Injeção de células Singênico Murino melanoma para determinar o seu potencial metastático nos pulmões

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Timmons, J. J., Cohessy, S., Wong, E. T. Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs. J. Vis. Exp. (111), e54039, doi:10.3791/54039 (2016).

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Abstract

Introduction

A metástase é uma das principais causas de morte entre os pacientes com doenças malignas. O processo de disseminação metastática de células cancerosas é mal compreendida, mas parece envolver vários passos, incluindo a invasão de tecidos adjacentes, intravasamento no sistema linfático e na vasculatura, a sobrevivência e a translocação dentro do sistema circulatório, o extravasamento a partir da vasculatura no local de metástases, adaptação para o novo microambiente do novo local, e colonização no novo local por proliferação e formação de tumores secundários 1. Cada um destes eventos biológicos envolvem a transformação, a difusão e a sobrevivência de células tumorais metastáticas. Por exemplo, a transformação do fenótipo epitelial da célula tumoral para um fenótipo mesenquimal, juntamente com a interacção bem sucedida com a matriz extracelular, permitir-lhes invadir tecidos adjacentes e metastizar para outras partes do corpo. 2,3 Além disso, estes metastático célulasdeve sobreviver dentro da corrente sanguínea circulante e escapar à vigilância imunitária do hospedeiro. 4,5 Finalmente, quando implantados num local distante dentro do corpo, as células tumorais têm de se adaptar ao seu microambiente, a fim de proliferar e formar tumores secundários. 6,7 Portanto , embora a metástase é um fenômeno comum entre pacientes com câncer, as células tumorais metastáticas ter várias áreas de vulnerabilidade que são passíveis de intervenção terapêutica.

Dada a natureza imunogênica de melanoma, eo recente interesse em imunoterapias, os modelos de melanoma são cada vez mais útil. 8 Nos Estados Unidos sozinho, o melanoma é a causa de um número estimado de 9.000 mortes por ano. 9 locais mais comuns de metástase de melanoma são ossos, cérebro , fígado e pulmões. A maioria das metástases para locais distantes ocorrer através da corrente sanguínea. Circulating células tumorais no sangue deve escapar depuração imunológica, chegar a um leito capilar de um órgão distai einvadem através das células endoteliais do vaso sanguíneo, de modo a estabelecer-se com sucesso. 4-7,10, 11

Para imitar os fenómenos comuns e virulentas de metástase, a linha celular B16-BL6 murino foi criado. Um falecido da linha parental C57BL / 6 de células de melanoma B16-F0, B16-BL6 é o produto final de 10 sucessivas selecções para a metástase do pulmão a partir da injecção intravenosa (resultando em B16-F10), seguido por 6 selecções sucessivas para a penetração da membrana da bexiga. 12 Como tal, é uma linha celular de melanoma de confiança para a criação de focos metastáticos no rato, particularmente quando injectado por via intravenosa. 13

Após a injecção de uma quantidade suficiente de B16-BL6 células na veia da cauda de um rato B57BL 6 /, seguido por duas ou mais semanas para permitir a implantação e o crescimento das células B16 / BL6, focos metastáticos formará nos pulmões. Após a eutanásia e inspeção por microscopia dissecando, o número deindivíduo focos presente pode ser quantificada. Este, por sua vez, pode ser utilizado para estabelecer um efeito de dose-metástase, como o número de células B16-BL6 injectadas correlaciona-se com o número de focos formados na superfície dos pulmões. Este modelo é conhecido como "metástase experimental", onde as células conhecidas-metastático são introduzidos directamente na corrente sanguínea, o que facilita uma disseminação e estabelecimento rápida e previsível nos pulmões, no fígado, ou outro órgão de investigação. Isto está em contraste com a "metástase espontânea", onde as células tumorais são implantados, muitas vezes por via subcutânea, e metástases originam organicamente produzir células tumorais 14,15.

É importante para injectar uma quantidade apropriada de células B16 / BL6 nas veias da cauda dos ratinhos. Muitos, e os pulmões será coberto com metástases e focos vizinhos, serão indistinguíveis uns dos outros. Muito poucos, e a influência de um agente terapêutico será imperceptível devido à vari inerenteções entre as injecções. A fim de obter um número óptimo de focos nos pulmões dos ratinhos C57BL / 6, que é necessário para correlacionar o número de células injectadas com a quantidade de focos metastáticos estabelecida na superfície dos pulmões, tendo em conta o distinguishability do indivíduo focos. Este protocolo irá demonstrar um modelo de melanoma metastático de murino para murganhos C57BL / 6.

Protocol

Declaração de Ética: O uso de camundongos em pesquisa só é aceitável em casos em que pode avançar a compreensão humana da biologia fundamental ou para a eventual tratamento da doença.

1. Ordenação

  1. Compra fêmea C57BL / 6 murganhos (idade de 6 - 8 semanas), 5 ratinhos por grupo. Permitir vários dias para os ratos para se ajustar.

2. Preparação de células B16-BL6

  1. Remover placas de cultura de células de incubadora a 37 graus e coloque em uma capa estéril. As placas devem ser de aproximadamente 70% confluente com células de melanoma murino B16-BL6. Uma maior confluência as células podem alterar o potencial metastático.
  2. Adicionar 1 ml de 0,05% de tripsina-EDTA por placa, deixar repousar durante 1 min, e depois aspirar a solução de tripsina-media.
  3. Adicionar 1 ml de tripsina por placa e retornar as placas ao incubador durante 10 min.
  4. Depois de mover as placas da incubadora para a capa estéril, adicionar 4 ml de livre de soro Rosewell Park Memorial Institute Medium (RPMI) para cada placa.
  5. Coletar as células com uma pipeta estéril, motorizada. Ejectar as células contra a parte inferior da placa, com a ponta pressionado em um muito ligeiro ângulo, para romper as células. Repetir várias vezes a fim de assegurar uma separação adequada de aglomerados de células, o que pode de outro modo entupir a agulha de ejecção. Lembrar e transferir para um tubo de 50 ml.
  6. Usar um hemocitómetro para determinar a densidade celular. Mantendo o número total de células B16-BL6 constante, determinar o volume de meio RPMI isento de soro necessária para atingir concentrações finais de 0, 0,065, 0,015, 0,25, e 0,5 milhões de células / ml.
  7. Igualmente Alíquota da mídia no tubo de 50 ml a 15 ml tubos cônicos. Centrifugar os tubos cónicos de 2250 xg durante 5 min. Decantar a mídia. Adicionar um volume apropriado de meio RPMI isento de soro e confirmar a densidade de células desejada através hemacitómetro. Ajustar densities- adicionando RPMI adicional ou fiação e ressuspensão num volume- menor em conformidade.
  8. Alíquota de 500 ulde cada suspensão de células marcadas em 1,8 ml de tubos em gelo.

3. Cauda injecção na veia

  1. Tome um rato, realizada pela cauda, ​​e guiá-lo traseira pela primeira vez no restrainer mouse. Com o tronco na câmara principal do limitador, com a cauda do lado de fora, retirar o rato para o fim do limitador. Insira o restrainer-êmbolo, continuando a empurrar até que o mouse é segura.
  2. Rodar o rato 90 graus de modo a que uma das veias lateral da cauda esteja voltada para cima. Usando uma compressa embebida em álcool, limpar vigorosamente o lado da cauda do rato, em particular quando a veia da cauda é mais visível.
    Nota: Uma boa iluminação é essencial para visualização veia da cauda eficaz sobre B57BL / 6J. Lâmpadas de calor ou almofadas cirurgia aquecida, embora não necessário, também vai ajudar a aumentar o volume da veia da cauda.
  3. Num capuz de cultura estéril, recolher 300 uL de meio de cultura celular a partir do tubo de 2 milhões de células / ml. Inverta a agulha, sacudindo as sIDE e empurrando o êmbolo, para ejectar bolhas a partir da seringa. Ejectar cultura RPMI-a resultar num volume final de 250 ul.
  4. Estender o rato-cauda com a mão não-dominante. Segurar a cauda com a extremidade proximal da cauda elevada com o dedo indicador da mão não-dominante, e a parte distai da cauda deprimido com o polegar.
    Nota: Neste modo, a veia da cauda é mantido numa posição lateral, paralela à superfície do limitador, com uma entrada congruente possível na parte mais distante da cauda.
  5. Inserir a agulha na veia da cauda, ​​no sentido da extremidade distai, com um ângulo descendente minutos para começar, e, em seguida, ajustar a agulha para corresponder ao ângulo da veia da cauda, ​​após nova inserção (baixando extremidade do êmbolo do parente de uma seringa à agulha) .
  6. Inserir a agulha de aproximadamente 1 cm na veia da cauda. Após a inserção, começam a empurrar o êmbolo, que prende a agulha constante.
    Nota: Se a agulha se encontra na veia da cauda e a extremidade da agulha é not obstruído os meios de comunicação deve fluir sem obstáculos na veia. injecção eficaz é caracterizada por depuração do sangue a partir da veia. Se houver resistência, ou uma bolha começa a formar no local da injecção em, remover a agulha e tentar de novo numa localização mais proximal ao longo da veia da cauda.
  7. Retire a agulha da veia e descartá-lo. Segure gaze contra o local de entrada para evitar qualquer sangramento.
  8. Retirar o êmbolo a partir do limitador e colocar o rato na gaiola destinatário.
  9. Repita o procedimento para todas as outras concentrações.
    Nota:. Lung estabelecimento focos demora cerca de 2-3 semanas, dependendo da variabilidade da linha celular e a dimensão desejada dos focos 9 No entretanto, os murganhos devem ser monitorizados quanto a sintomas que foram sacrificados no início, como ânsia excessiva.

4. Contando o Lung Focos

  1. Euthanize o mouse, colocando em uma câmara de CO 2 e expondo a 100% CO 2
  2. Afunilar o mouse em isopor. Usando uma tesoura cirúrgica, criar uma incisão cirúrgica ao longo do esterno.
  3. Fazer duas incisões adicionais, tanto da parte superior do esterno e incisão de ramificação para os ombros do rato, expondo a caixa torácica.
  4. Fazer dois cortes, cada um ao longo dos lados laterais do esterno, para remover a caixa torácica a partir do tronco, expondo os pulmões e coração.
  5. Segurando o coração com pinças cirúrgicas, corte o esôfago e traquéia, liberando o coração e os pulmões do mouse. Colocar sob um microscópio de dissecação, a 10X de ampliação, para melhor visualização.
  6. Dissecar o coração dos pulmões e remover o timo, deixando apenas os dois pulmões.
  7. Com os pulmões sob um escopo de dissecação, começa a contar o focos de pulmão. Cada focos deve aparecer como uma obstrução ao fluxo circular, Brown na superfície dos pulmões.
    1. Paraconsistência entre ratos, contar o número de focos na superfície de um lobo, e depois inverta que lóbulo. Fazendo cada um dos quatro lobos permite individualmente para contagem mais fácil.
  8. Salvar e corrigir os pulmões se realizar IHC, caso contrário, descarte os restos.

Representative Results

Após a inspecção visual, a variação nos focos superfície é evidente. Contar o número de tumores sob um microscópio de dissecação deve produzir uma relação linear entre o número de células tumorais injectadas e o número de focos e resultando contáveis. A utilização de um número óptimo de células injectáveis, o objectivo é aquele em que os pulmões não são completamente coberto, uma vez que são em 500.000 células / ml na Figura 1A, e não muito escassamente coberto, uma vez que são em 62.500 células / ml e 125.000 células / ml. Isto também é quantificável por correlação linear (Figura 1B).

figura 1
Figura 1. Lung Focos Resultante da veia da cauda injetaram células B16 / BL6. (A) Pulmão focos pode ser visualizado na superfície dos pulmões de ratinhos C57BL / 6 como massas circulares castanhos (focos representativa sob setas). Como as covasdade da cultura de células injetadas (acima de cada imagem) aumenta, o mesmo acontece com o número correspondente de resultante focos de pulmão (abaixo de cada imagem). Os pulmões do rato com a maior densidade de células injetadas tem a maior cobertura visual de focos de pulmão. As barras de escala representam 20 mm. (B) enumeração dos focos de pulmão em relação à densidade da cultura celular. Existe uma relação aproximadamente linear acima de 125.000 células / ml, conforme determinado pelo hemocitômetro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Circulating células tumorais a partir de uma injecção na veia da cauda representam as metástases que escapam locais de crescimento primário e migrar através de vias como a corrente sanguínea ou no sistema linfático, ocasionalmente, estabelecendo-se nos leitos capilares de locais distantes. 14 O protocolo descrito acima serve como um modelo para secundário metástases. Com um número óptimo de células B16-BL6 injectadas, experimentadores pode determinar o efeito relativo de um fármaco administrado ou população de células imune, pós-neutralização, sobre a metástase de células de cancro.

Este protocolo tem limitações. As células tumorais em circulação foram seleccionados pela sua capacidade para metastizar e são, por conseguinte, não imunogénico, tendo baixos níveis de histocompatibilidade principal de classe 1 do complexo moléculas. 12 Além disso, a introdução súbita e agrupado de grande número de metástases é ao contrário do cenário típico em pacientes em que um pequeno número de células tumorais metastáticasdissipam ao longo de um período de tempo prolongado a partir do local do tumor primário. Além disso, as células tumorais são introduzidos por via intravenosa, a partir de cultura de tecidos e não de uma origem do tumor primário. Por isso, estas células são ao contrário das metástases secundárias, que resultam de alterações na adesão celular, a migração, o reconhecimento imunológico e estabelecimento órgão destinatário 15,16.

Um protocolo alternativo seria a injecção subcutânea de células B16 / BL6 para a geração de tumores primários e a análise dos resultantes metástases pulmonares "espontâneas". Essas metástases "espontâneos" foram encontrados para conter mais heterogeneidade do que suas contrapartes "experimentais", combinando mais de perto aqueles de pacientes humanos. O protocolo está a limitar na sua capacidade para determinar a influência de um composto experimental em metástase. Com uma injecção na veia lateral da cauda, ​​o número de células de melanoma injectado na corrente sanguínea pode ser aproximada através hemocytometer. Com metástase "espontânea", no entanto, existe uma maior heterogeneidade entre tumores, adicionando uma variável adicional para o número de focos resultante pulmão. 16

Em conclusão, o modelo de melanoma murino B16-BL6 veia da cauda representa um modelo simples para determinar a influência de um tratamento de imunoterapia ou de metástase. Por via intravenosa injecção de células tumorais em circulação, os investigadores podem replicar, em certa medida, os pacientes pós-metástase. Considerando os efeitos destrutivos de células tumorais metastáticas a os doentes com cancro, este modelo é uma ferramenta poderosa para a compreensão do processo de passos múltiplos de metástases.

Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Apoiado em parte por uma concessão do National Cancer Institute 1R03CA172923.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin Corning MT25052CV
RPMI 1640 Medium Corning MT15040CM
Phase Contraast Hemacytometer Hausser 02-671-54
Micro-Fine IV Insulin Syringes BD 14-829-1D
Sterile Alcohol Prep Pads Fisherbrand 22-363-750
Mouse Restrainer Braintree Scientific NC9999969 Restrainer choice depends on age/size of mice
Heating Pad Harry Schein NC0012697 Optional

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