Microiniezione per Transgenesi e Genome Editing in Threespine spinarelli

Developmental Biology

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Summary

Manipolazioni transgeniche e la modifica del genoma sono fondamentali per il collaudo funzionale i ruoli dei geni ed elementi -regulatory cis. Ecco una dettagliata protocollo microiniezione per la generazione di modifiche genomiche (compresi costrutti Tol2-mediate fluorescenti giornalista transgene, Talens, e CRISPRs) è presentato per il pesce modello emergente, il Spinarello.

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Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055, doi:10.3791/54055 (2016).

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Abstract

Il pesce Spinarello è emersa come un potente sistema per studiare la base genetica di una vasta gamma di morfologica, fisiologica, e fenotipi comportamentali. I fenotipi notevolmente diverse che si sono evoluti come le popolazioni marine si adattano agli ambienti di acqua dolce innumerevoli, combinata con la capacità di attraversare le forme marine e d'acqua dolce, forniscono un sistema di vertebrati raro in cui la genetica può essere utilizzato per mappare regioni genomiche il controllo sia evoluto tratti. Eccellenti risorse genomiche sono ora disponibili, facilitando molecolare dissezione genetica dei cambiamenti evoluti. Mentre gli esperimenti di mappatura generano liste di geni candidati interessanti, manipolazioni genetiche funzionali sono necessari per testare il ruolo di questi geni. regolazione genica può essere studiato con plasmidi reporter transgenici e BAC integrate nel genoma utilizzando il sistema trasposasi Tol2. Funzioni di specifici geni candidati e gli elementi -regulatory cis possono essere valutate inducendo miratamutazioni con Talen e CRISPR / Cas9 reagenti modifica del genoma. Tutti i metodi richiedono l'introduzione di acidi nucleici in fecondate embrioni spinarello un cellulare, un compito reso difficile dalla fitta corion di embrioni stickleback e il relativamente piccolo e sottile blastomeri. Qui, un protocollo dettagliato per la microiniezione di acidi nucleici in embrioni spinarello è descritto per le applicazioni transgeniche e la modifica del genoma per studiare l'espressione genica e la funzione, così come le tecniche per valutare il successo di transgenesi e recuperare le linee stabili.

Introduction

Una componente fondamentale di capire come la biodiversità si pone è la determinazione delle basi genetiche e di sviluppo dei cambiamenti fenotipici evoluti in natura. Il pesce Spinarello, Gasterosteus aculeatus, è emerso come un ottimo modello per studiare le basi genetiche dell'evoluzione. Spinarelli hanno subito molti cambiamenti evolutivi adattativi come i pesci marini hanno colonizzato gli ambienti di acqua dolce innumerevoli intorno nell'emisfero settentrionale, con conseguente morfologica drammatico, fisiologici, e cambiamenti comportamentali 1. I genomi di individui di ventuno popolazioni stickleback sono stati sequenziati e assemblati, e una mappa linkage alta densità è stato generato per migliorare ulteriormente il gruppo 2,3. Esperimenti di mappatura genetici hanno identificato regioni genomiche sottostante fenotipi evoluti 4 - 6, e in alcuni casi, i ruoli funzionali di geni specifici sono stati testati 7,8. Un certo numero di regioni genomiche sottostanti cambiamenti morfologici sono stati identificati con promettenti geni candidati, ma questi candidati non sono ancora stati testati funzionalmente 9 - 12. Inoltre, spinarelli sono modelli comuni per gli studi di genetica delle popolazioni / genomica 13,14, speciazione 15, il comportamento 1, endocrinologia 16, ecotossicologia 17, l'immunologia 18 e parassitologia 19. Futuri studi in ciascuno di questi settori beneficeranno della possibilità di eseguire manipolazioni genetiche funzionali in spinarelli. Oltre a manipolare le sequenze codificanti, i ruoli dei geni candidati possono essere valutate studiando le loro sequenze -regulatory cis e funzionalmente crescente, decrescente o eliminando espressione del gene candidato. Microiniezione e transgenesi metodi in spinarelli sono ben stabiliti 7,8,20 e sono stati inizialmente sviluppati utilizzando un meganuclease-mediataMetodo 21 descritto per primo nel Medaka 22. Il metodo microiniezione modificato presentato qui è stato ottimizzato sia per la transgenesi Tol2-mediata e recentemente sviluppato reagenti di modifica del genoma tra Talens e CRISPRs.

Modifiche a cis -regulatory elementi sono pensati per essere critico per l'evoluzione morfologica, come cis -regulatory cambiamenti possono evitare le conseguenze negative pleiotropici di codifica mutazioni 23. Pertanto, prova e il confronto putative sequenze -regulatory cis è diventato un obiettivo centrale di un numero crescente di studi evolutivi. Inoltre, la maggior parte delle varianti di malattie umane sono varianti normative 24,25 e sistemi modello vertebrati sono dolorosamente necessari per studiare cis Funzione di un elemento -regulatory e la logica. I pesci che fertilizzare i loro embrioni esternamente in gran numero offrono potenti sistemi di vertebrati a studiare -Regolamento cis. Il sistema di trasposoni Tol2, in cui commDNA gn per essere integrato nel genoma è fiancheggiato da Tol2 trasposasi siti di legame e di co-iniettato con Tol2 trasposasi mRNA, funziona con alta efficienza per l'integrazione con successo plasmide costruisce sui genomi di pesce 26 - 28. In genere, un potenziale Enhancer è clonato a monte di un promotore basale (come hsp70l 29) e del gene reporter fluorescente come EGFP (enhanced green fluorescent protein) o mCherry in una spina dorsale Tol2 e iniettato con trasposasi mRNA 26. L'osservazione di espressione del reporter fluorescente, sia in embrioni o discendenti con transgeni stabilmente integrati iniettati, fornisce informazioni sulla regolazione spazio-temporale dell'espressione genica guidato dal enhancer putativo. In ulteriori esperimenti, esaltatori validati possono essere utilizzati per guidare sovraespressione tessuto-specifica dei geni di interesse.

Per l'analisi delle più grandi regioni -regulatory cis, di alta qualità genom grande insertolibrerie IC utilizzando cromosomi batterici artificiali (BAC) sono stati costruiti per entrambe le marine e di acqua dolce spinarelli 30. Questi BAC possono essere recombineered per sostituire un gene con un gene reporter fluorescente nel contesto di un grande (150-200 kb) regione genomica 31. Il reporter fluorescente viene poi espressa in un modello spazio-temporale, come determinato dal sequenze regolatrici all'interno del BAC. Per gli studi nei pesci, siti Tol2 possono essere aggiunti alla BAC per facilitare genomico integrazione 32,33. Nelle fasi successive di sviluppo, quando l'ibridazione in situ è tecnicamente impegnativo, la lettura fluorescenza del BAC può essere utilizzato per studiare gli schemi di espressione genica, come è stato dimostrato per stickleback proteina morfogenetica 6 (BMP6) 20. Inoltre, i modelli di espressione fluorescenti in un individuo possono essere monitorati nel corso del tempo, che non può essere realizzato con l'ibridazione in situ. BAC può essere utilizzato anche per aggiungere un additional copia di una regione genomica di aumentare il dosaggio di un gene di interesse.

Per lo studio della funzione del gene, editing genoma è un campo esplosivo espansione che può essere utilizzato per produrre cambiamenti mirati a sequenze genomiche in un'ampia varietà di organismi 34. Trascrizione attivatore-come nucleasi effettrici (Talens) sono, nucleasi modulari sequenza-specifiche originariamente isolato da agenti patogeni delle piante che possono essere progettati proprio per legarsi direttamente ad una sequenza genomica di scelta e di generare un doppio filamento pausa 35,36. Cluster regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / sistemi CAS sono stati originariamente trovati nei batteri e utilizzare un RNA guida e la proteina Cas9 per generare una pausa in una sequenza di DNA bersaglio complementare alla guida 37. La successiva riparazione della rottura a doppio filamento creato da entrambe le Talens e CRISPRs spesso lascia dietro di sé una piccola inserimento o la cancellazione, che possono interferire con la funzione della sequenza bersaglio35-37. In spinarelli, Talens sono stati utilizzati per distruggere l'espressione genica di mira un potenziatore 20, ed entrambi Talens e CRISPRs hanno prodotto con successo le mutazioni in sequenze codificanti (dati non pubblicati). Un protocollo dettagliato per la generazione di CRISPRs per l'utilizzo in zebrafish può essere utilizzato come linea guida per sviluppare CRISPRs per spinarelli 38.

esperimenti di modifica transgenici e genoma richiedono l'introduzione di acidi nucleici in un appena fecondato embrione unicellulare. Con l'introduzione del transgene strumento o del genoma di modifica nelle prime fasi di sviluppo, il numero di cellule figlie geneticamente manipolate in l'embrione è massimizzata. embrioni iniettati vengono poi proiettati visivamente per fluorescenza o molecolarmente sottoposti a screening per le modifiche del genoma. Se le cellule che contribuiscono alla linea germinale sono mirati con successo, il transgene o mutazioni possono essere trasmessi a un sottoinsieme di prole, anche quando post-iniezione letale è elevata. Il pesce a mosaico possono essere outcrossed oincrocia e la loro prole proiettato per recuperare i alleli mutanti o un transgene stabilmente integrata di interesse. Questo protocollo descrive i metodi per l'introduzione di transgeni e l'editing di reagenti genoma in embrioni spinarello uno-cellula e di monitoraggio per le modifiche genomiche di successo.

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Protocol

Tutti i lavori di pesce è stato approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali e l'uso della University of California-Berkeley (numero di protocollo R330).

1. Preparare acidi nucleici per iniezione

  1. Tol2 plasmidi Transgenesi (Adattato da Fisher 26).
    1. Tagliare 10 mcg trasposasi plasmide (PCS-TP) 39 con 10 U Noti nel buffer fornito per 1 ora a 37 ° C per la linearizzazione.
      Nota: Gli accordi materiale di trasferimento può essere richiesto per ottenere plasmidi Tol2.
    2. Estrarre il plasmide taglio con un 25: 24: 1 miscela di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico e etanolo precipitato con acetato di sodio secondo protocolli standard 40. Risospendere plasmide in acqua priva di RNasi 50 ml.
      Nota: fenolo-cloroformio deve essere utilizzato in una cappa e i rifiuti devono essere smaltiti secondo le linee guida istituzionali.
    3. Impostare una reazione Sp6 trascrizione secondo le istruzioni del produttore.
    4. Utilizzare un isolante RNAKit zione per ripulire reazione di trascrizione in base alle istruzioni del fabbricante; risospendere l'RNA in acqua 50 ml RNasi-free.
    5. Rimuovere un'aliquota 1 ml di RNA. Riscaldare a 65 ° C per 5 minuti per denaturare strutture secondarie poi rilassarsi immediatamente in ghiaccio. Fermo restando reazione di trascrizione a -80 ° C.
    6. Eseguire l'aliquota di RNA su un gel 1% agarosio a 0.5x TAE (Tris base, acido acetico, acido etilendiamminotetracetico) tampone di corsa, con uno standard di dimensioni di RNA in una corsia. Il prodotto previsto è 2.200 bp; scartare se> 5% del RNA totale appare in uno striscio inferiore a 2.200 bp, che indica una eccessiva degradazione (Figura 1).
    7. Quantificare l'RNA utilizzando uno spettrofotometro a 260 nm. Diluire a 350 ng / ml in acqua e negozio di 1 ml RNase-free aliquote a -80 ° C (buono per almeno due anni).
    8. Clone Tol2 plasmide reporter (per esempio, utilizzando pT2HE 8 o plasmidi dal kit Tol2 41) con cis- Elemento normativo di interesse. Brevemente, PCR amplificare una sequenza di DNA genomico di interesse con primers contenenti siti di restrizione presenti nel plasmide, digerire il prodotto PCR e il vettore con l'enzima (s), legare l'inserto nel vettore, e trasformare risultante plasmide in E. competente coli 40. Isolare plasmide con un kit che comprende un risciacquo endotossina secondo il protocollo del produttore.
    9. Eseguire una seconda purificazione del plasmide Tol2 con un kit di purificazione PCR secondo il protocollo del produttore. Eluire in 30 acqua priva di RNasi microlitri.
      Nota: la resa di questo passo può essere basso (a volte con il 50% del plasmide ingresso).
    10. Diluire plasmide a ~ 125 ng / ml in acqua RNase-free.

Figura 1
Figura gel mRNA 1. trasposasi. Reazione pro trascrizione purificatacondotto (1 ml) viene riscaldata a 65 ° C, raffreddato in ghiaccio, ed eseguito su un gel di agarosio 1% con 0.5x TAE tampone di corsa a 100 V. Le dimensioni della scala RNA in kilobasi (kb) sono indicati a fianco . La figura intera trasposasi mRNA è una fascia luminosa a ~ 2.2 kb. Una piccola ma accettabile quantità di mRNA degradati o incompleta è visto sotto 2,2 kb. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. BAC Transgenesi (Vedi Suster 32,33 per Tecniche BAC recombineering)
    1. Preparare BAC da E. coli utilizzando il kit di purificazione BAC secondo il protocollo del produttore. Utilizzare precipitazione in etanolo per recuperare il DNA con una sodio acetato-etanolo estrazione del 40 e del DNA risospendere a ~ 250 ng / ml in acqua RNase-free.
    2. Preparare trasposasi mRNA come nella sezione 1.1.
  2. La mutazione induzione con Talens (See Cermak
  3. Utilizzare l'applicazione web-based per la progettazione Talens per il gene di interesse 42. Se possibile, il design Talens ad interrompere un sito di taglio enzima di restrizione per facilitare l'analisi molecolare.
  4. Clone Talens e preparare plasmidi per la trascrizione seguito pubblicati protocollo 35.
  5. Trascrivere TALEN mRNA con una reazione Sp6 trascrizione secondo le istruzioni del produttore e ripulire mRNA come descritto per trasposasi nella sezione 1.1.4. Quantificare con uno spettrofotometro e diluire a 200 ng / ml in RNasi acqua libera. Eseguire TALEN mRNA su un gel per assicurarsi che sia la dimensione corretta e non degradata come descritto al punto 1.1.6.
  6. Progettare un paio di primer PCR per amplificare circa 100-200 bp che circonda la sequenza bersaglio TALEN utilizzando uno strumento di progettazione primer e il target sequenza di DNA 43. Ordinare l'enzima di restrizione adeguato per verificare lesioni al sito di destinazione sulla base di passo 1.3.1.
</ Li>
  • CRISPR Transgenesi (Vedi Talbot e Amacher 38 per la progettazione e la preparazione di CRISPRs):
    1. Progettazione e preparare CRISPRs e Cas9 mRNA secondo il protocollo 38, e nell'ordine appropriato primer di verifica e di enzimi di restrizione, come descritto al punto 1.3.4.
  • 2. Preparare Reagenti iniezione

    1. Utilizzare borosilicato capillari per preparare gli aghi come descritto di seguito.
      Nota: questi capillari non sono i capillari standard utilizzati per la microiniezione zebrafish, e sono fatti di un vetro più spesso e più forte che è fondamentale per forare il corion stickleback dura.
      1. Indossare sempre nitrile o guanti di lattice quando si tira gli aghi, e non consentono aghi per contattare oli per la pelle o pelle.
      2. Determinare i parametri micropipetta tirando empiricamente dai test di rampa seguenti istruzioni fornite dal produttore del estrattore micropipetta. Ad esempio, con una scatola di filamenti, i seguenti parametri sono stati determinato essere ottimale: (calore = 515, Pull = 60, velocità = 60, ritardo = 85, Pressione = 500). Queste impostazioni producono un ago che si assottiglia vertiginosamente a circa 12 ° per ~ 2 mm e poi una lunga estensione che si rastrema a circa 2 ° per ~ 6 mm (figura 2).
        Nota: I parametri corretti variano da estrattore e filamenti, e ciecamente utilizzando un programma senza determinare i parametri prima attraverso test rampa può permanentemente distruggere filamento della estrattore, che è difficile e costoso da sostituire.
      3. Seguire le istruzioni del produttore per tirare almeno 4 aghi micropipetta di vetro borosilicato con le impostazioni determinate in 2.1.2.
      4. aghi Conservare in verticale in vaso di archiviazione capillare con la punta rivolta verso il basso.
      5. Prima di iniettare, posizionare vaso di archiviazione capillare sul ghiaccio per raffreddare gli aghi. Aggiungere un pezzo di carta assorbente umida al barattolo per evitare l'evaporazione una volta che gli aghi sono pieni.
    2. Fertilizzare Eggs (TuttiPassaggi eseguiti a temperatura ambiente)
      1. Striscia uovo frizione gravido spinarello femmina premendo delicatamente l'addome e carezze in un anteriore a posteriore direzione per spingere le uova attraverso la cloaca e in un 35 x 10 mm 2 Petri. Aggiungere un pezzo umido di carta assorbente su un lato della piastra di Petri (non toccare le uova) per creare la camera umida. Mettere il coperchio sulla piastra di Petri in modo da uova rimanere umido.
      2. Euthanize spinarello maschio a 0,025% tricaine-S tamponato con bicarbonato di sodio allo 0,1%.
      3. Taglio aperto l'addome, rimuovere testicoli e macerare in 250 ml soluzione di Hank (vedi Westerfield 44 per il pieno protocollo per la preparazione della soluzione di Hank).
      4. Fertilizzare al massimo 100 uova con la soluzione di sperma 50 ml e mescolare delicatamente con la punta della pipetta al fine di garantire tutte le uova vengono fecondate. Se la frizione è> 100 uova, concimare la metà delle uova successive per garantire che tutti gli embrioni sono in una fase unicellulare al momento dell'iniezione. Le uova possono essere lasciati non fecondatoa RT per fino ad un'ora, e sperma dura generalmente per 1-7 giorni a 4 ° C in soluzione di Hank.
      5. Mantenere gli embrioni coperto con coperchio scatola di Petri dopo la fecondazione per evitare l'essiccazione. Consentire 20-25 min per la prima cella di emergere e gonfiarsi (preparare materiali di iniezione durante questo periodo).
      6. Riempire un piatto di 150 millimetri x 15 mm Petri con acqua stickleback. (Per rendere l'acqua spinarello, prima preparare il 10% di bicarbonato di sodio disciolto in acqua deionizzata. Quindi aggiungere 3,5 g miscela acqua di mare artificiale e 0,217 ml di 10% di bicarbonato di sodio per 1 L di acqua deionizzata, e mescolare / agitare energicamente per sciogliere il sale.)
    3. Preparare la soluzione di iniezione (mentre le uova sono concimazione)
      1. Preparare la soluzione di iniezione in base alla tabella 1 e memorizzare sul ghiaccio.
        Nota: le concentrazioni di alcuni acidi nucleici sono stati aumentati da quelli pubblicati per zebrafish a causa del maggior volume del blastomero stickleback.
    <tr>
    Reagente iniezione Tol2 iniezione BAC iniezione TALEN iniezione CRISPR
    Tol2 mRNA 350 ng 350 ng - -
    DNA 150-200 ng plasmide 200-300 ng BAC - -
    TALEN mRNA - - 200 ng ogni -
    Guida CRISPR RNA - - - 200 ng
    Cas9 mRNA - - - 400 ng
    PBS 0,5% rosso fenolo di inDulbecco 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
    acqua libera RNAsi a 5 ml a 5 ml a 5 ml a 5 ml

    Tabella 1:. Reagenti iniezione Tutte le miscele devono essere pronti a un volume complessivo su 5 ml e conservati in ghiaccio.

    1. Fill Aghi (su ghiaccio; attendere almeno 10 min per Aghi da riempire).
      1. Backfill almeno tre aghi pipettando soluzione per l'iniezione di 0,5 ml sull'estremità smussata superiore dell'ago, mentre gli aghi sono appesi verticalmente in barattolo di stoccaggio capillare. Fare attenzione che la caduta rimane in cima e non cola lungo il lato ed evitare bolle.
      2. Dopo che il liquido rosso ha in gran parte svuotato alla punta appuntita dell'ago, aggiungere un altro 0,5 microlitri fino alla fine smussata dell'ago e lasciar scolare.

    3. Preparare Iniettare Rig e ago per microiniezione

    Nota: Questi passaggi cuna solito essere fatto dopo la concimazione delle uova.

    1. Attiva luce transilluminazione per il microscopio da dissezione e posizionare una lastra di vetro ~ 13 cm x 13 cm sulla base microscopio ottico con il 15 cm intonaco lama sulla parte superiore della lastra di vetro 7. Orientare la sega perpendicolare alla apparecchiatura iniezione con le tacche rivolte verso il porta-aghi.
    2. Accendere alimentazione dell'aria e garantire la pressione è impostata a ~ 200 kPa dal regolatore.
    3. Selezionare la casella di controllo e regolare le impostazioni. Impostare la pressione di ~ 150-175 kPa. Impostare la durata di iniezione a 180 msec.
    4. Allentare il porta aghi, inserire un ago pieno nel supporto fino a quando la resistenza del supporto in gomma può essere sentito, e stringere fino a stringerla.
    5. Regolare l'angolo dell'ago di circa 45 °.
    6. Utilizzare controlli micromanipolatore per regolare l'ago in modo fine è centrato nel campo visivo. Zoom in a ~ 40X di ingrandimento e concentrarsi sulla punta dell'ago, che non dovrebbe essere a contattoil vetro inferiore.
    7. rompere delicatamente la punta dell'ago afferrandolo con una pinza di orologiaio. Idealmente, non si rompono perpendicolarmente, ma piuttosto ad un angolo di ~ 60 °. Rompere vicino alla punta (non più di 2-3 larghezze forcipe lontano dalla fine, figura 2).

    figura 2
    Figura 2. aghi microiniezione Unbroken e rotti. L'ago superiore è ininterrotta e la punta dell'ago fondo è stato rotto con una pinza (freccia). Gli aghi sono riempiti con una soluzione contenente 0,05% di rosso fenolo. Barra di scala = 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    1. Premere il pedale di iniezione più volte per verificare se l'ago è rotto. Dopo pochi tocchi, minuscole goccioline rosse dovrebbero cominciare a uscire da tha fine. In caso contrario, provare a rompere l'ago leggermente più alto.
    2. Se l'ago ha una bolla d'aria, aumentare l'unità contropressione e premere il pedale diverse volte velocemente a lavorare la bolla fuori.
    3. Regolare la contropressione:
      1. Utilizzare la pipetta di trasferimento usa e getta di mettere alcune gocce di acqua stickleback sulla lastra di vetro.
      2. Abbassare delicatamente l'ago in acqua.
      3. Aumentare la pressione indietro fino a quando un flusso debole di liquido rosa emerge dalla ago (indicante pressione positiva).
        Nota: se non c'è abbastanza pressione di ritorno, l'ago elaborare citoplasma per azione capillare. Se c'è troppa pressione posteriore, il volume di iniezione può essere inavvertitamente troppo grande.
      4. Disimpegno ago per quanto possibile in modo che non venga danneggiato durante la preparazione degli embrioni (vedi sotto).
    4. In alternativa, regolare la pressione torna a un'impostazione di pressione più alta in modo che un forte flusso costante di liquido esce l'ago wgallina viene immerso in acqua. Quindi, premendo il pedale per iniettare diventa inutile; tuttavia, l'iniezione deve essere eseguita rapidamente per evitare un eccesso di iniezione.
      Nota: Non tentare questa tecnica quando prima imparare a iniettare.

    4. microiniezione

    1. Circa 25 minuti dopo la fecondazione, utilizzare due punte 10 microlitri pipetta per rimuovere 5-10 embrioni da la frizione e trasferimento in lastra di vetro.
    2. Sempre con i puntali, separare delicatamente gli embrioni in singole rientranze della lama. Fare attenzione a non forare embrioni.
    3. Usando una pipetta con l'estremità tagliata in modo da embrioni spinarello si inserisce all'interno, aggiungere acqua stickleback sufficiente a coprire gli embrioni, lasciare l'acqua per 3-5 secondi, quindi rimuovere l'acqua in eccesso con la pipetta, lasciando una piccola quantità di acqua di rivestimento ogni embrione.
      Nota: Troppa acqua provoca le chorions a indurirsi e rompere l'ago, ma una piccola quantità di acqua è necessario sollevare il chorion dalla cella e tuorlo (Figura 3A - B).
    4. Partendo con la più embrione distanza, far scorrere la piastra di vetro e l'immagine in modo che il primo embrione riempie circa il 25% del campo visivo.
    5. Abbassare l'ago nel campo visivo, quindi utilizzare il puntale 10 microlitri per ruotare delicatamente l'embrione di identificare blastomero, un granuloso, leggermente giallo leggermente rialzato di citoplasma in cima al tuorlo (Figura 3B), e quindi ruotare in modo che blastomero è direttamente perpendicolare all'estremità dell'ago (mantenendo l'embrione nella rientranza della lama, Figura 3C).
      Nota: le goccioline tuorlo possono muovere come l'embrione viene ruotata, in modo da non li utilizzare come quadro di riferimento per la posizione del blastomeri.
    6. Abbassare l'ago nel citoplasma, ma non spingere fino al tuorlo sottostante. Applicare una pressione lentamente e in modo uniforme quando penetrante corion per evitare di rompere l'ago. Se lacurve ago gravemente, si ritirano e riprovare in una posizione leggermente diversa.
    7. Premere il pedale 3-4 volte per iniettare in modo che un bolo rosso con bordi leggermente diffuse riempie circa ~ 1/8 di diametro del citoplasma (vedere Figura 3D).
      1. Evitare ottenendo un bolo rosso con bordi taglienti che non iniziano diffondere, che indica iniezione nel tuorlo sotto citoplasma (Figura 3E).
      2. Se una macchia rosso-rosato brillante diffonde rapidamente, inserire l'ago ulteriormente per forare la blastomeri.
      3. Se il bolo iniezione diventa giallo istantaneamente, ruotare l'embrione al fine di garantire la blastomere è stato preso di mira e iniettare di nuovo (Figura 3F).

    Figura 3
    Figura 3. Aspetto di embrioni stickleback prima e dopo l'iniezione. Tutti gli embrioni sono tratte da the prospettica guardando attraverso il microscopio (tranne C 'e G). (A) Prima di aggiungere acqua, embrioni fecondati hanno un aspetto uniforme con goccioline di olio galleggiante vicino alla parte superiore del tuorlo. (B) Dopo aggiunta di acqua, si gonfia corion, rivelando un blastomere che sporge dal tuorlo ed è visibile in profilo. (C) Rotazione dell'embrione in modo che l'ago entri perpendicolarmente al corion e blastomero. (C ') Vista laterale di un ago che ha perforato il corion con la punta nel citoplasma. (D) iniezione nel citoplasma risultati in una macchia rossa con bordi diffuse che si dissolvono nel tempo. (E) Iniezione nel tuorlo alla base dei risultati citoplasma in una macchia rossa con bordi definiti. (F) Iniezione nel tuorlo opposta risultati citoplasma in un cambiamento di colore pH indotta dal rosso al giallo. (G) Lateralvista dei risultati di iniezione, con Xs oltre sedi di iniezione sub-ottimali. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    1. Utilizzare i controlli micromanipolatore per ritrarre l'ago, utilizzando la punta della pipetta 10 microlitri di tenere premuto l'embrione, se si attacca all'ago.
    2. Dopo ritrarre l'ago, far scorrere la piastra di vetro per allineare la successiva embrione con l'ago.
    3. Dopo l'iniezione tutti gli embrioni, utilizzare la pipetta per aggiungere l'acqua per gli embrioni, poi raccoglierli nella pipetta di trasferimento e il luogo in 150 millimetri Petri piatto pieno di acqua stickleback.
    4. Asciugare la lastra di vetro con un tovagliolo di carta per evitare di accumulare troppa acqua.
    5. Distribuire embrioni freschi sulla sega e ripetere i passaggi 4.4 tramite 4.10.
    6. Tenere ~ 10% degli embrioni come controlli uninjected per garantire che gli embrioni uninjected sviluppano normalmente e da utilizzare come controlli wild-type per tegli saggi molecolari descritto di seguito.

    5. Cura iniezione Messaggio

    1. Incubare gli embrioni in piastre di Petri a 18 ° C dopo l'iniezione fino alla schiusa 10. A seguito di schiusa, le larve posteriore in acquari come descritto 10.
    2. Delicatamente versare l'acqua spinarello un giorno dopo l'iniezione e sostituire con acqua fresca stickleback. Sostituire con acqua fresca spinarello almeno ogni due giorni dopo.
    3. Verificare la presenza di embrioni morti o malformati quotidiana. Rimuovere tali embrioni per evitare il decadimento di contaminare l'acqua.

    6. Analisi dei risultati iniezione

    1. Per l'iniezione di reporter fluorescenti, monitorare embrioni quotidianamente in una stanza buia utilizzando un microscopio da dissezione fluorescenza con GFP o RFP filtro (a seconda del transgene fluorescente). Registra modelli anatomici di espressione genica con fotografie digitali e / o descrizioni scritte e tabulazione del numero di pesce con diversi Expresdomini sione (figure 4 e 5).
      Nota: Gli spinarelli hanno autofluorescenti, cellule stellate pigmento che sono visibili sotto filtri GFP con inizio alle 4 giorni dopo la fecondazione (DPF).
      1. Per generare linee stabili, salvare gli embrioni con fluorescenza rilevabile e crescere fino all'età adulta, come descritto 10.
      2. Outcross iniettato pesci adulti di wild-type pesce utilizzando la procedura di fecondazione in vitro descritto nella sezione 2.2 e prole schermo per la fluorescenza come descritto al punto 6.1 per cercare prole fluorescente, che indica la trasmissione transgene successo.
      3. Per visualizzare la fluorescenza in covato, priva di nuoto larve, aggiungere 500 microlitri 0,8% Tricaine al piatto 150 millimetri di Petri anestetizzare il pesce e aspettare fino alla fermata di pesce in movimento all'immagine. Sciacquare immediatamente più volte con acqua fresca spinarello seguente osservazione e di imaging.
      4. Facoltativamente, per preservare la fluorescenza per ulteriori immagini, eutanasia larve0,025% (250 mg / L) Tricaine tamponata con bicarbonato di sodio allo 0,1% e fissare per 4 ore in paraformaldeide al 4% in 1x tampone fosfato (PBS) a 4 ° C. Conservare in 1x PBS per un massimo di due settimane.
        Nota: sfondo auto-fluorescenza aumenta nel tempo.
    2. Diagnostico PCR / genotipizzazione digestione per Mutation induzione con CRISPRs o Talens - meglio eseguita in 2 giorni dopo la fecondazione.
      1. Utilizzare una pipetta di inserire 10 embrioni iniettati (2 DPF, ancora in chorions) nei primi 10 pozzetti di una ben 12 PCR tubo striscia. Mettere pesci di controllo uninjected negli ultimi due pozzi.
      2. Rimuovere l'acqua in eccesso stickleback.
      3. Aggiungere 50 microlitri tampone di lisi (10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0.3% Tween-20, e 0,3% NP-40) in ciascun pozzetto.
      4. Inserire tappi su tubi e incubare a 95 ° C per 20 minuti in un termociclatore.
        Nota: Il tuorlo diventa bianca e gommosa dopo la fase di ebollizione.
      5. Rimuovere i coperchi e utilizzare un diverso CLEun puntale 1.000 ml macerare l'embrione in ogni tubo.
        Nota: detriti bianca raccoglierà sul fondo della provetta.
      6. Aggiungere 2,5 ml di 10 mg / ml proteinasi K a ciascun pozzetto.
      7. Sostituire coperchi e incubare a 55 ° C per 1 ora per digerire proteine, seguito da 95 ° C per 20 minuti per inattivare proteinasi K. Conservare a -20 ° C per evitare la crescita di muffe.
      8. Eseguire la PCR usando una polimerasi ad alta fedeltà seguendo le istruzioni del produttore. Utilizzare il lisato embrione come modello di DNA.
        Nota: fare attenzione per rimuovere il liquido dalla parte superiore del tubo di DNA stampo, evitando qualsiasi corion visibile o detriti tuorlo sul fondo della provetta.
      9. Mescolare il prodotto di PCR in ugual volume con una master mix enzima di restrizione contenente tampone specifici enzimi 1x e 0,25 enzima microlitri per campione. Salvare sempre metà del prodotto uncut PCR per saggiare su un gel per confermare i prodotti di PCR sono la dimensione prevista. Incubare la PCR mescolato con l'enzima nelle condizioni appropriate perl'enzima di restrizione.
        Nota: Alcuni enzimi possono richiedere altri rapporti di tampone enzima prodotto di PCR; regolare la concentrazione di buffer se i controlli uninjected non mostrano completa digestione.
      10. Dopo la digestione, prodotti eseguiti su un 1% gel accanto a una scala dimensione del DNA per confermare la dimensione dei prodotti attesi.
        Nota: bande non tagliati in embrioni iniettati indicano la presenza di lesioni molecolari (Figura 6) e controlli uninjected devono essere completamente digeriti per interpretare i risultati.
      11. Per confermare le lesioni, tagliare le bande non tagliati dal gel di agarosio e purificare il DNA con un kit di estrazione gel. Utilizzare sequenziamento Sanger, preferibilmente utilizzando un primer di sequenziamento interno ai primer PCR, per confermare le lesioni. In F 0 iniettato embrioni, un mix di lesioni sarà probabilmente presente, causando la qualità del Sanger leggi di degradare vicino al sito di destinazione.
      12. Per produrre una linea stabile, salvare tutti gli embrioni iniettati da frizioni che schermano positivo per le lesioni molecolari. solremare fino pesce, outcross, e quindi schermo un sottoinsieme di F 1 embrioni per lesioni molecolari come descritto nei punti 6.2.1 attraverso 6.2.11. Se vengono individuati i portatori eterozigoti, far crescere il restante F 1 embrioni di età adulta e identificare gli individui eterozigoti utilizzando DNA estratto da una clip pinna caudale.

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    Representative Results

    Per transgeni Reporter gene che hanno attività enhancer, iniezione di successo si tradurrà in specifico, espressione cellulare del transgene (Figura 4A, 4C). Pesci iniettati possono essere outcrossed per produrre linee stabili (esempio di una linea stabile BAC mostrato nella Figura 4B). L'iniezione di DNA in embrioni stickleback in genere si traduce in letalità di gran lunga superiore rispetto alla sola RNA. È tipico vedere fino al 50% (a volte anche di più) letalità o malformazione (vedere Figura 4D - F, 4I) dopo l'iniezione Tol2 giornalista costrutti (simile al metodo precedentemente descritto meganuclease 21). Tuttavia, i risultati variano ampiamente basati sul costrutto specifico, la morfologia dell'embrione, e livello di abilità. Per un enhancer attiva, 40-50% di embrioni generalmente mostrerà espressione del transgene tessuto-specifica, per esempio in mediana e pettorali alette (FIGURA 5). Il grado di sfondo e di fluorescenza non specifica (Figura 4G - I) varia ampiamente basata sul promotore utilizzato; il promotore hsp70l zebrafish tende ad essere incapace di ritenere, in particolare nel muscolo e nel tessuto neurale, e BAC tendono ad avere elevata espressione di fondo nel tuorlo (simile alla figura 4G). La carpa beta actina 41 promotore è meno permeabile, ma spinge anche notevolmente più debole espressione GFP. Trasmissione di Tol2 transgeni plasmide può essere alto, fino al 100% di GFP + F 0 pesci produrre progenie transgenica (Tabella 2). Tuttavia, la percentuale di progenie trasportano il transgene varia ampiamente, da <1% al 72% (Tabella 2). Salvataggio solo GFP + embrioni iniettati generalmente aumenta l'efficienza della trasmissione. BAC tendono ad avere tassi di transgenesi molto più bassi, con solo fino al 10% di F 0 embrioni spinarello iniettati mostrano fluorescenza nei tessuti attesi. il transtasso missione del BAC è inferiore a quella di costrutti plasmidici, con solo fino al 14% di stickleback schermato trasmissione del BAC (Tabella 2), che è simile al tasso di trasmissione riferito 15% in zebrafish 32.

    In contrasto con la relativamente bassa efficienza di BAC transgenesi, tipicamente 70-100% del pesce schermato iniettato con TALENS avere lesioni mosaico (n = 10 iniettata innesti che sono stati selezionati per le lesioni). Questo numero potrebbe essere inferiore con un paio TALEN meno efficiente, e può variare in qualità di iniezione. La Figura 6 mostra una digestione PCR / restrizione per 10 embrioni da una singola frizione iniettato con TALENS mira un sito di taglio all'interno PvuII Tfap2a. Un amplicone uncut in ciascuno degli embrioni iniettati (corsie 1-10) indica che una parte delle cellule in ciascun embrione portare lesioni al locus bersaglio, anche se ogni embrione è altamente mosaico con una significativa banda cut wild-type. the amplicon da embrioni uninjected a corsie 11-12 sono completamente digerito con PvuII. mutazioni TALEN-indotte sono prontamente trasmessi alla generazione successiva. Con due diversi TALEN imposta, il 50% e il 90% di screening F 0 s lesioni trasmessi alla prole, con il 20-90% della prole che trasportano lesioni in frizioni positivi (Tabella 3). Mentre CRISPR efficienza / Cas9 non è stato ottimizzato in spinarello, con una guida CRISPR mira Pitx2, uno su tre embrioni iniettati erano lesioni sulla base di Sanger sequenziamento di un prodotto di PCR del target CRISPR (la band non tagliato è stato sequenziato seguente restrizione digestione, Figura 7). La perdita di qualità sequenza al sito di taglio previsto indica un mix di lesioni molecolari sono presenti. Fin ritaglio adulto F 0 pesce e lo screening per le lesioni usando un test PCR e restrizione digestione trovato 10/22 pesce con lesioni somatiche nel pinna. Un sottoinsieme rappresentativo di questi animali sono mostrati in figura 8 </ Strong>; individuo # 3 ha un'alta percentuale di DNA con lesioni, mentre individuo # 2 ha una bassa percentuale di DNA con lesioni.

    Figura 4
    Figura 4. Esempi di embrioni iniettati. (A) mosaico embrione iniettato con un potenziatore che guida l'espressione della GFP a pettorale (asterisco) e alette mediane (punta di freccia) a cinque giorni dopo la fecondazione (DPF). Barra di scala = 500 micron. (B) linea stabile di un tasso alcolemico giornalista che guida l'espressione GFP nel cuore embrionale a 4 dpf. Embrione (C) mosaico iniettato con un potenziatore Col2a1a che guida l'espressione mCherry nella notocorda a 4 dpf. Il A1A enhancer Col2 è stato clonato dal DNA spinarello con primer 5'-CGCTCCTTGAGGGTTTGAGCTG-3 'e 5'-ATACTGTGCTCATTTCGGCCGT-3', che amplifica il potenziatore orthologous conservata riportato in Dale e Topczewski2011 45. (D) Esempio di un embrione normale via di sviluppo iniettato. (E - F) Esempi di embrioni malformati con trauma iniezione; E manca l'occhio sinistro e F ha tessuto necrotico lungo il lato destro (punte di freccia). (G) Esempio di espressione GFP diffusa nel tuorlo, probabilmente il risultato di iniezione nel tuorlo anziché blastomero. (H) Esempio di espressione GFP non specifico a dell'epidermide (punta di freccia). (I) brillante, non specifico, l'espressione della GFP granulare. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 5
    Figura 5. Efficienza di iniezione giornalista costrutto. Dieci frizioni sono stati iniettati con un 190 bp spinarello BMP6 enhancer constrUCT che guida pinna pettorale ed espressione fin mediana a 5 dpf 20. Da ogni frizione, almeno 20 embrioni sono stati segnati per aver tessuto-specifici (pettorali e / o mediana fin) e / o non specifico (tutti gli altri tessuti) l'espressione della GFP. La percentuale di tutti gli embrioni sopravvissuti iniettato con espressione non specifici e tessuto-specifica è mostrato come un grafico a scatole. Linee orizzontali indicano il primo quartile, mediana e terzo quartile; baffi si estendono a dato a 1,5 IQR (range interquartile) del primo e terzo quartile. I dati sono adattati da Erickson et al. 2015. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 6
    Figura 6. PCR e restrizione digestione per lo screening per le lesioni TALEN-indotte. Un paio TALEN mira Tfap2a Clicca qui per visualizzare un grande versione di questa figura.


    Figura 7. Sanger sequenziamento dal mosaico F 0 CRISPR / Cas9 iniettato embrione. Un RNA guida CRISPR (5'-GTGGACCAACCTCACGG-3 ') contro Pitx2 (mostrato in alto) è stato co-iniettata con Cas9 mRNA (trascritto da pCS2-nCas9n plasmide come descritto 38) e gli embrioni sono stati sottoposti a screening per le lesioni con un saggio di enzima di restrizione. La band non tagliata era gel estratto e sequenziato dal sequenziamento Sanger. La qualità di sequenza degrada al sito di scissione previsto (freccia in basso) a causa del mix mosaico di lesioni presenti nell'embrione iniettato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 8
    Figura 8. Analisi della CRISPR F 0 clip pinna caudale. Il DNA è stato preparato da clip pinna da F 0 giovani sollevate da embrioni iniettati con CRISPRs contro Pitx2. Il target / Cas9 CRISPR è stato amplificato con i primer 5'-CTCGGATGACCCTTCAAAAA-3 'e 5'-GGCCCAAATTACCCACATTT-3', e il prodotto è stato digerito con EcoRI. Quattro individui sono mostrati; un prodotto uncut PCR è sulla sinistra e prodotto di PCR digerito è a destra per ogni singolo numero. Prodotto la dimensione della banda uncut (~ 230 bp) nella corsia digerito indica la presenza di una lesione. Gli individui 2, 3 e 4 tutti mostrano segni di una lesione molecolare, indicati con asterischi, con diversi mosaicismo tra individui. Dimensioni scala rilevanti sono indicati sulla sinistra. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Costruire GFP prole / F0 totale proiettato pesce (%) % Prole F1 positivo Nota
    BAC A 6/46 (13%) 4-19%
    BAC B 1/41 (2%) 4%
    BAC C 5/42 (12%) 3-40%
    BAC D 3/22 (14%) 5-15%
    Un plasmide 2/38 (5%) 2-5% tutti gli embrioni F0 schermato, non solo GFP +
    plasmide B 3/16 (19%) <1-8% tutti gli embrioni F0 schermato, non solo GFP +
    plasmide C 1/11 (9%) 10%
    plasmide D 2/11 (18%) 1-45% plasmide D iniettato2 background genetico
    plasmide D 5/5 (100%) 16-72%
    E plasmide 2/3 (67%) 2-22%
    plasmide F 2/6 (33%) <1-65%
    plasmide G 3/8 (38%) 2-56%
    plasmide H 3/18 (17%) non ha segnato
    I plasmide 5/24 (21%) non ha segnato

    Tabella 2:. Efficienze di trasmissione del transgene per BAC e costrutti enhancer F 0 iniettato embrioni sono state sollevate verso l'età adulta e poi outcrossed di wild-type di pesce e la F 1 prole segnato per GFP fluorescenza. Il numero di F 0 individui che ha trasmesso il transgene è espressed come percentuale di tutti schermato F 0 pesci. La gamma di percentuali di F 1 prole portando il transgene è dimostrato anche per quelle frizioni che avevano GFP pesce positivo.

    TALEN % Lesioni F0 trasmissione % Prole F1 positivo
    UN 9/10 (90%) 20-90%
    B 4/8 (50%) 20-72%

    Tabella 3:. Efficienze di trasmissione per due coppie Talen F 0 iniettato embrioni sono state sollevate verso l'età adulta e poi outcrossed di wild-type di pesce e la prole F 1 a screening per le lesioni Talen. La percentuale di individui iniettati trasmissione lesioni è mostrato, così come la gamma di percentuali di prole con lesioni in tali innestiche le lesioni trasmessi. TALEN modo mirato un potenziatore BMP6 20, TALEN B mirata Tfap2a (inedito).

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    Discussion

    Iniettano embrioni stickleback una cella per transgenesi o la modifica del genoma presenta tre sfide principali. In primo luogo, relativamente agli embrioni di zebrafish, lo spinarello embrionali corion è dura e spesso rompere gli aghi. Questo problema può essere superato parzialmente usando micropipette di vetro più spesse e più forti e iniettando perpendicolare al corion (vedi protocollo, figura 2). Assicurare che il meno acqua possibile si aggiunge agli embrioni (quanto basta per causare il corion a gonfiarsi e sollevare via dalla cella) aiuta a ridurre la durezza corion. Il corion indurisce nel corso del tempo, in modo da lavorare in fretta dopo aver bagnato gli embrioni è importante. Mantenere gli embrioni in una camera umida prima dell'iniezione in modo che non si asciugano è anche critico. Alcune frizioni e persino singoli embrioni devono semplicemente chorions molto più spessa e più dura; talvolta passare al successivo embrione o provare con una nuova frizione è la soluzione più semplice. E 'molto più facile da saltare un d embrione ifficult di sostituire un ago danneggiato. Avendo aghi di backup pronto permetterà di continuare le iniezioni nel caso di rottura dell'ago. Quando si somministra BAC, è comune per l'ago a intasare. L'ago può essere unclogged raschiando delicatamente o ri-rompere la punta con una pinza, o utilizzando il pressostato aria costante per eliminare l'ostruzione.

    In secondo luogo, che identifica il primo cellulare nell'embrione è impegnativo; è spesso molto appiattito e difficile per i principianti a vedere, ed è particolarmente visibile quando si cerca direttamente a questo. Spesso il blastomere può essere visto solo come un urto leggermente rialzata nel profilo. Pertanto, è meglio identificare la cella di profilo (Figura 3B) e quindi ruotare delicatamente l'embrione in avanti e di lato in modo che la cella affrontare l'estremità dell'ago angolare (se la cella sarà spesso invisibile da questa angolazione; la colore più scuro del blastomere in figura 3 è esagerato per chiarezza).

    e_content "> Terzo, il targeting citoplasma è anche difficile, specialmente se la prima cella è particolarmente piatta. Mirare per la parte grassa del blastomero (solitamente il centro) migliora la possibilità di iniettare nel citoplasma. L'iniezione nel tuorlo vicino al citoplasma in grado di produrre con successo pesci transgenici, l'efficienza sembra essere aumentato e letalità ridotta quando il citoplasma si rivolge con un singolo puntura. a volte, le singole frizioni avranno blastomeri particolarmente sottili, in modo tale che evitando il tuorlo è quasi impossibile. attesa più di 25 min per iniziare le iniezioni possono aiutare (alcune frizioni non formano un blastomere full size fino a ~ 45 minuti dopo la fecondazione), ma se i blastomeri mai aumento delle dimensioni, è spesso più facile ottenere una nuova frizione di uova che per cercare di iniettare le cellule appiattite .

    Eccessive letalità seguente iniezioni possono verificarsi per diversi motivi. aghi Blunt e / o troppo grande diametro ago potrebbe causare too molti danni alla cella e / o causare una perdita di acido citoplasma. Alcuni costrutti del DNA sembrano essere particolarmente letali; abbassando la concentrazione di DNA può migliorare la sopravvivenza, ma i tassi di transgenesi più bassi. Pulizia plasmidi prima con un kit midiprep che contiene un risciacquo endotossina seguito da un secondo kit di pulizia PCR riduce costruire tossicità. Infine, la modifica del genoma può produrre una perdita di funzione mutazione che è letale per lo sviluppo di embrioni. Riducendo la concentrazione del CRISPR o TALEN mRNA può aumentare il mosaicismo dell'embrione per prevenire letalità, ma può ridurre mutante efficienza di recupero allele.

    Un protocollo precedentemente pubblicato per la generazione di spinarelli transgenici utilizzando un metodo meganuclease 21 ha registrato un tasso di trasmissione del transgene germinale 4-7% da F 0 pesce fondatore. Il metodo Tol2 riportato qui ha provocato fino a una velocità di trasmissione transgene germinale 72% da F 0 pesce fondatore (che indica multipla integrat genomicaioni). Lo studio precedente con un metodo meganuclease riferito il 40% degli embrioni iniettati mostrano espressione GFP specifico, simile a quella riportata qui. Così, mentre i tassi simili di transgenici F 0 fondatori sono osservati per i pesci transgenici generato sia dal meganuclease e metodi Tol2, la velocità di trasmissione germinale appare molto più elevato per transgenici Tol2 mediate.

    Poiché le tecnologie di editing genoma continuano ad avanzare, ancora più specifiche manipolazioni genetiche diventerà possibile in spinarello e altre specie di pesci. Ad esempio, la riparazione diretto 46 e ricombinazione omologa permetteranno swap allele tra marina e genomi stickleback acqua dolce, e CRISPRs modificati possono essere usati per specificamente attivano o inibiscono l'espressione genica 47. Queste tecnologie emozionanti per la modifica del genoma e l'analisi porterà a nuove conoscenze sulla base genetica di molte interessanti caratteristiche morfologiche, fisiologiche, e fenotipi comportamentali in STICklebacks e altre specie di pesci.

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    Disclosures

    Gli autori non hanno nulla da rivelare.

    Acknowledgments

    Questo lavoro è stato finanziato in parte dal NIH R01 # DE021475 (CTM), un NIH predoctoral formazione di Grant 5T32GM007127 (PAE), e un Graduate Research Fellowship NSF (NAE). Ringraziamo Kevin Schwalbach per l'esecuzione di BAC recombineering e iniezioni, Nick Donde per la generazione di dati di sequenziamento Sanger CRISPR, e Katherine Lipari per il feedback utile sul protocollo di iniezione.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Stereomicroscope with transillumination Leica S6e/ KL300 LED
    Manual micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33 Marzhauser M33 Micromanipulator
    Pressure Injecion system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
    Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
    Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
    Magnetic base holder Applied Scientific Instrumentation Magnetic base
    Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
    Iron plate (magnetic base) Narishige IP
    Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-97
    Disposable transfer pipettes Fisher 13-711-7M
    0.5% phenol red in DPBS Sigma  P0290 injection tracer
    #5 forceps, biologie dumoxel  Fine Science Tools 11252-30 for needle breaking
    Micropipette Storage Jar World Precision Instruments E210 holds needles
    6", 6 teeth per inch plaster drywall saw Lenox 20571 (S636RP) hold eggs for injection
    13 cm x 13 cm glass plate any hardware store -
    Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID  World Precision Instruments 1B100-F4 *harder glass than zebrafish injection capillaries
    150 x 15mm Petri dish Fisher FB0875714 raise stickleback embryos
    35 mm x 10 mm Petri dish Fisher 08-757-100A store eggs pre-injection
    Instant Ocean Salt Instant Ocean SS15-10
    Sodium Bicarbonate Sigma S5761-500G
    Tricaine methanesulfonate/MS-222 Western Chemical Inc MS222 fish anaesthesia/euthanasia
    Sp6 transcription kit Ambion AM1340 For transcription of TALENs and transposase mRNA
    RNeasy cleanup kit Qiagen 74104 purify transposase or TALEN RNA
    QiaQuick PCR cleanup kit Qiagen 28104 clean up plasmids for injection
    Proteinase K 20 mg/ml Ambion AM2546 for DNA preparation
    Nucleobond BAC 100 kit Clontech 740579 for BAC DNA preparation
    NotI NEB R0189L
    Phusion polymerase Fisher F-530L
    Qiagen PlasmidPlus Midi kit Qiagen 12943 contains endotoxin rinse buffer
    QIAQuick Gel Extraction Qiagen 28704  for sequencing induced mutations
    Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol Sigma P2069-100ML
    Sodium acetate Sigma S2889-250G
    Ethanol (molecular biology grade) Sigma E7023-500ML
    Agarose Sigma A9539
    50x Tris-acetate-EDTA buffer ThermoFisher B49
    0.5-10 Kb RNA ladder ThermoFisher 15623-200
    Nanodrop  Spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 2000
    Paraformaldehyde Sigma 158127-500G
    10x PBS ThermoFisher 70011-044
    1 kb Plus DNA Ladder ThermoFisher 10787-018
    Potassium Chloride Sigma P9541-500G
    Magnesium Chloride Sigma M8266-100G
    NP-40 ThermoFisher 28324
    Tween 20 Sigma P1379-500ML
    Tris pH 8.3 Teknova T1083
    12-strip PCR tube Thermo Scientific AB-1113

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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