Een orthotope Muis Model van Spontane uitzaaiing van borstkanker

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Een orthotope borstkanker primaire tumor model en chirurgische verwijdering van de primaire tumor de muis het leven uit te breiden tot spontane metastase genereren beschreven. De tumorgroei en progressie worden gecontroleerd en gekwantificeerd luciferase fluorescentiebeeldvorming.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Paschall, A. V., Liu, K. An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (114), e54040, doi:10.3791/54040 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Metastase is de belangrijkste doodsoorzaak van borstkankerpatiënten. Het mechanisme dat kankercellen metastase, waaronder borstkanker metastase, is grotendeels onbekend en is een focus in kankeronderzoek. Verschillende borstkanker spontane metastase muismodellen zijn vastgesteld. Hier melden wij een vereenvoudigde procedure om orthotope getransplanteerde borstkanker primaire tumor vast te stellen en de daaruit voortvloeiende spontane metastase dat de menselijke borstkanker uitzaaiingen na te bootsen. In combinatie met de bioluminescentie levende tumor imaging Dit muismodel maakt tumorgroei en progressie kinetiek worden gecontroleerd en gekwantificeerd. In dit model, een lage dosis (1 x 10 4 cellen) of 4T1-Luc borstkankercellen werd geïnjecteerd in BALB / c muis mammair vetkussentje met een tuberculine injectiespuit. Muizen werden geïnjecteerd met luciferine en afgebeeld op verschillende tijdstippen met een bioluminescente beeldvormingssysteem. Wanneer de primaire tumoren groeide uit tot de maximale grootte als in de IACUC-goedgekeurde protocol (ca.oximately 30 dagen) werden de muizen geanesthetiseerd onder constante stroom van 2% isofluraan en zuurstof. Het tumoroppervlak werd gesteriliseerd met 70% ethanol. De muis huid rond de tumor werd weggesneden op de tumor die werd verwijderd met een paar steriele schaar bloot. Verwijdering van de primaire tumor verlengt de overleving van 4T-1 tumordragende muizen gedurende één maand. De muizen werden vervolgens herhaaldelijk afgebeeld voor uitgezaaide tumor verspreiden naar verre organen. Therapeutische middelen kunnen worden toegediend om tumormetastase te onderdrukken op dit punt. Dit model is eenvoudig en toch gevoelig kwantificeren borstkanker celgroei in de primaire plaats en progressie kinetiek naar verre organen, en dus is een uitstekend model voor het bestuderen van de groei van borstkanker en progressie, en voor het testen van anti-metastase therapeutische en immunotherapeutische agentia in vivo .

Introduction

Volgens de American Cancer Society, borstkanker is de meest gediagnosticeerde vorm van kanker bij vrouwen in de Verenigde Staten. Vroege detectie in combinatie met recent ontwikkelde gerichte therapieën aanzienlijk verminderd de mortaliteit van borstkanker in de laatste twee decennia. Echter, borstkanker blijft de tweede belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen bij vrouwen in de Verenigde Staten 1. De meeste sterfgevallen borstkanker patiënten vanwege tumorcelmetastase. Helaas zijn de meeste borstkanker invasief en vaak uitzaaiing de lymfeklieren en vervolgens naar verre organen, zoals bot, long, lever en hersenen. 1,2 Er is momenteel geen effectieve therapie voor metastatische borstkanker. Derhalve ontwikkeling van chemotherapeutische en immunotherapeutische middelen onderdrukt metastatische borstkanker is van grote betekenis.

Diverse borstkanker spontane metastase muismodellen hebben bEen ontwikkeld om de moleculaire mechanismen borsttumorcellijn progressie en metastase en worden gebruikt als modellen voor de ontwikkeling van therapeutische middelen te bestuderen. 1,3-5 De meeste van deze muizenmodellen genetische tumormodellen die, terwijl uitstekende modellen voor mechanistische studies, niet geschikt voor het testen van therapeutische middelen omdat de metastase duurt maanden ontwikkelen in deze genetische modellen, waardoor kostbare langdurige toediening van de antikankermiddelen ter. 6,7 Monitoring tumorprogressie in levende muizen is technisch uitdagend. Daarentegen getransplanteerde borstkankermetastasen model heeft de voordelen van korte tumorprogressie gemakkelijk volgen van tumorprogressie in levende muizen. De 4T1 orthotope borstkanker spontane metastase muismodel zo'n tumormodel getransplanteerd. 8 In dit model worden de borsttumorcellen getransplanteerd in de borstklier vetkussentje primaire tumoren vastgesteld. De primaire tumorkan vervolgens chirurgisch worden verwijderd bij menselijke borstkanker. 4T1 tumorcellen zijn zeer invasieve. 8,9, 3,10 Bijna alle tumor-dragende muizen ontwikkelen metastase in 30 dagen na tumor transplantatie in het uiervet pad. Echter, 4T1 tumoren groeien agressief in de primaire sites en de tumor maten overschrijden vaak de grenzen die zijn toegestaan ​​in de meeste dieren protocollen. In dit stadium de uitzaaiingen vaak micrometastasen. Daarom is het essentieel om primaire tumoren verwijderen metastase vooruitgang testen therapeutische middelen toe. Hier melden wij de inrichting van een eenvoudige en toch gevoelige procedure primaire tumor transplantatie, chirurgische verwijdering van de primaire tumor en bioluminescentie-imaging kwantificering van de 4T1 tumorgroei en progressie in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures te volgen richtlijnen en protocollen zijn goedgekeurd door Georgia Regents University Animal Gebruik en onderhoud Comité.

1. De vaststelling van Orthotope Tumor Borstkanker

  1. Een dag voor het experiment kweek ongeveer 2 x 10 6 4T1-Luc tumorcellen in een 10 cm kweekschaal in 10 ml RPMI medium met 10% FBS. Incubeer de kweekschaal in een CO2 incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  2. Op de dag van injectie van tumorcellen verwijderen kweekmedium uit de kweekschaal met vacuüm, voeg 5 ml steriel fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4 aan de kweekschaal en schud de schotel naar de kweekoppervlak wassen, verwijder de PBS door vacuüm.
  3. Voeg 2 ml trypsine-EDTA (0,05% trypsine en 0,53 mM EDTA) aan de kweekschaal, incubeer in de CO2 incubator bij 37 ° C gedurende ongeveer 5 minuten. Raadpleeg cellen op een omgekeerde microscoop om ervoor te zorgen dat alle cellen worden losgemaakt van de bodem van de kweekschaal. </ Li>
  4. Quench trypsine door toevoeging van 8 ml serum-bevattend medium, cellen overbrengen naar een 15 ml conische buis en centrifugeer de cellen bij ongeveer 450 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Verwijder het supernatant door vacuüm en resuspendeer cellen in 10 ml PBS. Centrifugeer cellen bij ongeveer 450 g gedurende 3 min. Verwijder het supernatant door vacuüm en resuspendeer cellen in 10 ml PBS.
  6. Pipetteer 10 ul van de celsuspensie op een hemocytometer onder het dekglas. Tel de cellen om de celconcentratie te bepalen. Resuspendeer cellen in PBS bij een dichtheid van 2 x 10 5 cellen / ml HBSS. Transfer cellen een 1,5 ml steriele microfugebuis en blijven cellen op ijs tot gebruik.
  7. Gebruik vrouwelijke BALB / c muizen van 6-8 weken voor tumorcel injectie.
    1. Scheer haar in de buurt rond tepel # 3 met behulp van een elektronische tondeuse. Injectie van 4T1 cel in de melkklier 3 vetkussentje genereert reproduceerbaar long metastase. Reinig het geschoren gebied met behulp van het wattenstaafje gedompeld in 70% ethanol. Resuspendeer cellen door het omkeren van de microcentrifugebuis 2-3 keer. Voorzichtig aspireren 50 pi celsuspensie in een ½ CC 27 G 1/2 tuberculine spuit.
    2. Injecteren van de tumorcellen in het uiervet pad onder # 3 melkklier van een BALB / c muis. Plaats de muis in een schone kooi en de terugkeer van de kooi tot huisvesting dier faciliteit. Wacht ongeveer 21 - 30 dagen voor de ontwikkeling van tumoren. Tumor groei moet worden gecontroleerd op een regelmatige basis als per beleid instelling voor tumor studies.

2. Levende Muis Bioluminescentie beeldvorming van tumorgroei

  1. Afbeelding muizen elke 3 dagen na tumorinjectie Transfer muizen om de beeldvormende inrichting. Injecteer 100 pl luciferine (30 mg / ml in PBS) intraperitoneaal (ip) bij muizen voorafgaand aan de beeldvorming. Na ongeveer 10 minuten, verdoven muizen in een inductie kamer met 2% isofluraan / O2 flow. Gebruik de tang om het been van de muis te raken. Geen reactie op de aanraking bevestigt that de muis is volledig onbewust.
    1. Plaats de muizen in de beeldvorming kamer onder voortdurend 2% isofluraan en O2 met een stroomsnelheid van 2 l / min. Plaats de muis zodanig dat het gebied van belang (dat wil zeggen, de mammaire pad van de eerste tumorinjectie) naar de camera van het beeldvormingssysteem. Zorgen voor de neus en mond van de muis stevig gevestigd in het verdovingsmiddel buis. De dieren moeten worden verdoofd per veterinaire normen van de instelling.
  2. Verwerven bioluminescentie beeldvorming met een scala aan verschillende belichtingstijd. Zo stellen de blootstelling aan 30, gezichtsveld (FOV) tot 25, object hoogte tot 1,5 cm, en het verkrijgen van luminescente fotografische beelden met een laag vermogen X-ray. Stel de meeteenheden voor "uitstraling."
    1. Gebruik een automatische lineaire kleurbereik met een maximum van ongeveer 2,4 x 10 7 uitstraling eenheden. Na het verkrijgen van de eerste beelden, instellingen aan te passen en het verkrijgen van een geoptimaliseerde-afbeelding (figuurTussen 3 en 4).
  3. Terug muizen kooien schoon te maken en te zorgen voor muizen weer bij bewustzijn met het lopen alvorens terug te keren van de dieren aan de behuizing faciliteit.
  4. Analyseer gegevens met de levende imaging software in verband met de beeldvorming instrument. Met behulp van een imaging-programma, trek een gesloten lijn rond de regio van belang (ROI). Gebruik de imaging software om de straling intensiteit van de ROI te bepalen. Noteer de relatieve intensiteiten van elk ROI per muis.
    OPMERKING: Hogere uitstraling intensiteiten wijzen op een grotere mate van lichtgevende cellen, en dus een grotere groei van de tumor.
  5. Visueel onderzoek van de muis om de 3 dagen voor de bijwerkingen.
    LET OP: Muizen zal een keer per week worden gewogen. Een gewichtsverlies van 15% lichaamsgewicht ongewenste effecten beschouwd en de tumordragende muizen worden gedood zoals beschreven in stap 5 muizen met zwerende tumoren zal worden gedood.

3. chirurgische verwijdering van primaire tumoren

NEETE: Autoclaaf scharen, forceps en de wondklemmen en wond klemaanbrenger (figuur 1).

  1. Voer de chirurgie in een steriele kap een steriele toestand om het risico van infectie te behouden. Een dag voor de operatie, scheren de omgeving van de tumoren van de tumordragende muizen met een elektrische tondeuse.
  2. Ongeveer 2-4 uur voor de operatie, voeden de muizen kauwbare tabletten carprofen geformuleerd voor muizen in een dosis van 5 mg / kg lichaamsgewicht.
  3. Zet de muizen in een kamer die 2% isofluraan in zuurstof gedurende ongeveer 30 sec. Continu verdoven de muis met behulp van een verdoving apparaat tijdens het gehele operatieve periode.
  4. Gebruik een steriele katoenen stok om dierenarts zalf voor de ogen van de muis tot droog te voorkomen dat tijdens het onder narcose. Gebruik de tang om het been van de muis te raken. Een antwoord op het contact bevestigt dat de muis volledig bewustzijn.
  5. Ontsmet de huid rond de tumor site met drie afwisselendedoekjes van een soap desinfecterende scrub. Veeg de chirurgische gebied met een alcohol 70% af te vegen.
  6. Gebruik een steriele scalpel (figuur 1) een kleine incisie nabij de tumor snijden.
  7. Steek de punt van een paar van gesteriliseerde schaar om de incisie van de huid snijden rond de tumor om de tumor gezwel (Figuur 2A) bloot. Houd de tumor met een steriele pincet en gebruik de schaar om de tumor te scheiden van de huid (figuur 2B). Sla het tumormonster bevroren in een -80 ° C vriezer of bevestiging in 10% formaline oplossing voor toekomstig gebruik.
  8. Sluit de operatieplaats met 9 mm wondklemmen met de automatische klemaanbrenger (figuur 1). Breng de muis naar een schone kooi met geautoclaveerd beddengoed. De dieren moeten per institutionele richtlijnen worden gecontroleerd.
    OPMERKING: De muis herwint meestal voldoende bewustzijn en begint te bewegen in de kooi ongeveer 10 - 30 minuten na de operatie.
  9. Dien carprofen naarmuizen opnieuw 24 uur na de operatie. Carprofen is voor post-chirurgie analgesie en het voorschrijven van na de ingreep analgesie dient te worden geverifieerd door direct overleg met het diergeneeskundig personeel van de instelling. Verwijder de wond clips na de wond geneest (meestal binnen 5-7 dagen na de operatie). Verwijder wond clips met behulp van de auto-clip remover.

4. Levende Muis Bioluminescentie beeldvorming van tumormetastase

  1. Afbeelding muizen elke 3 dagen na de operatie zoals beschreven in stap 2.

5. Validatie van longmetastasen gebruik van India Ink Inflatie van tumor-dragende Longen

OPMERKING: Om de luciferase live-tumor imaging resultaten te valideren, uitvoeren Indische inkt opblazen van tumor-dragende muis longen naar tumoren te kwantificeren. 4T1 cellen ook uitzaaien naar andere organen en weefsels (figuur 5) en derhalve moet histopathologisch onderzoek van deze organen tumormetastase valideren worden uitgevoerd indien nodig. Dit protocol gebruik Lung metastase als voorbeeld.

  1. Houd muizen in hun bestaande huis kooi voor euthanasie. Wanneer ondergebracht bij andere dieren, verhuizen die muizen niet wordt gedood een andere kooi.
  2. Verwijder de kooi filter top en te vervangen door de CO 2 filter top. Zet het gecomprimeerde CO2 gascilinder (100%) die is verbonden met de CO 2 filterafdekking. Stel het debiet 2 l / min en houden CO 2 gedurende minimaal 10 min. Wanneer de muizen nog ademen eind 10 min, laat het CO 2 totdat ten minste 1 minuut na het stoppen met ademen muizen. Schakel CO 2 cilinder controle en de stroommeter. Wachten op meer 3 minuten en verwijder het filter top.
  3. Plaats het geofferde-muis op zijn rug op een polystyreen boord. Speld de benen om onbelemmerde toegang tot de luchtpijp te waarborgen. Spuit de muizen met 70% ethanol.
  4. Met behulp van een schaar gesneden langs de middellijn van het midden abdomen van de muis door de ribbenkast en omhoog naar de salivariëren klieren. Houd rekening met de luchtpijp. Gebruik een tang om weefsels rondom de luchtpijp naar de luchtpijp bloot te verwijderen.
  5. Rijg een pipet tip onder de luchtpijp. Houd de tip met één hand til de luchtpijp en weg van het lichaam.
  6. Draai het platform met de muis 180 °. Gebruik een ½ CC 27 G 1/2 tuberculine spuit naar India Ink (10% Oost-Indische inkt en 0,1% ammoniumhydroxide) te injecteren in de longen via de luchtpijp. Volledig opblazen van de longen met inkt totdat er een sterke weerstand wordt gevoeld.
  7. Gebruik een schaar om de trachea gesneden. Gebruik een tang om de muis te houden en plaats een andere set van tang onder de longen en trek de longkwabben uit de muis. Spoel de longen even in een bekerglas met water.
  8. In een chemische zuurkast overdracht van de longen een glazen scintillatieflesje met 3 ml oplossing Fekete's (50% ethanol, 6% formaldehyde en 3% ijsazijn). Cap het flesje te voorkomen dat de oplossing verdampt.
    NOTITIEDe weefsels kunnen worden opgeslagen in oplossing Fekete's oneindig.
  9. Na een paar minuten, acht tumoren als witte stippen op de zwarte longen (figuur 5). De witte tumor gezwel is zichtbaar door de ogen. Breng de longen naar een gerecht in een zuurkast en tel het aantal witte vlekken. Elke witte vlek een enkele uitgezaaide tumor knobbel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oprichting van Orthotope Breast Cancer Mouse Model
4T1 is een agressieve mammacarcinoom cellijn. Injectie van zo weinig als 1 x 10 4 cellen in het uiervet pad kan leiden tot invoering van één tumor knobbel in de plaats van injectie (Figuur 2A). Daarom is de tumor bootst humane primaire borstcarcinoom. Bijna 100% muizen ontwikkelen de orthotope tumor. De tumorgrootte kan worden gekwantificeerd met een digitale schuifmaat of levende tumor imaging (figuur 3). Tumoren detecteerbaar ongeveer 3 dagen na tumorinjectie met een bioluminescentie beeldvormingssysteem en de luminescentie-intensiteit toeneemt naarmate tumorgrootte toeneemt (Figuur 3). Derhalve is dit model een ideale orthotopic borstkankermodel voor het testen van de werkzaamheid van chemotherapeutische en immunotherapeutische middelen tegen alle stadia van borstcarcinoom.

Spontane metastase
In humane borstkanker patiënten worden de primaire tumor operatief verwijderd na de diagnose. Een groot aantal patiënten reeds LN of metastasen ten tijde van de diagnose. In de procedure meeste muizen LN en metastasen ontwikkeld na 30 dagen na tumor transplantatie. De beschreven chirurgische procedure verwijdert volledig de primaire tumor (figuur 2B). Geen overblijvende primaire tumoren waargenomen worden op de primaire tumor site 10 - 30 dagen na de operatie (figuur 2B). Chirurgische verwijdering van de primaire tumor verlengt de levensduur van de tumordragende muizen maar verhindert niet tumormetastase naar verschillende delen van de muizen. Deze metastasen kunnen worden gedetecteerd door de levende beeldvormingstechniek (figuur 4). Dit model is dus een spontane metastase borstkanker model dat de menselijke borstkankerpatiënten nabootst. Dit model is nuttig voor: 1) het bestuderen van spontane breast uitzaaiing (bijvoorbeeld 4T1 cellen kunnen worden getransfecteerd met een gen van belang voor de functie van deze genen bij borstkanker spontane metastase testen); en 2) het testen van de effectiviteit van chemotherapeutische en immunotherapeutische middelen tegen spontane metastase borstkanker in een immuun-competente gastheer. Het plaatsen van de mate van metastase kan worden gedetecteerd door levende imaging (figuur 4) en bevestig met een tweede benadering (figuur 5). Luminescentie beeldvorming kan tumor last van de gehele long te kwantificeren. Inkt opblazen van tumordragende longen maakt nauwkeurige telling van de werkelijke tumoren van elke long (figuur 5), waardoor, die een gratis kwantificeermethode van tumormetastase.

Figuur 1
Figuur 1. Chirurgie Extra. 1.Stainless scalpel, 2. tang. 3. Roestvrij schaar. 4. Autoclip wond klemaanbrenger. 5. Autoclip wond clip remover. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. De Orthotope 4T1 Tumor Model. A. 4T1 tumorcellen (1 x 10 4 cellen in 100 pi PBS) cellen werden geïnjecteerd in de uiervet pad. Dertig dagen na tumor injectie werd de muis gedood en onderzocht op tumorgroei. Getoond wordt de tumordragende muizen met een tumor knobbel op de injectieplaats (gele pijl). B. De tumor zoals weergegeven in A werd chirurgisch verwijderd. Getoond wordt de 4T1 tumor-dragende muizen 10 dagen na de chirurgische verwijdering van de primaire tumor. Klik hier voor een grotere weergaveversie van deze figuur.

figuur 3
Figuur 3. Levende Tumor Imaging door Luciferase-gebaseerde Live Tumor Imaging. 4T1 tumorcellen (1 x 10 4 cellen in 100 pi PBS) cellen werden geïnjecteerd in de uiervet pad. De muis werd in beeld gebracht op dag 7, 14 en 28. Getoond wordt de luminescentie-intensiteit van de primaire tumor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Visualisatie van tumorprogressie door Luciferase-gebaseerde Live Tumor Imaging. 4T1 tumorcellen (1 x 10 4 cellen in 100 pi PBS) cellen werden geïnjecteerd in de uiervet pad. De primaire tumor werd operatief verwijderd sheigen in Figuur 3. De muis werd vervolgens afgebeeld 17 dagen na chirurgische verwijdering van de primaire tumor. Beeld van metastase getoond is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. Visualisatie van Lung tumoren door India Ink inflatie. De long van de tumor-dragende muizen werd opgeblazen met Oost-Indische inkt en in oplossing Fekete's vast. De witte stippen zijn longmetastasen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Veel soorten transgene muismodellen voor borstkanker metastasen ontwikkeld. 1 Deze transgene muizen hoge tumoren van 60 tot 100%. De metastase incidentie van deze transgene muizen is veel lager dan de tumoren (14-100%). Tumorcellen metastasen te LN en longen in het merendeel van deze transgene muismodellen voor borstkanker metastase. De metastase latency varieert van model tot model en varieert van 2 tot 8 maanden. 6,11-16 Deze transgene muismodellen van de uitzaaiing van borstkanker zijn uitstekende systemen voor het bestuderen van de genetische en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de uitzaaiing van borstkanker. De lage incidentie en metastase metastase lange latentie beperken de bruikbaarheid van deze modellen in de test van anti-kankermiddelen.

De orthotope implantatie van 4T1 cellen in de uiervet pad, met de vorming van primaire tumoren en daaropvolgende metastatische groei, resembles meerdere stadia van kwaadaardige borstkanker, waaronder primaire tumorvorming, lymfeklier metastase en verre orgel metastase. Bovendien syngene transplantatie vermijdt immunologische gastheer-versus-entreactie die de studie van de bijdrage van de tumor micro-omgeving, zoals het immuunsysteem, maligne tumor progressie. Dit model is ook nuttig voor het bestuderen gastheer anti-tumor immuunrespons. Daarom injectie van 4T1 cellen in de uiervet pad is een snelle en kwantitatieve methode borstkankermetastasen bestuderen.

De orthotope transplantatie 4T1 tumor model heeft een 100% tumor incidentie in minder dan 30 dagen en 100% metastase incidentie in minder dan 60 dagen (Afbeelding 2-4). Bovendien, in tegenstelling tot de meeste transgene muismodellen voor borstkanker metastase, 4T1 tumorcellen ook uitzaaien naar het bot (figuur 4) daardoor lijkt menselijke borstkanker metastase.

stabiele expressiop luciferase-coderende cDNA in 4T1 tumorcellen maakt controle van tumorgroei en progressie in levende muizen in de tijd (Figuur 3). De tumorlast en metastase kinetiek kan worden gekwantificeerd op basis van de luminescentie-intensiteit. Verder kan de metastase sites ook worden geïdentificeerd door de luciferase imaging (figuur 4) en gevalideerd met een complementaire benadering (figuur 5). Daarom is deze borstkanker spontane metastase model is een uitstekend model voor het bepalen van de effectiviteit van anti-metastase middelen in vivo.

De meeste chirurgische sluiting omvat sneden met hechtingen. Hier hebben we geconstateerd dat roestvast wondklemmen goed werken (figuur 1). De wond clip kan eenvoudig worden gesteriliseerd en gemakkelijk aan te brengen met de Autoclip aanvrager (figuur 1). De wondklemmen kan gemakkelijk worden verwijderd met de clip verwijderaar (figuur 1) nadat de wond is genezen. We hebben obgeserveerd geen infecties met deze chirurgische techniek in meer dan 20 operaties.

Een beperking van dit model is de snelle groei van de tumor tarief. De meerderheid van de uitzaaiingen-dragende muizen sterft in 1-2 maanden na de operatie als gevolg van uitgebreide metastase last. Een andere beperking is dat 4T1 een muizencellijn en zijn respons op experimentele geneesmiddelen kunnen verschillen van de respons van humane cellen. Dit moet worden gezien in studie design voor experimentele drug het testen.

Samengevat hebben wij een eenvoudig en toch gevoelige werkwijze van orthotopic borstkanker spontane metastasemodel geoptimaliseerd. Dit model bootst menselijke borstkanker metastase. De tumorprogressie kinetiek kunnen worden gecontroleerd en gekwantificeerd tijd. Dit model is een ideaal niet alleen voor het bestuderen borst groei en metastase van kanker, maar ook voor het testen van de effectiviteit van chemotherapeutische middelen 17 en immunotherapeutische het onderdrukken van spontane metastase borstkanker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ami-X Imaging System  Spectral Instruments Imaging Inc. Tucson, AZ
IsoTec SurgiVet Anesthesia Service & Equipment , Inc., Atlanta, GA
AutoClip Physicians Kit Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD 427638
9 mm AutoClip Applier  Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD 427630
9 mm AutoClip Remover Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD 427637
9 mm AutoClip Wound Clip Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD 427631
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher 8940
Dissecting Fine-Pointed Forceps Fisher 8875
1/2 CC 27 G 1/2 tuberculin syringe Becton Dickinson and Co. NJ  305620
RPMI 1640 medium Mediatech Inc 10-040-CV
PBS Mediatech Inc 21-040-CV
70% Ethanol Ultrapure-usa.com
Trypsin-EDTA Mediatech Inc 25-040-CI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
  2. Weigelt, B., Peterse, J. L., van 't Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nat Rev Cancer. 5, 591-602 (2005).
  3. Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. J Vis Exp. (2015).
  4. Stewart, T. J., Abrams, S. I. How tumours escape mass destruction. Oncogene. 27, 5894-5903 (2008).
  5. Lopez, J. I., et al. CD44 attenuates metastatic invasion during breast cancer progression. Cancer Res. 65, 6755-6763 (2005).
  6. Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26, 513-523 (2005).
  7. Cuevas, B. D., Winter-Vann, A. M., Johnson, N. L., Johnson, G. L. MEKK1 controls matrix degradation and tumor cell dissemination during metastasis of polyoma middle-T driven mammary cancer. Oncogene. 25, 4998-5010 (2006).
  8. Danna, E. A., et al. Surgical removal of primary tumor reverses tumor-induced immunosuppression despite the presence of metastatic disease. Cancer Res. 64, 2205-2211 (2004).
  9. Tao, K., Fang, M., Alroy, J., Sahagian, G. G. Imagable 4T1 model for the study of late stage breast cancer. BMC Cancer. 8, 228 (2008).
  10. Hu, X., et al. Deregulation of apoptotic factors Bcl-xL and Bax confers apoptotic resistance to myeloid-derived suppressor cells and contributes to their persistence in cancer. J Biol Chem. 288, 19103-19115 (2013).
  11. Kwan, H., et al. Transgenes expressing the Wnt-1 and int-2 proto-oncogenes cooperate during mammary carcinogenesis in doubly transgenic mice. Mol Cell Biol. 12, 147-154 (1992).
  12. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12, 954-961 (1992).
  13. Almholt, K., et al. Reduced metastasis of transgenic mammary cancer in urokinase-deficient mice. Int J Cancer. 113, 525-532 (2005).
  14. Gallego, M. I., Bierie, B., Hennighausen, L. Targeted expression of HGF/SF in mouse mammary epithelium leads to metastatic adenosquamous carcinomas through the activation of multiple signal transduction pathways. Oncogene. 22, 8498-8508 (2003).
  15. Lin, S. C., et al. Somatic mutation of p53 leads to estrogen receptor alpha-positive and -negative mouse mammary tumors with high frequency of metastasis. Cancer Res. 64, 3525-3532 (2004).
  16. Ridgeway, A. G., McMenamin, J., Leder, P. P53 levels determine outcome during beta-catenin tumor initiation and metastasis in the mammary gland and male germ cells. Oncogene. 25, 3518-3527 (2006).
  17. Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model. J Vis Exp. (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics