melanoma per determinare il loro potenziale metastatico nei polmoni

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Timmons, J. J., Cohessy, S., Wong, E. T. Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs. J. Vis. Exp. (111), e54039, doi:10.3791/54039 (2016).

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Abstract

Introduction

Metastasi è una delle principali cause di morte tra i pazienti con neoplasie. Il processo di diffusione metastatica delle cellule tumorali è poco conosciuta, ma sembra coinvolgere diversi passaggi, tra cui invasione dei tessuti adiacenti, intravasation nei vasi linfatici e vasi, la sopravvivenza e la traslocazione all'interno del sistema circolatorio, stravaso dal sistema vascolare presso il sito di metastasi, l'adattamento al nuovo microambiente del nuovo sito, e la colonizzazione al nuovo sito proliferazione e formazione di tumori secondari. 1 Ciascuno di questi eventi biologici coinvolgono la trasformazione, la diffusione e la sopravvivenza delle cellule tumorali metastatiche. Per esempio, la trasformazione del fenotipo epiteliale della cellula tumorale in un fenotipo mesenchimale, accoppiato con l'interazione positiva con la matrice extracellulare, consentire loro di invadere i tessuti adiacenti e metastasi in altre parti del corpo. 2,3 Inoltre, questi metastatico celluledeve sopravvivere all'interno del flusso sanguigno circolante e evadere la sorveglianza immunitaria dall'host. 4,5 Infine, quando impiantato in un sito lontano all'interno del corpo, le cellule tumorali devono adattarsi al loro microambiente per proliferare e formare tumori secondari. 6,7 Pertanto , anche se le metastasi è un fenomeno comune tra i pazienti affetti da cancro, le cellule tumorali metastatiche hanno molteplici aree di vulnerabilità che sono suscettibili di intervento terapeutico.

Data la natura immunogenica del melanoma, e il recente interesse per le immunoterapie, modelli per il melanoma sono sempre più utile. 8 Nei soli Stati Uniti, il melanoma è la causa di una stima di 9.000 morti l'anno. 9 sedi comuni di metastasi del melanoma sono ossa, cervello , fegato e polmoni. La maggior parte delle metastasi a siti distanti avviene attraverso il flusso sanguigno. Circolanti cellule tumorali nel sangue deve eludere spazio immunitario, raggiungere un letto capillare di un organo distale einvadono attraverso le cellule endoteliali dei vasi sanguigni per stabilire correttamente se stessi. 4-7,10, 11

Per simulare i fenomeni comuni e virulenti di metastasi, è stato creato la linea cellulare B16-BL6 murino. Un defunto della parentali C57BL / 6 linea di cellule di melanoma B16-F0, B16-BL6 è il prodotto finale di 10 selezioni successive per metastasi polmonari da iniezione endovenosa (con conseguente B16-F10), seguita da 6 selezioni successive per la penetrazione della membrana della vescica. 12 come tale, è una linea cellulare di melanoma affidabile per la creazione di foci metastatici nel topo, in particolare quando iniettato per via endovenosa. 13

Dopo l'iniezione di una quantità sufficiente di B16-BL6 cellule nella vena della coda di un B57BL / 6 del mouse, seguito da due o più settimane per permettere impianto e la crescita delle cellule B16 / BL6, foci metastatici formerà nei polmoni. Al momento l'eutanasia e l'ispezione al microscopio dissezione, il numero difoci presente individuo può essere quantificato. Questo, a sua volta, può essere utilizzato per stabilire un effetto dose-metastasi, come il numero di cellule B16-BL6 iniettati è correlato al numero di foci formata sulla superficie dei polmoni. Questo modello è conosciuto come "metastasi sperimentale", in cui le cellule conosciute metastatico vengono introdotti direttamente nel flusso sanguigno, favorendo una diffusione rapida e prevedibile e stabilimento nel polmoni, fegato, o di altro organo di indagine. Questo è in contrasto con "metastasi spontanee", in cui le cellule tumorali vengono impiantati, spesso per via sottocutanea, e metastasi provengono da organicamente capannone cellule tumorali. 14,15

E 'importante per iniettare una quantità appropriata di cellule B16 / BL6 nelle vene coda dei topi. Troppi, ei polmoni saranno coperti con metastasi e la vicina focolai saranno indistinguibili gli uni dagli altri. Troppo pochi, e l'influenza di un agente terapeutico sarà indistinguibile causa intrinseca varizioni tra le iniezioni. Per ottenere un numero ottimale di foci sui polmoni dei C57BL 6 topi /, è necessario correlare il numero di cellule iniettate con la quantità di foci metastatici stabilito sulla superficie dei polmoni tenendo conto la distinguibilità dei singoli foci. Questo protocollo dimostrerà un modello murino di melanoma metastatico in topi C57BL / 6.

Protocol

Etica Dichiarazione: L'uso di topi nella ricerca è accettabile solo nei casi in cui si potrebbe avanzare la comprensione umana della biologia fondamentale o verso l'eventuale trattamento della malattia.

1. Ordine

  1. Acquisto femminile C57BL / 6 topi (all'età di 6 - 8 settimane), 5 topi per gruppo. Consentire diversi giorni per i topi per regolare.

2. Preparazione di cellule B16-BL6

  1. Rimuovere piastre di coltura di cellule da incubatore a 37 gradi e posto in una cappa sterile. Le piastre devono essere circa il 70% confluenti con cellule di melanoma murino B16-BL6. Una maggiore confluenza può alterare le cellule potenziale metastatico.
  2. Aggiungere 1 ml di 0,05% tripsina-EDTA per piastra, lasciate riposare per 1 minuto, e poi aspirare la soluzione di tripsina-media.
  3. Aggiungere 1 ml di tripsina per piastra e tornare piastre incubatrice per 10 min.
  4. Dopo aver spostato le piastre dal termostato alla cappa sterile, aggiungere 4 ml di privo di siero Rosewell Park Memorial Institute Medium (RPMI) per ogni piatto.
  5. Raccogliere le cellule con una sterile, pipetta motorizzato. Estrarre cellule contro il fondo della piastra, con la punta pressata a una leggera angolazione, per rompere le cellule. Ripetere più volte al fine di garantire un'adeguata separazione dei grumi di cellule, che altrimenti potrebbero intasare l'ago espulsione. Ricordare e trasferire in una provetta conica da 50 ml.
  6. Utilizzare un emocitometro per determinare la densità cellulare. Mantenere il numero totale di cellule B16-BL6 costante, determinare il volume di RPMI senza siero necessario per raggiungere concentrazioni finali di 0, 0,065, 0,015, 0,25 e 0,5 milioni di cellule / ml.
  7. Altrettanto un'aliquota media del tubo da 50 ml a 15 ml provette coniche. Centrifugare le provette coniche a 2.250 xg per 5 min. Decantare il supporto. Aggiungere un volume adeguato di RPMI senza siero e confermare la densità cellulare desiderato tramite emocitometro. Regolare densities- con l'aggiunta di ulteriore RPMI o filatura e risospensione in un volume- più piccolo di conseguenza.
  8. Aliquota 500 microlitridi ciascuna sospensione cellulare in etichettato 1,8 ml provette su ghiaccio.

3. Tail Vein Injection

  1. Prendere un topo, che si tiene per la coda, e guidarla posteriore prima nel dispositivo di immobilizzazione del mouse. Con il torso nella camera principale del dispositivo di immobilizzazione, con la coda fuori, tirare il mouse verso la fine del dispositivo di immobilizzazione. Inserire il dispositivo di immobilizzazione-stantuffo, continuando a spingere fino a quando il mouse è sicuro.
  2. Ruotare il mouse 90 gradi in modo che una delle vene coda laterale rivolta in alto. Usando un tampone di alcool, vigorosamente pulire il lato di coda del topo, in particolare quando la vena della coda è più visibile.
    Nota: Una buona illuminazione è essenziale per la coda efficace visualizzazione vena sul B57BL 6J /. lampade di calore o pastiglie chirurgia riscaldata, mentre non necessario, aiuterà anche aumentando il volume della vena della coda.
  3. In una cappa sterile cultura, raccogliere 300 ml di terreni di coltura delle cellule dal / tubo di 2 milioni di cellule ml. Invertire l'ago, sfogliando le side e spingendo lo stantuffo, per espellere le bolle dalla siringa. Estrarre coltura RPMI-tradursi in un volume finale di 250 microlitri.
  4. Estendere il mouse-coda con la mano non dominante. Tenere la coda con l'estremità prossimale della coda elevata con l'indice della mano non dominante, e la porzione distale della coda premuto con il pollice.
    Nota: In questo modo, la vena della coda viene tenuto in posizione laterale, parallelo alla superficie restrainer, con una voce congruente possibile nella parte più distale della coda.
  5. Inserire l'ago nella vena della coda, verso l'estremità distale, ad un angolo verso il basso minuti per cominciare, e quindi regolare l'ago per abbinare l'angolo della vena caudale dopo ulteriore inserimento (abbassamento fine stantuffo della siringa rispetto all'ago) .
  6. Inserire l'ago di circa 1 cm nel vena della coda. Dopo l'inserimento, iniziano a spingere lo stantuffo, tenendo l'ago costante.
    Nota: Se l'ago è in vena della coda e l'estremità dell'ago è not ostruito i media dovrebbero fluire senza ostacoli nella vena. iniezione efficace è caratterizzata da depurazione del sangue dalla vena. Se c'è resistenza, o una bolla inizia a formarsi il sito in iniezione, rimuovere l'ago e riprovare in una posizione più prossimale lungo la vena della coda.
  7. Rimuovere l'ago dalla vena e disfarsene. Tenere garza contro il sito di entrata per fermare le emorragie.
  8. Rimuovere lo stantuffo dalla restrainer e posizionare il mouse nella gabbia destinatario.
  9. Ripetere l'operazione per tutte le altre concentrazioni.
    Nota:. Lung stabilimento foci richiede circa 2 - 3 settimane, con variabilità a seconda della linea cellulare e la dimensione desiderata dei fuochi 9 Nel frattempo, i topi devono essere monitorati per sintomi che potrebbero giustificare l'eutanasia presto, come ansimante eccessivo.

4. Contare il polmone Foci

  1. Euthanize il mouse posizionando in una camera di CO 2 ed esponendo al 100% CO 2
  2. Splay il mouse sul polistirolo. Utilizzando forbici chirurgiche, creare una incisione chirurgica lungo lo sterno.
  3. Fare due incisioni aggiuntivi, sia dalla parte superiore dell'incisione sterno e ramificazione verso le spalle del mouse, esponendo la gabbia toracica.
  4. Fare due tagli, ciascuno lungo i lati laterali dello sterno, per rimuovere la gabbia toracica dal tronco, esponendo i polmoni e il cuore.
  5. Tenendo cuore con le pinzette chirurgiche, tagliare l'esofago e la trachea, liberando il cuore ei polmoni dal mouse. Mettere sotto un microscopio da dissezione, a 10X di ingrandimento, per una migliore visualizzazione.
  6. Sezionare cuore dai polmoni e rimuovere il timo, lasciando solo i due polmoni.
  7. Con i polmoni sotto un ambito dissezione, cominciare a contare i fuochi polmone. Ogni foci dovrebbe apparire come circolare, obtrusion marrone sulla superficie dei polmoni.
    1. Percoerenza tra topi, contare il numero di focolai sulla superficie di un lobo, e poi invertire tale lobo. Facendo ciascuno dei quattro lobi permette singolarmente per il conteggio più facile.
  8. Salvare e fissare i polmoni se l'esecuzione di IHC, in caso contrario, eliminare i resti.

Representative Results

Su ispezione visiva, la variazione foci superficie è evidente. Contando il numero di tumori sotto un microscopio da dissezione dovrebbe produrre una relazione lineare tra il numero di cellule tumorali iniettate e il numero di foci risultante e numerabile. Utilizzando un numero ottimale di cellule iniettabili, l'obiettivo è quello in cui i polmoni non sono completamente coperti, in quanto sono a 500.000 cellule / ml in figura 1A, e non troppo scarsamente coperte, come sono a 62.500 cellule / ml e 125.000 cellule / ml. Questo è anche quantificabile dalla correlazione lineare (Figura 1B).

Figura 1
Figura 1. Lung Foci risultante dalla vena della coda hanno iniettato cellule B16 / BL6. (A) foci polmone può essere visualizzata sulla superficie dei polmoni da C57BL / 6 topi come masse circolari marrone (foci rappresentante alle frecce). Come le tanelità della coltura cellulare iniettato (sopra ogni immagine) aumenta, così fa il corrispondente numero di focolai risultante polmone (sotto ogni immagine). I polmoni del mouse con la più alta densità di cellule iniettate ha la maggiore copertura visiva di foci del polmone. Barre di scala rappresentano 20 mm. (B) enumerazione dei fuochi polmone rispetto alla densità di coltura cellulare. Esiste una relazione approssimativamente lineare sopra 125.000 cellule / ml, come determinato da emocitometro. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Circolanti cellule tumorali da una iniezione coda vena rappresentare le metastasi che eludono i siti di crescita primaria e migrare attraverso percorsi come il sangue o il sistema linfatico, di tanto in tanto si stabilisce nei letti capillari di luoghi distanti. 14 Il protocollo sopra descritto serve da modello per la secondaria metastasi. Con un numero ottimale di cellule B16-BL6 iniettato, sperimentatori in grado di determinare l'effetto relativo di un farmaco somministrato o di una popolazione di cellule immunitarie, post-neutralizzazione, sulle metastasi delle cellule tumorali.

Questo protocollo ha limitazioni. Le cellule tumorali circolanti sono state selezionate per la loro capacità di metastatizzare e sono quindi non immunogenica, con livelli inferiori di maggiore di istocompatibilità di classe complessa 1 molecole. 12 Inoltre, l'introduzione improvvisa e cluster di gran numero di metastasi è diverso scenario tipico in pazienti dove un piccolo numero di cellule tumorali metastatichedissipare per un periodo prolungato di tempo dalla localizzazione del tumore primario. Inoltre, le cellule tumorali per via endovenosa introdotte sono da coltura tissutale e non di origine tumore primario. Pertanto, queste cellule sono a differenza delle metastasi secondarie che derivano da alterazioni nella adesione cellulare, la migrazione, il riconoscimento immunitario e stabilimento organo ricevente. 15,16

Un protocollo alternativo sarebbe l'iniezione sottocutanea di B16 / BL6 per la generazione di tumori primari e l'analisi delle risultanti metastasi polmonari "spontanee". Queste metastasi "spontanee" sono stati trovati per contenere più l'eterogeneità delle loro controparti "sperimentali", più strettamente corrispondono a quelli dei pazienti umani. Il protocollo è limitante nella sua capacità di determinare l'influenza di un composto sperimentale di metastasi. Con una laterale iniezione vena della coda, il numero di cellule di melanoma iniettato nel sangue può essere approssimata tramite hemocytometer. Con metastasi "spontanee", tuttavia, vi è una maggiore eterogeneità tra tumori, aggiungendo un'ulteriore variabile per il numero di foci risultante polmonare. 16

In conclusione, la B16-BL6 modello di melanoma murino vena della coda rappresenta un modello semplice per determinare l'influenza di un trattamento o immunoterapia in metastasi. In via endovenosa iniezione di cellule tumorali circolanti, i ricercatori possono replicare, in una certa misura, i pazienti post-metastasi. Considerando gli effetti distruttivi delle cellule tumorali metastatiche nei pazienti affetti da cancro, questo modello è un potente strumento per la comprensione del processo multistep di metastasi.

Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Supportato in parte da una sovvenzione del National Cancer Institute 1R03CA172923.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin Corning MT25052CV
RPMI 1640 Medium Corning MT15040CM
Phase Contraast Hemacytometer Hausser 02-671-54
Micro-Fine IV Insulin Syringes BD 14-829-1D
Sterile Alcohol Prep Pads Fisherbrand 22-363-750
Mouse Restrainer Braintree Scientific NC9999969 Restrainer choice depends on age/size of mice
Heating Pad Harry Schein NC0012697 Optional

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