Injektion av syngena murina melanomceller för att bestämma deras metastatisk potential i lungorna

Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Timmons, J. J., Cohessy, S., Wong, E. T. Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs. J. Vis. Exp. (111), e54039, doi:10.3791/54039 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Metastas är en viktig orsak till dödsfall hos patienter med maligniteter. Processen av metastaserad spridning av cancerceller är dåligt förstådd men tycks involvera flera steg, inklusive invasionen av angränsande vävnader, intravasering i lymfkärlen och kärl, överlevnad och translokation inom cirkulationssystemet, extravasering från kärlsystemet på platsen för metastaser, anpassning till den nya mikro av den nya webbplatsen, och kolonisering på den nya platsen genom proliferation och bildning av sekundära tumörer. 1 Var och en av dessa biologiska händelser innebär omvandling, spridning och överlevnad av metastaserande tumörceller. Till exempel, omvandlingen av den epiteliala fenotypen av tumörcellen in i en mesenkymal fenotyp, tillsammans med det framgångsrika interaktionen med den extracellulära matrisen, det möjligt för dem att invadera intilliggande vävnader och metastasera till andra delar av kroppen. 2,3 Vidare dessa metastatisk cellermåste överleva i det cirkulerande blodet och undvika immunkontroll från värden. 4,5 slutligen när de implanteras i en avlägsen plats i kroppen, måste tumörcellerna anpassar sig till sin mikro för att föröka sig och bilda sekundära tumörer. 6,7 Därför , även metastaser är ett vanligt fenomen bland cancerpatienter, metastaserande tumörceller har flera områden av sårbarhet som är mottagliga för terapeutisk intervention.

Med tanke på den immunogena karaktär melanom, och den senaste tidens intresse för immunterapier, modeller för melanom är allt bra. 8 I USA ensam, är melanom orsaken till uppskattningsvis 9.000 dödsfall per år. 9 Vanliga platser för melanom metastas är ben, hjärna , lever och lungor. Majoriteten av metastaser till avlägsna platser uppstår genom blodomloppet. Cirkulerande tumörceller i blodet måste undvika immun clearance, nå en kapillär bädd av en distal organ ochinvadera genom endotelcellerna i blodkärlet för att framgångsrikt etablera sig. 4-7,10, 11

Att efterlikna de gemensamma och virulent fenomen metastas, var murina B16-BL6 cellinje skapas. En avlidnes föräldra C57BL / 6 melanomcellinje B16-F0, är ​​B16-BL6 slutprodukten av 10 på varandra följande val för lungmetastaser från intravenös injektion (vilket resulterar i B16-F10), följt av 6 på varandra följande val för blåsmembranpenetration. 12 Som sådan, är det en pålitlig melanom cellinje för etablering av metastatiska härdar i musen, i synnerhet när det injiceras intravenöst. 13

Efter injektion av en tillräcklig mängd av B16-BL6-celler i svansvenen av en B57BL / 6 mus, följt av två eller flera veckor för att tillåta implantation och tillväxt av B16 / BL6-celler, kommer metastatiska härdar bildas i lungorna. Vid eutanasi och inspektion av dissekera mikroskop, antaletindividuell foci närvarande kan kvantifieras. Detta, i sin tur, kan användas för att etablera en dos-metastas effekt, eftersom antalet injicerade B16-BL6-celler korrelerar med antalet foci bildas på ytan av lungorna. Denna modell är känd som "experimentell metastas", där kända-metastaserande celler införs direkt in i blodomloppet, vilket underlättar en snabb och förutsägbar spridning och etablering i lungorna, levern eller andra organ för utredning. Detta står i kontrast till "spontan metastas", där tumörceller implanteras ofta subkutant och metastaser härröra från organiskt kasta cancerceller. 14,15

Det är viktigt att injicera en lämplig mängd B16 / BL6-celler in i svansvenerna hos mössen. Alltför många och lungorna kommer att täckas med metastaser och angränsande fokus kommer att vara omöjlig att skilja från varandra. Alltför få, och påverkan av ett terapeutiskt medel kommer att urskiljas på grund av inneboende Variheten mellan injektioner. För att erhålla ett optimalt antal foci på lungorna hos C57BL / 6-möss, är det nödvändigt att korrelera antalet injicerade celler med den mängd etablerade metastatiska härdar på ytan av lungorna samtidigt som hänsyn tas till distinguishability för individuellt foci. Detta protokoll kommer att visa en metastatisk murin melanom modell för C57BL / 6-möss.

Protocol

Etik uttalande: Användningen av möss i forskningen är endast acceptabelt i fall där det kan avancera mänsklig förståelse av grundläggande biologi eller mot en eventuell behandling av sjukdom.

1. Sortering

  1. Köp kvinnliga C57BL / 6-möss (ålder 6 - 8 veckor), 5 möss per grupp. Tillåt flera dagar för mössen att justera.

2. Framställning av B16-BL6-celler

  1. Avlägsna cellkulturplattor från 37-graders inkubator och placera i en steril huva. Plattorna bör vara cirka 70% sammanflytande med B16-BL6 murina melanomceller. En större sammanflödet kan förändra cellerna metastatisk potential.
  2. Tillsätt 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA per platta, låt sitta i en minut, och sedan aspirera lösningen trypsin-media.
  3. Tillsätt 1 ml trypsin per platta och returplattor till inkubatorn under 10 min.
  4. Efter att ha flyttat plattorna från inkubatorn till den sterila huven, tillsätt 4 ml serumfri Rosewell Park Memorial Institute MEDIUm (RPMI) till varje platta.
  5. Samla cellerna med en steril, motoriserad pipett. Mata ut celler mot botten av plattan, med spetsen pressas vid en mycket liten vinkel, för att bryta upp cellerna. Upprepa flera gånger för att säkerställa tillräcklig separering av cellklumpar, som annars skulle kunna täppa utstötningsnålen. Minnas och överför till en 50 ml koniska rör.
  6. Använda en hemocytometer för att bestämma celldensitet. Att hålla det totala antalet B16-BL6 celler konstant, bestämma volymen av serumfritt RPMI som krävs för att nå slutliga koncentrationer av 0, 0,065, 0,015, 0,25, och 0,5 miljoner celler / ml.
  7. Lika Alikvotera media i 50 ml rör till 15 ml koniska rör. Centrifugera koniska rör vid 2250 xg under 5 min. Häll media. Lägg en lämplig volym av serumfritt RPMI och bekräfta den önskade celltätheten via hemacytometer. Justera densities- genom att lägga till ytterligare RPMI eller spinning och återsuspendering i en mindre volym därefter.
  8. Alikvot 500 plav varje cellsuspension i märkta 1,8 ml rör på is.

3. injektion i svansvenen

  1. Ta en mus, som hölls i svansen, och vägleda den bakre först i musen rainer. Med bålen i huvudkammaren i restrainer, med svansen utanför det, dra musen mot slutet av som hindrar. Sätt in rainer-kolven, fortsätter att driva tills musen är säker.
  2. Rotera musen 90 grader, så att en av den laterala svansvenerna är vänd uppåt. Användning av en alkohol pad, kraftfullt rengöra sidan av musens svans, särskilt när svansvenen är mest synliga.
    Obs: Bra belysning är viktigt för effektiv svansvenen visualisering på B57BL / 6J möss. Värmelampor eller uppvärmd kirurgi dynor, medan inte nödvändigt, kommer också att hjälpa genom att öka volymen av svansvenen.
  3. I en steril kultur huva, samla 300 pl cellodlingsmedia från 2 miljoner celler / ml rör. Vänd nålen, snärta Side och skjuta in kolven, att mata bubblor från sprutan. Mata ut kultur-RPMI för att resultera i en slutlig volym av 250 | il.
  4. Förlänga mus-svans med icke-dominanta handen. Hålla svansen med den proximala änden av svansen förhöjda med pekfingret av den icke-dominanta handen, och den distala delen av svansen deprimerad med tummen.
    Obs: På detta sätt är svansvenen hålls i ett sidoläge, parallellt med restrainer yta, med en kongruent inträde möjligt i mer distala delen av svansen.
  5. För in nålen i svansvenen, mot den distala änden, med en ytterst liten nedåtriktad vinkel till att börja med, och sedan justera nålen för att matcha vinkeln på svansvenen vid ytterligare införing (sänka kolv änden av sprut i förhållande till nålen) .
  6. In nålen ca 1 cm i svansvenen. Efter insättning, börjar att skjuta kolven, håller nålen stadigt.
    Obs: Om nålen är i svansvenen och slutet av nålen är not hindras media ska flyta obehindrat in i venen. Effektiv injektion kännetecknas av clearance blod från venen. Om det finns motstånd, eller en bubbla börjar bildas på platsen i injektion, ta bort nålen och försök igen på en mer proximal plats längs svansvenen.
  7. Ta bort nålen från venen och kassera den. Håll kompress mot ingångsställe för att stoppa blödningen.
  8. Avlägsna kolven från restrainer och placera musen i det mottagande bur.
  9. Upprepa för alla andra koncentrationer.
    Anm. Lung fokus etablering tar ca 2-3 veckor, med variationer beroende på cellinje och önskad storlek av brännpunkterna 9 Under tiden mössen ska övervakas för symtom som skulle kunna motivera tidig eutanasi, som överdriven flämtande.

4. Räkna Lung Foci

  1. Euthanize musen genom att placera i en CO 2 kammare och exponering för 100% CO2
  2. Sära musen på frigolit. Genom att använda kirurgiska saxar, skapa ett kirurgiskt snitt längs bröstbenet.
  3. Gör ytterligare två snitt, både från toppen av bröstbenet snitt och förgrening mot axlarna av musen, exponera bröstkorgen.
  4. Göra två snitt, var och en längs de laterala sidorna av bröstbenet, för att ta bort bröstkorgen från bålen, utsätta lungorna och hjärtat.
  5. Håll hjärtat med kirurgisk pincett, klipp matstrupen och luftstrupen, befria hjärtat och lungorna från musen. Placera under ett dissektionsmikroskop, vid 10x förstoring, för bättre visualisering.
  6. Dissekera hjärtat från lungorna och avlägsna tymus, vilket innebär att endast de båda lungorna.
  7. Med lungorna nedanför en dissekera omfattning, börjar räkna lungan fokus. Varje foci bör visas som en cirkulär, brun påtvingande på ytan av lungorna.
    1. Församstämmighet mellan möss, räkna antalet fokus på ytan av en lob, och sedan vända den lob. Gör var och en av de fyra lober tillåter individuellt för lättare räkning.
  8. Spara och fixa lungorna om att utföra IHC, annars kasta resterna.

Representative Results

Vid visuell inspektion, är variationen i ytan härdar uppenbar. Räkna antalet tumörer under ett dissektionsmikroskop bör ge ett linjärt förhållande mellan antalet injicerade tumörcellerna och antalet resulterande och uppräknelig foci. Med hjälp av ett optimalt antal injicerbara celler, är målet en om lungorna inte är helt täckta, eftersom de är på 500.000 celler / ml i figur 1A, och inte alltför glest omfattas, eftersom de är på 62.500 celler / ml och 125.000 celler / ml. Detta är också kvantifieras genom linjär korrelation (Figur 1B).

Figur 1
Figur 1. Lung Foci Till följd av svansvenen injicerade B16 / BL6-celler. (A) Lung foci kan visualiseras på ytan av lungorna från C57BL / 6-möss som bruna cirkulära massorna (representant foci enligt pilarna). Som hålorten av den injicerade cellkultur (ovanför varje bild) ökar, så gör motsvarande antal resulterande lung foci (under varje bild). Lungorna från musen med den högsta tätheten av injicerade celler har den största visuella täckning av lung härdar. Skalstrecken representerar 20 mm. (B) Räkning av lungan foci i förhållande till cellodlingsdensitet. Det finns ungefär linjärt förhållande över 125.000 celler / ml, bestämt genom hemacytometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Cirkulerande tumörceller från en svansveninjektion representerar metastaser som kringgå områden av primär tillväxt och vandrar genom vägar som blodet eller lymfsystemet, ibland etablera sig i kapillära bäddar i avlägsna platser. 14 Protokollet som beskrivs ovan fungerar som en modell för sekundär metastaser. Med ett optimalt antal B16-BL6-celler injicerades, kan praktiker bestämma den relativa effekten av ett administrerat läkemedel eller immuncellpopulation, post-neutralisering, på cancercellmetastaser.

Detta protokoll har begränsningar. De cirkulerande tumörceller har valts ut för sin förmåga att metastasera och är därför icke-immunogen, med lägre nivåer av större histokompatibilitetskomplex klass 1-molekyler. 12 Vidare är den plötsliga och klustrade införandet av stort antal metastaser till skillnad från den typiska scenario i patienter där ett litet antal metastatiska tumörcellerskingra under en längre tid från den primära tumören plats. Dessutom är intravenöst införda tumörcellerna är från vävnadskultur och inte av en primär tumör ursprung. Därför är dessa celler är till skillnad från de sekundära metastaser som är resultatet av förändringar i cellvidfästning, migration, immunigenkänning och mottagare organ etablering. 15,16

Ett alternativt protokoll skulle vara subkutan injektion av B16 / BL6 för generering av primära tumörer och analysen av de resulterande "spontana" lungmetastaser. Dessa "spontana" metastaser har visat sig innehålla mer heterogenitet än deras "experimentella" motsvarigheter, närmare matchar de humanpatienter. Protokollet är begränsande i dess förmåga att bestämma inverkan av en experimentell förening på metastas. Med en lateral injektion svansvenen, kan antalet melanomceller injicerade i blodomloppet approximeras via hemocytometer. Med "spontan" metastas, men det är större heterogenitet mellan tumörer, lägga till ytterligare en variabel till antalet erhållna lung härdar. 16

Sammanfattningsvis representerar svansvenen B16-BL6 murint melanom modell en enkel modell för bestämning av inverkan av en behandling eller immunterapi på metastaser. Genom att intravenöst injicera cirkulerande tumörceller, kan forskare replikera, i viss utsträckning, patienter efter metastas. Med tanke på de destruktiva effekterna av metastaserande tumörceller i cancerpatienter, är denna modell ett kraftfullt verktyg för att förstå flerstegsprocess av metastaser.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Stöds delvis av en National Cancer Institute bidrag 1R03CA172923.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin Corning MT25052CV
RPMI 1640 Medium Corning MT15040CM
Phase Contraast Hemacytometer Hausser 02-671-54
Micro-Fine IV Insulin Syringes BD 14-829-1D
Sterile Alcohol Prep Pads Fisherbrand 22-363-750
Mouse Restrainer Braintree Scientific NC9999969 Restrainer choice depends on age/size of mice
Heating Pad Harry Schein NC0012697 Optional

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
  2. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119, (6), 1420-1428 (2009).
  3. Stetler-Stevenson, W. G., Aznavoorian, S., Liotta, L. A. Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis. Annu Rev Cell Biol. 9, 541-573 (1993).
  4. Allard, W. J., Matera, J., Miller, M. C., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant disease. Clin Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
  5. Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., et al. Cancer immunoediting: from iimmunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol. 3, 991-998 (2002).
  6. Hugo, H., Ackland, M. L., Blick, T., et al. Epithelial-mesenchymal and mesenchymal-epithelial transition in carcinoma progression. J Cell Physiol. 213, 374-383 (2007).
  7. Kang, Y., Massague, J. Epithelial-mesenchymal transitions: Twist in development and metastasis. Cell. 118, 277-279 (2004).
  8. Hodi, S. F., et al. Improved survival with Ipilimumab in patients with metastatic melanoma. NEJM. 363, (13), 711-723 (2002).
  9. Ekwueme, D. U., Guy, G. P., Li, C., Rim, S. H., Parelkar, P., Chen, S. C. The health burden and economic costs of cutaneous melanoma motality by race/ethnicity-United States. J. Am. Acad. Dermatol. 65, 5 Supple 1 133-143 (2011).
  10. Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumor. Bio.Volume. 35, 8483-8523 (2014).
  11. Weinberg, R. A. Is metastasis predetermined. Mol. Oncol. 1, (3), 263-264 (2007).
  12. Ishiguro, T., Nakajima, M., Naito, M., Muto, T., Tsuruo, T. Identification of genes differentially expressed in B16 murine melanoma sublines with different metastatic potentials. Cancer Res. 56, (4), 875-879 (1996).
  13. Clark, E. A., Todd, R. G., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406, 532-535 (2000).
  14. Terranova, V. P., Hic, S., Diflorio, R. M., Lyall, R. M. Tumor cell metastasis. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 5, (2), 87-114 (1986).
  15. Elkin, M., Vlodavsky, I. Tail vein assay of cancer metastasis. Curr Protoc in Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.2 (2001).
  16. Hagedorn, H. G., Bachmeier, B. E., Nerlich, A. G. Synthesis and degradation of basement membranes and extracellular matrix and their regulation by TGF-beta in invasive carcinomas (Review). Int. J. Oncol. 18, (4), 669-681 (2001).
  17. Hart, I. The selection and characterization of an invasive variant of the B16 melanoma. Am J Pathol. 97, (3), 587-600 (1979).
  18. Overwijk, W. W., Restifo, N.P. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma. Curr Protoc Immunol. 20, (1), (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics