उठना, स्तन कैंसर मेटास्टेसिस के एक orthotopic माउस मॉडल

Medicine

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Summary

एक orthotopic स्तन कैंसर के प्राथमिक ट्यूमर मॉडल और प्राथमिक ट्यूमर के सर्जिकल हटाने माउस जीवन का विस्तार करने के लिए सहज मेटास्टेसिस उत्पन्न करने के लिए वर्णित हैं। ट्यूमर के विकास और प्रगति पर नजर रखी और luciferase प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा मात्रा रहे हैं।

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Paschall, A. V., Liu, K. An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (114), e54040, doi:10.3791/54040 (2016).

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Abstract

मेटास्टेसिस स्तन कैंसर के रोगियों की मृत्यु का प्रमुख कारण है। तंत्र स्तन कैंसर मेटास्टेसिस सहित कैंसर सेल मेटास्टेसिस, अंतर्निहित, काफी हद तक अनजान है और कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में ध्यान केंद्रित है। विभिन्न स्तन कैंसर सहज मेटास्टेसिस माउस मॉडल स्थापित किया गया है। यहाँ, हम एक सरलीकृत प्रक्रिया ओर्थोटोपिक प्रत्यारोपित स्तन कैंसर के प्राथमिक ट्यूमर की स्थापना और सहज मेटास्टेसिस कि मानव स्तन कैंसर मेटास्टेसिस नकल परिणामी को रिपोर्ट करते हैं। bioluminescence लाइव ट्यूमर इमेजिंग के साथ संयुक्त, इस माउस मॉडल ट्यूमर के विकास और प्रगति कैनेटीक्स और निगरानी की मात्रा निर्धारित किया जा करने के लिए अनुमति देता है। इस मॉडल में, 4T1 ल्यूक स्तन कैंसर की कोशिकाओं के एक कम खुराक (1 x 10 4 कोशिकाओं) एक ट्यूबरकुलीन सिरिंज का उपयोग BALB / ग माउस स्तन वसा पैड में इंजेक्ट किया गया था। चूहे luciferin के साथ इंजेक्शन और एक bioluminescent इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर विभिन्न बिंदुओं पर समय imaged थे। प्राथमिक ट्यूमर IACUC अनुमोदित प्रोटोकॉल के रूप में आकार सीमित करने के लिए बढ़ी जब (approximately 30 दिन), चूहों 2% isoflurane और ऑक्सीजन के निरंतर प्रवाह के तहत anesthetized थे। ट्यूमर क्षेत्र में 70% इथेनॉल के साथ निष्फल किया गया था। ट्यूमर के आसपास माउस त्वचा ट्यूमर जो बाँझ कैंची की एक जोड़ी के साथ हटा दिया गया था बेनकाब करने के लिए अलग किया गया। प्राथमिक ट्यूमर को हटाने के एक महीने के लिए 4T-1 ट्यूमर असर चूहों के अस्तित्व फैली हुई है। चूहों फिर बार बार metastatic ट्यूमर दूर अंगों को फैलाने के लिए imaged थे। चिकित्सीय एजेंट इस बिंदु पर ट्यूमर मेटास्टेसिस को दबाने के लिए प्रशासित किया जा सकता है। इस मॉडल को सरल और प्राथमिक साइट और दूर के अंगों को प्रगति कैनेटीक्स में स्तन कैंसर सेल के विकास को बढ़ाता में अभी तक संवेदनशील है, और इस तरह, और vivo में विरोधी मेटास्टेसिस चिकित्सीय और immunotherapeutic एजेंटों के परीक्षण के लिए स्तन कैंसर के विकास और प्रगति के अध्ययन के लिए एक शानदार मॉडल है ।

Introduction

अमेरिकन कैंसर सोसायटी के अनुसार, स्तन कैंसर के सबसे अधिक बार निदान संयुक्त राज्य अमेरिका में महिलाओं में कैंसर का रूप है। हाल ही में विकसित लक्षित चिकित्सा के साथ संयोजन में जल्दी पता लगाने में काफी पिछले दो दशकों में स्तन कैंसर की मृत्यु दर में कमी आई है। हालांकि, अभी भी स्तन कैंसर यूनाइटेड स्टेट्स 1 में महिलाओं में कैंसर से संबंधित मौत का दूसरा प्रमुख कारण है। स्तन कैंसर के रोगियों की मौत के बहुमत ट्यूमर सेल मेटास्टेसिस के कारण हैं। दुर्भाग्य से, अधिकांश स्तन कैंसर के आक्रामक है और अक्सर हड्डी, फेफड़े, जिगर और मस्तिष्क सहित दूर अंगों को लिम्फ नोड के लिए metastasizes और बाद में। 1,2 वर्तमान में metastatic स्तन कैंसर के लिए कोई प्रभावी उपचार नहीं है। इसलिए, कीमोथेरेपी और immunotherapeutic एजेंटों के विकास को दबाने के लिए metastatic स्तन कैंसर बहुत महत्व का है।

विभिन्न स्तन कैंसर सहज मेटास्टेसिस माउस मॉडल ख हैeen स्तन ट्यूमर सेल प्रगति और मेटास्टेसिस और चिकित्सीय एजेंट के विकास के लिए मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए विकसित की है। 1,3-5 हालांकि, इन माउस मॉडल की सबसे आनुवंशिक ट्यूमर मॉडल हैं कि, जबकि यंत्रवत के लिए उत्कृष्ट मॉडल अध्ययन, चिकित्सीय एजेंट का परीक्षण, के बाद से मेटास्टेसिस महीने लग जाते हैं इन आनुवंशिक मॉडल में विकसित करने के लिए जिससे विरोधी कैंसर एजेंटों के महंगा लंबे समय तक प्रशासन की आवश्यकता के लिए उपयुक्त नहीं हैं। लाइव चूहों में 6.7 निगरानी ट्यूमर प्रगति भी तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। इसके विपरीत, एक प्रत्यारोपित स्तन कैंसर मेटास्टेसिस मॉडल अल्पावधि ट्यूमर प्रगति और जीने चूहों में ट्यूमर प्रगति के आसान पर नज़र रखने के फायदे हैं। 4T1 ओर्थोटोपिक स्तन कैंसर सहज मेटास्टेसिस माउस मॉडल इस तरह के एक प्रत्यारोपित ट्यूमर मॉडल। 8 इस मॉडल में है, स्तन ट्यूमर कोशिकाओं प्राथमिक ट्यूमर पिंड की स्थापना के लिए स्तन वसा पैड में प्रत्यारोपित किया जाता है। प्राथमिक ट्यूमरतब शल्य चिकित्सा द्वारा मानव स्तन कैंसर के रोगियों के रूप में हटाया जा सकता है। 4T1 ट्यूमर कोशिकाओं को अत्यधिक आक्रामक हैं। 8,9, 3,10 लगभग सभी ट्यूमर असर चूहों स्तन वसा पैड में ट्यूमर प्रत्यारोपण के बाद 30 दिनों में मेटास्टेसिस का विकास। हालांकि, 4T1 ट्यूमर प्राथमिक साइटों में आक्रामक तरीके से आगे बढ़ने और ट्यूमर के आकार अक्सर सीमा यह है कि ज्यादातर पशु प्रोटोकॉल में अनुमति दी जाती है से अधिक है। इस स्तर पर, मेटास्टेसिस अक्सर micrometastases हैं। इसलिए, यह चिकित्सीय एजेंट के परीक्षण के लिए मेटास्टेसिस प्रगति अनुमति देने के लिए प्राथमिक ट्यूमर को दूर करने के लिए आवश्यक है। यहाँ, हम प्राथमिक ट्यूमर प्रत्यारोपण, प्राथमिक ट्यूमर और 4T1 ट्यूमर के विकास और इन विवो में प्रगति की bioluminescence इमेजिंग आधारित मात्रा का ठहराव के सर्जिकल हटाने के लिए एक सरल और अभी तक संवेदनशील प्रक्रिया की स्थापना की रिपोर्ट।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं के दिशा निर्देशों और जॉर्जिया राज्य प्रतिनिधियों विश्वविद्यालय पशु उपयोग और देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का पालन करें।

1. Orthotopic स्तन कैंसर ट्यूमर की स्थापना

  1. प्रयोग से पहले एक दिन, संस्कृति लगभग 10 मिलीलीटर RPMI माध्यम में एक 10 सेमी संस्कृति डिश में 2 एक्स 10 6 4T1 ल्यूक ट्यूमर कोशिकाओं को 10% FBS युक्त। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में संस्कृति पकवान सेते हैं और 5% सीओ 2।
  2. ट्यूमर सेल इंजेक्शन के दिन, वैक्यूम के साथ संस्कृति पकवान से संस्कृति के माध्यम से हटाने के लिए, 5 मिलीलीटर बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), संस्कृति डिश के लिए 7.4 पीएच जोड़ने के लिए, और धीरे संस्कृति सतह धोने के लिए पकवान हिला, पीबीएस को दूर वैक्यूम द्वारा।
  3. 2 मिलीलीटर trypsin EDTA (0.05% trypsin और 0.53 मिमी EDTA) संस्कृति पकवान में जोड़ने के बारे में 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ 2 इनक्यूबेटर में यह सेते हैं। सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं संस्कृति डिश के नीचे से अलग कर रहे हैं बनाने के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप पर कोशिकाओं की जाँच करें। </ Li>
  4. लगभग आरटी पर 3 मिनट के लिए 450 XG कोशिकाओं को एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए 8 मिलीलीटर सीरम युक्त मध्यम, स्थानांतरण कोशिकाओं जोड़कर trypsin बुझाने।
  5. 10 मिलीलीटर पीबीएस में निर्वात और resuspend कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला निकालें। अपकेंद्रित्र कोशिकाओं में लगभग 450 3 मिनट के लिए XG। वैक्यूम द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें, और 10 मिलीलीटर पीबीएस में कोशिकाओं resuspend।
  6. पिपेट कांच कवर के तहत एक hemocytometer पर सेल निलंबन के 10 μl। सेल एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए कोशिकाओं की गणना। 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं / एमएल HBSS के घनत्व पर पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend। एक 1.5 मिलीलीटर बाँझ microfuge ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण और उपयोग करें जब तक बर्फ पर कोशिकाओं रहते हैं।
  7. ट्यूमर सेल इंजेक्शन के लिए 8 सप्ताह - 6 की महिला BALB / ग चूहों का प्रयोग करें।
    1. निप्पल # 3 आसपास के एक इलेक्ट्रॉनिक बाल trimmer का उपयोग कर के पास बाल दाढ़ी। स्तन ग्रंथि 3 वसा पैड में 4T1 सेल के इंजेक्शन reproducibly फेफड़ों मेटास्टेसिस उत्पन्न करता है। कपास झाड़ू 70% ethano में डूबा का उपयोग करके मुंडा क्षेत्र को साफएल। 3 बार - microcentrifuge ट्यूब 2 inverting द्वारा कोशिकाओं Resuspend। धीरे महाप्राण एक आधा सीसी 27 जी 1/2 ट्यूबरकुलीन सिरिंज में सेल निलंबन के 50 μl।
    2. एक BALB / ग माउस का # 3 स्तन ग्रंथि के तहत स्तन वसा पैड में ट्यूमर कोशिकाओं इंजेक्षन। एक साफ पिंजरे में माउस प्लेस और पशु आवास की सुविधा के लिए पिंजरे वापसी। लगभग रुको 21 - ट्यूमर के विकास के लिए 30 दिनों के लिए। ट्यूमर के विकास को ट्यूमर की पढ़ाई के लिए संस्था की नीतियों के प्रति के रूप में एक नियमित आधार पर निगरानी की जानी चाहिए।

2. लाइव माउस Bioluminescence ट्यूमर के विकास की इमेजिंग

  1. हर 3 दिन इमेजिंग की सुविधा के लिए ट्यूमर इंजेक्शन स्थानांतरण चूहों के बाद छवि चूहों। प्रायर इमेजिंग के लिए चूहों को 100 μl luciferin (30 मिलीग्राम / पीबीएस में एमएल) intraperitoneally (आईपी) इंजेक्षन। बाद लगभग 10 मिनट, 2% isoflurane / हे 2 प्रवाह के साथ एक प्रेरण कक्ष में चूहों anesthetize। माउस के पैर छूने के लिए संदंश का प्रयोग करें। स्पर्श करने के लिए कोई जवाब नहीं था इस बात की पुष्टिमाउस टी पूरी तरह से बेहोश है।
    1. 2 एल / मिनट की एक प्रवाह दर पर निरंतर 2% isoflurane और ओ 2 के साथ इमेजिंग कक्ष में चूहों रखें। जगह माउस ऐसी है कि ब्याज की क्षेत्र (यानी, प्रारंभिक ट्यूमर इंजेक्शन की स्तन पैड) इमेजिंग प्रणाली का कैमरा चेहरे। नाक सुनिश्चित करें और माउस के मुंह मजबूती से संवेदनाहारी ट्यूबिंग के भीतर स्थापित कर रहे हैं। पशु संस्था में पशु चिकित्सा मानकों के अनुसार anesthetized किया जाना चाहिए।
  2. विभिन्न जोखिम समय की एक सरणी के साथ bioluminescence इमेजिंग मोल। उदाहरण के लिए, जोखिम से 30, देखने के क्षेत्र (FOV) से 25, वस्तु ऊंचाई 1.5 सेमी करने के लिए सेट, और कम बिजली की एक्स-रे के साथ luminescent फोटो छवियों प्राप्त करते हैं। करने के लिए माप की इकाइयों को निर्धारित "चमक।"
    1. लगभग 2.4 10 x 7 चमक इकाइयों के एक अधिकतम के साथ एक स्वचालित रैखिक रंग रेंज का प्रयोग करें। प्रारंभिक छवियों को प्राप्त करने के बाद, सेटिंग्स को समायोजित करने और एक अनुकूलित छवि प्राप्त (चित्राएस 3 और 4)।
  3. चूहों पिंजरों को साफ और चूहों आवास की सुविधा के लिए जानवरों के लौटने से पहले ambulation के साथ होश में आने सुनिश्चित करने के लिए लौटें।
  4. इमेजिंग साधन के साथ जुड़े रहने वाले इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का विश्लेषण। एक इमेजिंग प्रोग्राम का उपयोग करना, ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र के आसपास एक संलग्न रेखा खींचना। रॉय की चमक तीव्रता का निर्धारण करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें। रिकॉर्ड प्रत्येक माउस के लिए प्रत्येक रॉय के रिश्तेदार तीव्रता।
    नोट: माध्यमिक चमक तीव्रता luminescent कोशिकाओं का अधिक से अधिक स्तर है, और इस प्रकार अधिक से अधिक ट्यूमर के विकास का संकेत मिलता है।
  5. दिखने में माउस की जांच प्रतिकूल प्रभाव के लिए हर 3 दिनों के लिए।
    नोट: चूहे एक सप्ताह में एक बार तौला जाएगा। 15% शरीर के वजन के एक वजन घटाने के प्रतिकूल प्रभाव पर विचार किया जाएगा और चरण 5 ulcerated ट्यूमर के साथ चूहे भी euthanized किया जाएगा में वर्णित के रूप में ट्यूमर असर चूहों euthanized किया जाएगा।

3. प्राथमिक ट्यूमर के सर्जिकल हटाने

नहींते: आटोक्लेव कैंची, संदंश और घाव क्लिप और घाव क्लिप एप्लायर (चित्रा 1)।

  1. एक बाँझ हालत संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए बनाए रखने के लिए एक बाँझ हुड में सर्जरी प्रदर्शन। सर्जरी से पहले एक दिन, एक बिजली के बाल trimmer के साथ ट्यूमर असर चूहों के ट्यूमर के आसपास के क्षेत्र दाढ़ी।
  2. लगभग 2 - सर्जरी से पहले 4 घंटा, 5 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन की एक खुराक पर चूहों के लिए तैयार चूहों chewable गोलियाँ Carprofen खिलाओ।
  3. एक कक्ष में लगभग 30 सेकंड के लिए ऑक्सीजन में 2% isoflurane युक्त चूहों रखो। लगातार पूरे शल्य चिकित्सा की अवधि के दौरान एक संज्ञाहरण उपकरण का उपयोग कर माउस anesthetize।
  4. माउस की आँखों के लिए पशु चिकित्सक मरहम लागू करने के लिए, जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए एक बाँझ कपास छड़ी का प्रयोग करें। माउस के पैर छूने के लिए संदंश का प्रयोग करें। स्पर्श करने के लिए कोई प्रतिक्रिया नहीं की पुष्टि करता है कि माउस पूरी तरह से बेहोश है।
  5. तीन बारी के साथ ट्यूमर साइट के आसपास की त्वचा क्षेत्र कीटाणुरहितएक साबुन कीटाणुनाशक हाथ धोने के पोंछे। एक 70% शराब पोंछ के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र को साफ कर लें।
  6. एक निष्फल छुरी (चित्रा 1) का उपयोग ट्यूमर के पास एक छोटा सा चीरा कटौती करने के लिए।
  7. ट्यूमर गुत्थी (2A चित्रा) को बेनकाब करने के ट्यूमर के आसपास की त्वचा में कटौती करने के लिए चीरा निष्फल कैंची की एक जोड़ी की नोक डालें। बाँझ संदंश के साथ ट्यूमर पकड़ो और कैंची का उपयोग त्वचा (चित्रा 2 बी) से ट्यूमर अलग करने के लिए। एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ठंड से या भविष्य में उपयोग के लिए 10% formalin समाधान में फिक्सिंग से ट्यूमर नमूना बचाओ।
  8. 9 मिमी घाव ऑटो क्लिप एप्लायर (चित्रा 1) का उपयोग क्लिप के साथ शल्य साइट को बंद करें। autoclaved बिस्तर के साथ एक साफ पिंजरे के लिए माउस लौटें। जानवरों संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार निगरानी की जानी चाहिए।
    नोट: माउस आमतौर पर पर्याप्त चेतना आएगा और पिंजरे में लगभग 10 स्थानांतरित करने के लिए शुरू होता है - सर्जरी के बाद 30 मिनट।
  9. करने के लिए Carprofen प्रशासनसर्जरी के बाद चूहों फिर से 24 घंटा। Carprofen के बाद सर्जरी पीड़ानाश के लिए है और बाद सर्जरी पीड़ानाश की निर्धारित संस्था के पशु चिकित्सा कर्मचारियों के साथ प्रत्यक्ष परामर्श द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए। (- 7 दिन सर्जरी के बाद आम तौर पर भीतर 5) घाव भर देता है के बाद घाव क्लिप निकालें। घाव ऑटो क्लिप पदच्युत का उपयोग कर क्लिप निकालें।

4. लाइव माउस Bioluminescence ट्यूमर मेटास्टेसिस की इमेजिंग

  1. सर्जरी के बाद हर 3 दिन छवि चूहों चरण 2 में वर्णित है।

5. फेफड़ों metastases के मान्यकरण ट्यूमर असर फेफड़ों के भारत स्याही का उपयोग करते हुए मुद्रास्फीति की दर

नोट: luciferase लाइव ट्यूमर इमेजिंग परिणाम को मान्य करने के लिए, ट्यूमर पिंड यों तो ट्यूमर असर माउस फेफड़ों के भारत स्याही मुद्रास्फीति प्रदर्शन करते हैं। 4T1 कोशिकाओं को भी अन्य अंगों और ऊतकों (चित्रा 5) और इसलिए, इन अंगों ट्यूमर मेटास्टेसिस को मान्य करने के histological परीक्षा अगर जरूरत किया जाना चाहिए करने के लिए metastasize। इस प्रोटोकॉल का उपयोग LUNएक उदाहरण के रूप में जी मेटास्टेसिस।

  1. इच्छामृत्यु के लिए उनके मौजूदा घर पिंजरे में चूहों रखें। जब अन्य जानवरों के साथ रखे, उन चूहों को एक अलग पिंजरे में euthanized नहीं किया जा रहा स्थानांतरित करना।
  2. पिंजरे फिल्टर शीर्ष निकालें और सीओ 2 फिल्टर शीर्ष के साथ बदलें। संकुचित सीओ 2 गैस सिलेंडर (100%) है कि सीओ 2 फिल्टर शीर्ष से जुड़ा है चालू करें। 2 एल / मिनट में प्रवाह की दर निर्धारित करें और कम से कम 10 मिनट के लिए पर सीओ 2 रहते हैं। चूहों अभी भी 10 मिनट के अंत में साँस ले रहे हैं, पर सीओ 2 को छोड़ कम से कम 1 मिनट के बाद जब तक चूहों को साँस लेने में बंद करो। सीओ 2 सिलेंडर नियंत्रण और फ्लो मीटर बंद कर दें। 3 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें और फिल्टर शीर्ष हटा दें।
  3. एक polystyrene बोर्ड पर अपनी पीठ पर बलिदान-माउस रखें। पैर पिन श्वासनली को अबाधित पहुँच सुनिश्चित करने के लिए। 70% इथेनॉल के साथ चूहों स्प्रे।
  4. कैंची की एक जोड़ी का उपयोग, साली की ओर ribcage के माध्यम से माउस के मध्य पेट के midline के साथ काटा और ऊपरग्रंथियों बदलती हैं। श्वासनली का निरीक्षण करें। संदंश का प्रयोग करें श्वासनली आसपास के श्वासनली को बेनकाब करने के ऊतकों को हटाने के लिए।
  5. श्वासनली के नीचे एक विंदुक टिप थ्रेड। एक हाथ से टिप होल्डिंग, धीरे श्वासनली अप और शरीर से दूर उठा।
  6. माउस पकड़े 180 ° मंच घुमाएँ। श्वासनली के माध्यम से फेफड़ों में भारत स्याही (10% भारत स्याही और 0.1% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड) इंजेक्षन करने के लिए एक आधा सीसी 27 जी 1/2 ट्यूबरकुलीन सिरिंज का प्रयोग करें। पूरी तरह से स्याही के साथ फेफड़ों बढ़ सकता जब तक एक मजबूत प्रतिरोध महसूस किया है।
  7. श्वासनली में कटौती करने के लिए कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें। माउस पकड़ संदंश का प्रयोग करें और फेफड़ों के तहत संदंश की एक और सेट डालने और माउस से बाहर फेफड़ों पालियों खींच। एक बीकर युक्त पानी में फेफड़ों संक्षिप्त कुल्ला।
  8. एक रासायनिक धूआं हुड में, एक गिलास जगमगाहट Fekete का समाधान (50% इथेनॉल, 6% संक्रामक, और 3% हिमनदों एसिटिक एसिड) के 3 मिलीग्राम से युक्त शीशी फेफड़ों हस्तांतरण। वाष्पन से समाधान को रोकने के लिए शीशी कैप।
    ध्यान दें: ऊतकों Fekete के समाधान में अनिश्चित काल के लिए भंडारित किया जा सकता है।
  9. कुछ ही मिनटों के बाद, काले फेफड़ों (चित्रा 5) पर सफेद डॉट्स के रूप में ट्यूमर पिंड निरीक्षण करते हैं। सफेद ट्यूमर गुत्थी आंखों से दिखाई दे रहा है। एक धूआं हुड में एक पकवान को फेफड़ों स्थानांतरण और सफेद धब्बे की संख्या गिनती। प्रत्येक सफेद स्थान के लिए एक एकल metastatic ट्यूमर गुत्थी प्रतिनिधित्व करता है।

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Representative Results

Orthotopic स्तन कैंसर माउस मॉडल की स्थापना
4T1 एक आक्रामक स्तन कार्सिनोमा सेल लाइन है। स्तन वसा पैड में के रूप में छोटे रूप में 1 एक्स 10 4 कोशिकाओं के इंजेक्शन इंजेक्शन (चित्रा 2A) की साइट में एक ही ट्यूमर गुत्थी की स्थापना करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इसलिए, ट्यूमर मानव प्राथमिक स्तन कार्सिनोमा mimics। लगभग 100% चूहों ओर्थोटोपिक ट्यूमर का विकास। ट्यूमर के आकार एक डिजिटल कैलिपर या जी ट्यूमर इमेजिंग (चित्रा 3) द्वारा उपयोग मात्रा जा सकता है। ट्यूमर ट्यूमर इंजेक्शन के बाद पहचाने जाने लगभग 3 दिनों एक bioluminescence इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर रहे हैं, और ट्यूमर का आकार बढ़ता है के रूप में luminescence तीव्रता बढ़ जाती है (चित्रा 3)। इसलिए, इस मॉडल स्तन कार्सिनोमा के सभी चरणों के खिलाफ कीमोथेरेपी और immunotherapeutic एजेंटों की प्रभावकारिता के परीक्षण के लिए एक आदर्श ओर्थोटोपिक स्तन कैंसर मॉडल है।

सहज मेटास्टेसिस
मानव स्तन कैंसर के रोगियों में, प्राथमिक ट्यूमर शल्य चिकित्सा निदान के बाद हटा रहे हैं। हालांकि, रोगियों की एक बड़ी संख्या को पहले से ही निदान के समय में एल.एन. या दूर मेटास्टेसिस है। प्रक्रिया में, चूहों का सबसे ट्यूमर प्रत्यारोपण के 30 दिनों के बाद एल.एन. और दूर मेटास्टेसिस विकसित किया है। वर्णित शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया पूरी तरह से प्राथमिक ट्यूमर (चित्रा 2 बी) को हटा। 30 दिनों सर्जरी के बाद (चित्रा 2 बी) - कोई अवशिष्ट प्राथमिक ट्यूमर प्राथमिक ट्यूमर साइटों 10 पर पता चला रहे हैं। प्राथमिक ट्यूमर के सर्जिकल हटाने ट्यूमर असर चूहों के जीवन काल में फैली हुई है लेकिन चूहों के विभिन्न भागों में ट्यूमर मेटास्टेसिस को रोकने नहीं है। ये मेटास्टेसिस रहते इमेजिंग विधि (चित्रा 4) से पता लगाया जा सकता है। यह मॉडल इस प्रकार एक सहज मेटास्टेसिस स्तन कैंसर के मॉडल है कि मानव स्तन कैंसर के रोगियों mimics है। 1) का अध्ययन सहज BRE: इस मॉडल के लिए उपयोगी हैएएसटी कैंसर मेटास्टेसिस (उदाहरण के लिए, 4T1 कोशिकाओं ब्याज की एक जीन स्तन कैंसर सहज मेटास्टेसिस में इन जीनों के कार्यों का परीक्षण करने के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है); और 2) एक प्रतिरक्षा सक्षम मेजबानी में सहज स्तन मेटास्टेसिस के खिलाफ कीमोथेरेपी और immunotherapeutic एजेंटों की प्रभावकारिता परीक्षण। की साइटों और मेटास्टेसिस की डिग्री रहते इमेजिंग (चित्रा 4) से पता लगाया जा सकता है और एक दूसरा दृष्टिकोण (चित्रा 5) के साथ मान्य। Luminescence इमेजिंग पूरे फेफड़ों के ट्यूमर बोझ यों कर सकते हैं। ट्यूमर असर फेफड़ों की स्याही मुद्रास्फीति ट्यूमर मेटास्टेसिस के एक मानार्थ मात्रा का ठहराव विधि का प्रतिनिधित्व करने, प्रत्येक फेफड़ों (चित्रा 5) की वास्तविक ट्यूमर पिंड की सटीक गिनती की अनुमति देता है, जिससे।

आकृति 1
चित्रा 1. शल्य चिकित्सा उपकरण। 1.Stainless छुरी, 2. संदंश। 3. स्टेनलेस कैंची। 4. Autocहोंठ घाव क्लिप एप्लायर। 5. autoclip घाव क्लिप पदच्युत। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. Orthotopic 4T1 ट्यूमर मॉडल। एक। 4T1 ट्यूमर कोशिकाओं कोशिकाओं (1 x 10 4 100 μl पीबीएस में कोशिकाओं) स्तन वसा पैड में इंजेक्ट किया गया। तीस दिनों के ट्यूमर इंजेक्शन के बाद, माउस का बलिदान और ट्यूमर के विकास के लिए जांच की गई थी। दिखाया इंजेक्शन (पीले तीर) के स्थल पर एक ही ट्यूमर गुत्थी। बी के साथ ट्यूमर असर चूहों है। एक के रूप में दिखाया ट्यूमर शल्य चिकित्सा द्वारा हटा दिया गया था। दिखाया गया 10 दिनों प्राथमिक ट्यूमर के सर्जिकल हटाने के बाद 4T1 ट्यूमर असर चूहों है। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का संस्करण।

चित्र तीन
चित्रा Luciferase आधारित लाइव ट्यूमर इमेजिंग द्वारा 3. लाइव ट्यूमर इमेजिंग। 4T1 ट्यूमर कोशिकाओं कोशिकाओं (1 x 10 4 100 μl पीबीएस में कोशिकाओं) स्तन वसा पैड में इंजेक्ट किया गया। माउस दिनों में imaged किया गया था 7, 14 और 28. दिखाया प्राथमिक ट्यूमर के luminescence तीव्रता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा Luciferase आधारित लाइव ट्यूमर इमेजिंग द्वारा ट्यूमर प्रगति की 4. विज़ुअलाइज़ेशन। 4T1 ट्यूमर कोशिकाओं कोशिकाओं (1 x 10 4 100 μl पीबीएस में कोशिकाओं) स्तन वसा पैड में इंजेक्ट किया गया। प्राथमिक ट्यूमर शल्य चिकित्सा श के रूप में हटा दिया गया थाखुद चित्रा 3 में। माउस तो 17 दिनों के प्राथमिक ट्यूमर के सर्जिकल हटाने के बाद imaged किया गया था। दिखाया मेटास्टेसिस की छवि है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. भारत स्याही मुद्रास्फीति से फेफड़ों के ट्यूमर पिंड के दृश्य। ट्यूमर असर माउस के फेफड़ों भारत स्याही के साथ फुलाया और Fekete के समाधान में तय की गई थी। सफेद डॉट्स फेफड़ों मेटास्टेसिस कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

स्तन कैंसर मेटास्टेसिस के ट्रांसजेनिक माउस मॉडल से कई प्रकार विकसित किया गया है। 1 ये ट्रांसजेनिक चूहों उच्च ट्यूमर 60 से 100% से लेकर घटना है। (- 100% 14) हालांकि, इन ट्रांसजेनिक चूहों के मेटास्टेसिस घटना ट्यूमर घटना की तुलना में काफी कम है। ट्यूमर कोशिकाओं को स्तन कैंसर मेटास्टेसिस के इन ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के बहुमत में एल.एन. और फेफड़ों के लिए metastasize। मेटास्टेसिस विलंबता मॉडल के लिए मॉडल से भिन्न होता है और 2 से 8 महीनों से चलता है। 6,11-16 स्तन कैंसर मेटास्टेसिस के इन ट्रांसजेनिक माउस मॉडल अंतर्निहित स्तन कैंसर मेटास्टेसिस आनुवंशिक और आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए उत्कृष्ट व्यवस्था कर रहे हैं। हालांकि, कम मेटास्टेसिस घटनाओं और लंबे मेटास्टेसिस विलंबता विरोधी कैंसर एजेंटों की परीक्षा में इन मॉडलों की उपयोगिता की सीमा।

स्तन वसा पैड में 4T1 कोशिकाओं के ओर्थोटोपिक आरोपण, प्राथमिक ट्यूमर और बाद मेटास्टेटिक विकास, resembl के गठन के साथघातक स्तन कैंसर से कई चरणों, प्राथमिक ट्यूमर गठन, लिम्फ नोड मेटास्टेसिस और दूर के अंग मेटास्टेसिस सहित तों। इसके अलावा, syngenic प्रत्यारोपण immunologic मेजबान बनाम भ्रष्टाचार प्रतिक्रिया ट्यूमर microenvironment के योगदान, प्रतिरक्षा प्रणाली सहित के अध्ययन की अनुमति, घातक ट्यूमर प्रगति करने से बचा जाता है। यह मॉडल भी मेजबान विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए उपयोगी है। इसलिए, स्तन वसा पैड में 4T1 कोशिकाओं के इंजेक्शन स्तन कैंसर मेटास्टेसिस अध्ययन करने के लिए एक तेजी से और मात्रात्मक विधि का प्रतिनिधित्व करता है।

ओर्थोटोपिक 4T1 प्रत्यारोपण ट्यूमर मॉडल कम से कम 30 दिन और कम से कम 60 दिन (चित्रा 2-4) में 100% मेटास्टेसिस घटनाओं में 100% ट्यूमर घटना है। इसके अलावा, स्तन कैंसर मेटास्टेसिस के ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के अधिकांश के विपरीत, 4T1 ट्यूमर कोशिकाओं को भी हड्डी (चित्रा 4) के लिए, metastasize जिससे मानव स्तन कैंसर मेटास्टेसिस जैसी।

स्थिर expressiपर luciferase-कोडिंग 4T1 ट्यूमर कोशिकाओं में सीडीएनए (चित्रा 3) समय के साथ ट्यूमर के विकास और जीने चूहों में प्रगति की निगरानी की अनुमति देता है। ट्यूमर बोझ और मेटास्टेसिस कैनेटीक्स luminescence तीव्रता के आधार पर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इसके अलावा, मेटास्टेसिस साइटों को भी luciferase इमेजिंग (चित्रा 4) से और पहचाना जा सकता है एक पूरक दृष्टिकोण (चित्रा 5) के साथ मान्य। इसलिए, इस स्तन कैंसर सहज मेटास्टेसिस मॉडल विवो में विरोधी मेटास्टेसिस एजेंटों की प्रभावकारिता का निर्धारण करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है।

सर्जरी के सबसे टांके के साथ कटौती के बंद करना शामिल है। इधर, हमने देखा है कि स्टेनलेस घाव क्लिप अच्छी तरह से काम (चित्रा 1)। घाव क्लिप आसानी से निष्फल किया जा सकता है और आसानी से autoclip एप्लायर (चित्रा 1) के साथ लागू किया। घाव क्लिप आसानी से क्लिप पदच्युत (चित्रा 1) के बाद घाव चंगा कर दिया गया है साथ हटाया जा सकता है। हम ओब हैमें 20 सर्जरी में इस शल्य चिकित्सा तकनीक के साथ कोई संक्रमण की सेवा की।

इस मॉडल की एक सीमा तेजी से ट्यूमर के विकास दर है। व्यापक मेटास्टेसिस बोझ के कारण सर्जरी के बाद 2 महीने - मेटास्टेसिस असर चूहों के बहुमत 1 में मर जाता है। एक और सीमा 4T1 एक माउस सेल लाइन है और प्रायोगिक दवाओं को अपनी प्रतिक्रिया मानव कोशिकाओं से प्रतिक्रिया करने के लिए अलग-अलग हो सकता है। इस प्रयोगात्मक दवा के परीक्षण के लिए अध्ययन डिजाइन में विचार किया जाना चाहिए।

सारांश में, हम ओर्थोटोपिक स्तन कैंसर सहज मेटास्टेसिस मॉडल की एक सरल और अभी तक संवेदनशील प्रक्रिया अनुकूलित है। यह मॉडल मानव स्तन कैंसर मेटास्टेसिस mimics। ट्यूमर प्रगति कैनेटीक्स नजर रखी है और समय के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। यह मॉडल एक आदर्श एक न केवल स्तन कैंसर के विकास और मेटास्टेसिस के अध्ययन के लिए, लेकिन यह भी 17 सहज स्तन कैंसर मेटास्टेसिस के दमन में कीमोथेरेपी और immunotherapeutic एजेंटों की प्रभावकारिता के परीक्षण के लिए है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ami-X Imaging System  Spectral Instruments Imaging Inc. Tucson, AZ
IsoTec SurgiVet Anesthesia Service & Equipment , Inc., Atlanta, GA
AutoClip Physicians Kit Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD 427638
9 mm AutoClip Applier  Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD 427630
9 mm AutoClip Remover Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD 427637
9 mm AutoClip Wound Clip Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD 427631
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher 8940
Dissecting Fine-Pointed Forceps Fisher 8875
1/2 CC 27 G 1/2 tuberculin syringe Becton Dickinson and Co. NJ  305620
RPMI 1640 medium Mediatech Inc 10-040-CV
PBS Mediatech Inc 21-040-CV
70% Ethanol Ultrapure-usa.com
Trypsin-EDTA Mediatech Inc 25-040-CI

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References

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