Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

מניפולציות מהונדסות ועריכה הגנום הן קריטיים עבור תפקודית בדיקות התפקידים של גנים ואלמנטים רגולטורית cis. הנה פרוטוקול microinjection מפורט עבור הדור של שינויים גנומיים (כולל מבנים transgene כתב ניאון בתיווך Tol2, TALENs, ו CRISPRs) מוצג לגבי דגים המודל המתהווה, עוקצן threespine.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055, doi:10.3791/54055 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

דג עוקצן threespine התפתח כמערכת רבה עצמה כדי לחקור את הבסיס הגנטי של מגוון רחב של מורפולוגיים, פיסיולוגי, פנוטיפים התנהגותיים. פנוטיפים המגוונים להפליא שהתפתחו כמו אוכלוסיות ימיות להסתגל לסביבת מים מתוקה אינספור, בשילוב עם היכולת לחצות צורות ימיות מים מתוקים, לספק מערכת החולייתנים נדירה בם גנטיקה יכולה לשמש כדי למפות אזורי גנומית שליטה התפתחה תכונות. משאבי גנומי מצוינים זמינים כעת, הקלה לנתיחת גנטיקה מולקולרית של שינויים התפתחו. בעוד ניסויי מיפוי ביצירת רשימות של גני מועמדים מעניינים, מניפולציות גנטיות פונקציונליות נדרשות לבחון את התפקידים של גנים אלה. ויסות גנים ניתן ללמוד עם פלסמידים BACS כתב מהונדסים משולבים לתוך הגנום באמצעות מערכת transposase Tol2. פונקציות של גנים מועמדים ספציפיים ואלמנטים רגולטורית ציס ניתן להעריך על ידי גרימת ממוקדמוטציות עם Talen ו CRISPR / Cas9 ריאגנטים עריכת הגנום. כל השיטות דורשות החדרת חומצות גרעין לעוברי קוצן חד תא מופרה, משימה שנעשתה מאתגר ידי סיסי העבה של עוברת קוצן ואת blastomere הקטנה ורזה יחסית. כאן, פרוטוקול מפורט עבור microinjection של חומצות גרעין לעוברי קוצן מתואר ליישומים מהונדסים הגנום עריכה ללמוד ביטוי גנים ותפקוד, כמו גם טכניקות כדי להעריך את ההצלחה של transgenesis ולשחזר קווי יציבה.

Introduction

מרכיב בסיסי אחד של הבנה כיצד מגוון ביולוגי המתבקשת הוא לקביעת הבסיסי הגנטי והתפתחותיים של שינויים פנוטיפי התפתחו בטבע. דג עוקצן threespine, Gasterosteus aculeatus, התפתח מודל מצוין לחקר הבסיס הגנטי של אבולוציה. הקוצנים עברו שינויים אבולוציוניים אדפטיבית רבים כמו דגים ימיים יישבו בסביבות מים מתוקים אינספור ברחבי חצי הכדור הצפוני, וכתוצאה מכך מורפולוגיים דרמטי, פיזיולוגיים, ושינויים התנהגותיים 1. בגנום של אנשים מגובה של עשרים ואחד אוכלוסיות קוצן היה רצף והרכיבו, ומפה הצמדה צפיפות גבוהה נוצרה על מנת לשפר יותר את מכלול 2,3. ניסויי מיפוי גנטיים זיהו אזורים גנומית שבבסיס פנוטיפים התפתחו 4 - 6, ובעוד כמה מקרים, התפקידים התפקודיים של גני מועמדים ספציפיים נבדקו 7,8. מספר האזורים גנומית שבבסיס שינויים מורפולוגיים זוהה עם גני מועמדים מבטיחים, אך מועמדים אלו טרם נבדקו מבחינה תפקודית 9 - 12. בנוסף, הקוצנים הם מודלים נפוצים ללימודים של גנטיקה של אוכלוסיות / הגנומיקה 13,14, התפצלות 15, התנהגות 1, אנדוקרינולוגיה 16, ecotoxicology 17, אימונולוגיה 18 ופרזיטולוגיה 19. מחקרים עתידיים בכל אחד מהתחומים הללו ייהנו היכולת לבצע מניפולציות גנטיות תפקודיות הקוצנים. בנוסף מניפולצית רצפי הקידוד שלהם, את התפקידים של גני מועמדים ניתן להעריך על ידי לימוד הרצפים רגולטורית ציס שלהם ועל ידי הגדלה מבחינה תפקודית, קטן, או ביטול הביטוי של גן המועמד. שיטות Microinjection ו transgenesis ב הקוצנים מבוססות היטב 7,8,20 ו בתחילה פותחו באמצעות meganuclease בתיווךשיטה 21 תוארה לראשונה בשנת medaka 22. שיטת microinjection השונה המוצגת כאן כבר אופטימיזציה עבור שניהם transgenesis Tol2 בתיווך ופתחה לאחרונה ריאגנטים עריכת הגנום כולל TALENs ו CRISPRs.

שינויי האלמנטים רגולטורית ציס נחשבים קריטי לאבולוציה מורפולוגיים, כמו השינויים רגולטורית ציס יכולים למנוע את ההשלכות השליליות של pleiotropic קידוד מוטציות 23. לכן, בדיקה והשוואת רצפים רגולטורית ציס משוערים הפכה ליעד מרכזי של מספר גדל והולך של מחקרים אבולוציוניים. בנוסף, רוב גרסאות מחלות אנושיות הן גרסאות רגולטוריות 24,25, ומערכות חוליות מודל נדרשים עז ללמוד לתפקד אלמנט רגולטורית ציס וההיגיון. דגים כי לדשן העוברי שלהם כלפי חוץ במספרים גדולים להציע מערכות חוליות רבות עצמה כדי לחקור -regulation cis. מערכת transposon Tol2, שבו foreiDNA GN להיות משולבת בגנום מוקף Tol2 transposase אתרי קישור ושיתוף הזריקו Tol2 transposase mRNA, עובד עם יעילות גבוהה לשילוב בהצלחה פלסמיד בונה לתוך הגנום דגים 26 - 28. בדרך כלל, משפר הפוטנציאל הוא משובטים במעלה הזרם של האמרגן הבזליים (כגון hsp70l 29) ואת הגן כתב ניאון כגון EGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת) או mCherry בתוך עמוד השדרה Tol2 והזריקו עם transposase mRNA 26. תצפית ביטוי של כתב הניאון, בין אם עובר מוזרקים או צאצא עם transgenes משולב ביציבות, מספקת מידע על ויסות spatiotemporal של ביטוי גנים מונעת על ידי המשפר המשוער. בניסויים נוספים, משפרי תוקף ניתן להשתמש בכונן ביטוי יתר ספציפי רקמות של גנים של עניין.

באשר לניתוח אזורי רגולטורית ציס גדולים, באיכות גבוהה genom בקנה הכנסic ספריות באמצעות כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי (BACS) נבנו עבור שני הקוצנים ימיים מים מתוקים 30. Bács אלה ניתן recombineered להחליף גן עם גן כתב ניאון בהקשר של (kb 150-200) גדול באזור הגנומי 31. כתב הניאון מתבטא אז דפוס spatiotemporal כפי שנקבע על ידי רצפי רגולציה בתוך BAC. עבור מחקרים בדגים, אתרי Tol2 ניתן להוסיף גם את BAC כדי להקל אינטגרציה הגנומי 32,33. בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות כאשר הכלאה באתרו הוא מאתגר מבחינה טכנית, את ההודעה הניאון של BAC יכול לשמש כדי לחקור דפוסי ביטוי גנים, כפי שהוכח לחלבון קוצן עצם המוךפו"גנטי שהולך 6 (Bmp6) 20. בנוסף, דפוסי ביטוי ניאון אדם יכול להיות במעקב לאורך זמן, אשר לא יכול להיות מושלם עם הכלאה באתרה. Bács יכול לשמש גם כדי להוסיף additionaעותק l של אזור גנומי כדי להגדיל את המינון של גן של עניין.

לצורך המחקר של תפקוד הגן, עריכת הגנום הוא השדה המתרחב בפיצוץ, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר שינויים ממוקדים אל רצפי הגנום במגוון רחב של אורגניזמים 34. מפעיל דמוי תמלול nucleases מפעיל (TALENs) הם nucleases מודולרי, ספציפית רצף מבודד במקור פתוגנים צמח יכול להיות מהונדסים בדיוק להיקשר ישירות רצף גנומי של בחירה וליצור גדיל כפול לשבור 35,36. באשכולות בקביעות interspaced חזרות palindromic קצר (CRISPR) / מערכות CAS נמצאו במקור חיידקים להשתמש RNA מדריך ואת החלבון Cas9 כדי ליצור הפסקה ברצף ה- DNA היעד משלים מדריך 37. התיקון בדיעבד של הפסקת הגדיל הכפולה שיצרה שתי TALENs ו CRISPRs לעתים קרובות משאיר אחריו כניסה קטנה או מחיקה, אשר יכול לשבש את הפונקציה של רצף היעד35-37. בשנת הקוצנים, שימשו TALENs לשבש ביטוי גנים על ידי מיקוד משפר 20, ושניהם TALENs ו CRISPRs יצרו בהצלחה מוטציות קידוד רצפים (נתונים שלא פורסמו). פרוטוקול מפורט עבור הדור של CRISPRs לשימוש דג הזברה יכול לשמש כקו מנחה לפתח CRISPRs עבור הקוצנים 38.

מהונדס וניסויי עריכת הגנום דורשים מבוא של חומצות גרעין לתוך עובר חד-תאי שהופרה זה עתה. על ידי הצגת כלי transgene או הגנום עריכת בשלב מוקדם של התפתחות, מספר תאי הבת מניפולציות גנטיות בעובר מוגדל. עובר מוזרק אז מוקרנים חזותיים עבור קרינה או הוקרנתי מולקולרי עבור שינויים בגנום. אם תאי תורם germline ממוקדים בהצלחה, את הגן או המוטציה יכול להיות עברה על קבוצת משנה של צאצאים, גם כאשר הקטלניות לאחר הזרקה היא גבוהות. דג הפסיפס ניתן outcrossed אוintercrossed וצאצאיהם הוקרנו לשחזר את אללים מוטנטים או transgene משולב ביציבות של ריבית. פרוטוקול זה מתאר שיטות להכנסת transgenes ריאגנטים עריכת הגנום לעוברי קוצן חד-תאים וניטור עבור שינויים גנומיים מוצלחים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל העבודה דגים אושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת קליפורניה-ברקלי (מספר פרוטוקול R330).

1. הכינו חומצות גרעין עבור הזרקה

  1. Tol2 פלסמיד Transgenesis (מעובד מתוך פישר 26).
    1. חותכים 10 מיקרוגרם transposase פלסמיד (PCS-TP) 39 עם 10 U NotI במאגר שסופק עבור שעה 1 ב 37 ° C עד linearize.
      הערה: הסכמי העברת חומר עשויים להידרש לקבל פלסמידים Tol2.
    2. חלץ את הפלסמיד לחתוך עם 25: תערובת 1 של פנול: 24 כלורופורם: אלכוהול isoamyl ואת המשקע אתנול עם נתרן אצטט פי פרוטוקולים סטנדרטיים 40. Resuspend פלסמיד ב 50 μl מים RNase חינם.
      הערה: פנול, כלורופורם אמור לשמש במנדף ואת הפסולת חייבת להיות מסולקת כראוי בהתאם להנחיות מוסדיות.
    3. הגדרה בתגובת שעתוק SP6 פי הוראות היצרן.
    4. השתמש RNA Isolערכת ation לנקות תגובת שעתוק על פי הוראות היצרן; resuspend רנ"א 50 מים μL RNase חינם.
    5. הסר aliquot 1 μl של רנ"א. מחממים עד 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לפגל מבנים משניים ומיד לצנן על הקרח. להקפיא נותרי תגובת שעתוק ב -80 מעלות צלזיוס.
    6. הפעל את aliquot RNA על ג'ל agarose 1% ב 0.5x טה (בסיס טריס, חומצה אצטית, חומצת Ethylenediaminetetraacetic) הפעלת מאגר עם תקן גודל RNA בנתיב אחד. המוצר הצפוי הוא 2,200 נ"ב; וזורק אם> 5% של רנ"א הכל מופיעים כתם קטן מ -2,200 נ"ב, אשר מציין שפלה נרחבת (איור 1).
    7. לכמת RNA באמצעות ספקטרופוטומטר ב 260 ננומטר. לדלל 350 ng / μl ב RNase ללא aliquots מים ולאחסן 1 μl ב -80 ° C (טוב במשך שנתיים לפחות).
    8. Clone Tol2 פלסמיד הכתב (למשל, באמצעות pT2HE 8 או פלסמידים מתוך הערכה Tol2 41) עם ציס- אלמנט מווסת של עניין. בקצרה, PCR להגביר רצף הדנ"א הגנומי של עניין עם פריימרים המכילים אתרי הגבלה נמצאים פלסמיד, לעכל את מוצר וקטור PCR עם האנזים (s), ולקשור את הכנס לתוך הווקטור, ולהפוך פלסמיד שנוצר לתוך E. המוסמכת coli 40. לבודד פלסמיד עם ערכה הכוללת שטיפת רעלן פנימית על פי הפרוטוקול של היצרן.
    9. בצע טיהור שנייה של פלסמיד Tol2 עם ערכת טיהור PCR על פי הפרוטוקול של היצרן. Elute ב 30 μl מים RNase חינם.
      הערה: תשואת משלב זו עשויה להיות נמוכה (לפעמים מתחת 50% של פלסמיד הקלט).
    10. לדלל פלסמיד ~ 125 ng / μl במים RNase חינם.

איור 1
באיור 1. ג'ל mRNA Transposase. פרו תגובת שעתוק מטוהר(Μl 1) צינור חומם לטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס, מקורר על הקרח, ולהפעיל על ג'ל agarose 1% עם TAE 0.5x הפעלת המאגר ב -100 V. הגדלים הסולם רנ"א kilobases (kb) מסומנים בצד שמאל . ה- mRNA transposase באורך המלא הוא להקה בהירה ב ~ 2.2 kb. כמות קטנה אך מקובל של mRNA מושפל או שלם נתפסת מתחת 2.2 kb. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. BAC Transgenesis (ראה Suster 32,33 עבור טכניקות BAC Recombineering)
    1. כן BAC מ E. coli באמצעות ערכת טיהור BAC על פי הפרוטוקול של היצרן. השתמש משקעים אתנול להתאושש DNA עם מיצוי אצטט-אתנול נתרן תקן 40 ו- DNA גלולה ב ~ 250 ng / μl במים RNase חינם.
    2. כן mRNA transposase כאמור בסעיף 1.1.
  2. מוטציה אינדוקציה עם TALENs (ראה צ'רמאק
  3. השתמש יישום מבוסס אינטרנט לעצב TALENs עבור הגן של עניין 42. במידת האפשר, עיצוב TALENs לשבש אתר לחתוך אנזים הגבלה כדי להקל על ניתוח מולקולרי.
  4. Clone TALENs ולהכין פלסמידים עבור שעתוק הבאים שפורסמו פרוטוקול 35.
  5. לתמלל Talen mRNA עם התגובה שעתוק SP6 פי הוראות היצרן ולנקות mRNA כפי שתואר עבור transposase בסעיף 1.1.4. לכמת עם ספקטרופוטומטר לדלל 200 ng / μl במים חינם RNase. הפעל Talen mRNA על ג'ל כדי לוודא שהוא בגודל הנכון ולא מושפל כמתואר בשלב 1.1.6.
  6. עיצוב זוג פריימרים PCR כדי להגביר כ 100-200 נ"ב שמסביב רצף היעד Talen באמצעות כלי עיצוב פריימר ואת רצף ה- DNA היעד 43. הזמן את אנזים ההגבלה המתאים לבדוק עבור נגעים באתר היעד מבוססים על צעד 1.3.1.
</ Li>
  • CRISPR Transgenesis (ראה טאלבוט Amacher 38 לעיצוב הכנת CRISPRs):
    1. CRISPRs תכנון להכין Cas9 mRNA על פי פרוטוקול 38, ו פריימרים ו אנזימי הגבלה האישור המתאים כדי כמתואר בשלב 1.3.4.
  • 2. כן ריאגנטים הזרקה

    1. השתמש בורוסיליקט נימים להכין מחטים כפי שנראה בהמשך.
      הערה: הנימים אלה אינן הנימים הסטנדרטיות המשמשות עבור microinjection דג הזברה, והם עשויות זכוכית עבה וחזקה כי הוא קריטי לנקב את סיסית קוצן הקשוחה.
      1. תמיד ללבוש כפפות ניטריל או לטקס בעת משיכת מחטים, ואינם מאפשרים מחטים לפנות שמנים העור ובעור.
      2. לקבוע פרמטרים משייכי micropipette אמפירית על ידי בדיקות רמפה בעקבות הוראות היצרן של micropipette חולץ. לדוגמא, עם נימת קופסא, את הפרמטרים הבאים היו להרתיעממוקש להיות אופטימלי: (חום = 515, משוך = 60, מהירות = 60, עיכוב = 85, לחץ = 500). הגדרות אלה מייצרות מחט כי נרות בתלילות על כ 12 מעלות במשך ~ 2 מ"מ ואז סיומת ארוכה כי נרות בכ 2 מעלות במשך ~ 6 מ"מ (איור 2).
        הערה: הפרמטרים הראויים ישתנו לפי חולץ ו נימה, ו בעיוורון באמצעות תכנית מבלי לקבוע את הפרמטרים ראשונים באמצעות בדיקות רמפה יכולה להרוס את הנימה של החולץ לצמיתות, וזה קשה ויקר להחליף.
      3. עקוב אחר הוראות היצרן כדי למשוך לפחות 4 מחטים micropipette מן הכוס בורוסיליקט עם ההגדרות שנקבעו 2.1.2.
      4. מחטי חנות אנכיות קנקן נימים עם הקצה החד כלפי מטה.
      5. לפני ההזרקה, להציב קנקן נימים על קרח לצנן מחטים. להוסיף פיסת מגבת נייר לחה כדי הצנצנת כדי למנוע אידוי פעם המחטים מלאות.
    2. להפרות ביציות (כלצעדים הנערכת ב RT)
      1. רצועת המצמד הביצית מן קוצן נקבה הרה להולדת על ידי כיווץ הבטן בעדינות ומלטפת בבית הקדמי אל האחורי כיוון לדחוף את הביצים החוצה דרך הביב לתוך 35 x 10 מ"מ 2 בצלחת פטרי. הוספת חתיכת לחי מגבת נייר בצד אחד של צלחת פטרי (לא נוגע ביצים) ליצור תא לחות. מניחים את המכסה על צלחת פטרי כך ביצים להישאר לחה.
      2. להרדים קוצן גברי 0.025% Tricaine-S שנאגר עם סודיום ביקרבונט 0.1%.
      3. גזור לפתוח את הבטן, להסיר האשכים מרוכך ב 250 הפתרון של μl האנק (ראה Westerfield 44 עבור פרוטוקול מלא להכנת פתרון של האנק).
      4. לדשן לכל היותר 100 ביצים עם 50 μl פתרון זרע ומערבבים בעדינות עם קצה פיפטה כדי להבטיח את כל הביציות מופרות. אם המצמד הוא> 100 ביצים, לדשן מחצית הביצים מאוחר יותר על מנת להבטיח כי כל העוברים נמצאים בשלב אחד תא בזמן ההזרקה. ביצים ניתן להשאיר מופרות ב RT עד שעה, והזרע נמשך בדרך כלל 1-7 ימים ב 4 ° C בתמיסה של האנק.
      5. שמור עובר מכוסה מכסת צלחת פטרי לאחר הפריה כדי למנוע התייבשות. אפשר 20-25 דק 'עבור התא הראשון לצוץ להתנפח (להכין חומרי הזרקה במהלך הזמן הזה).
      6. למלא צלחת 150 מ"מ x 15 מ"מ פטרי עם מי קוצן. (כדי להפוך מי קוצן, להכין ראשון 10% סודיום ביקרבונט מומס במי deionized. לאחר מכן להוסיף 3.5 גרם תערובת מי ים מלאכותי 0.217 מיליליטר של 10% סודיום ביקרבונט לכל 1 ליטר של מים ללא יונים, ומערבבים / לנער במרץ לפזר מלח.)
    3. כן פתרון הזרקה (בעוד ביצים הן זבול)
      1. כן פתרון הזרקה לפי טבלת 1 ולאחסן על קרח.
        הערה: ריכוזי חומצות גרעין כמה כבר עלו מ לאלה שפורסמו עבור דג זברה עקב הכמות המוגברת של blastomere קוצן.
    ther.within-page = "1" height = "301" width = "511"> <tr>
    מֵגִיב הזרקת Tol2 הזרקת BAC הזרקת Talen הזרקת CRISPR
    Tol2 mRNA 350 ננוגרם 350 ננוגרם - -
    DNA 150-200 פלסמיד ng 200-300 ng BAC - -
    Talen mRNA - - 200 ng כל -
    RNA מדריך CRISPR - - - 200 ננוגרם
    Cas9 mRNA - - - 400 ננוגרם
    0.5% פנול אדום inDulbecco של PBS 0.5 μl 0.5 μl 0.5 μl 0.5 μl
    מים חינם RNAse עד 5 μl עד 5 μl עד 5 μl עד 5 μl

    טבלת 1:. ריאגנטים הזריקו כל התערובות צריכים להיות מוכנות כדי בהיקף כולל על 5 μl ומאוחסנים על קרח.

    1. מלאו מחטים (על הקרח; לאפשר לפחות 10 דקות עבור מחטים כדי למלא).
      1. למילוי לפחות שלוש מחטים על ידי pipetting פתרון הזרקה 0.5 μl אל הקצה העליון הקהה של המחט תוך מחטים תלויות אנכיות קנקן נימים. תיזהר כי הירידה נשארת על גבי ואינה לטפטף למטה בצד ולהימנע בועות.
      2. לאחר הנוזל האדום בעיקר נקז אל הקצה המחודד של המחט, להוסיף עוד 0.5 μl אל הקצה הקהה של המחט ולאפשר לו לנקז.

    3. כן להזריק Rig ו מחטי Microinjection

    הערה: ג צעדים אלהלהיעשות לרוב לאחר הפריית הביצים.

    1. הפעל אור שקוף עבור מיקרוסקופ לנתח ומניחים צלחת זכוכית ~ 13 ס"מ x 13 ס"מ על בסיס אור מיקרוסקופ עם 15 ס"מ טיח ראה להב על גבי צלחת זכוכית 7. אוריינט המסור בניצב מנגנון הזרקה עם החריצים הפונה לכיוון בעל מחט.
    2. הפעל אספקת האוויר להבטיח לחץ מוגדר ~ 200 kPa הרגולטור.
    3. הפעל את תיבת הבקרה ולהתאים את ההגדרות. לחץ מוגדר ~ 150-175 kPa. הגדר משך ההזרקה ל -180 מילי-שניות.
    4. שחרר את בעל המחט, להכניס מחט מולא לתוך מחזיק עד התנגדות של בעל הגומי יכולה להיות מורגשת, והדק עד אצבע חזקה.
    5. התאם את זווית המחט כ 45 °.
    6. השתמש בבקרת micromanipulator להתאים את המחט כך בסופו של דבר הוא מרוכז בתחום של נוף. גדל כדי הגדלה ~ 40X ולהתמקד קצה המחט, אשר לא צריך להיות נוגעהזכוכית מתחת.
    7. בעדינות לשבור את קצה המחט על ידי לתפוס אותו עם מלקחיים של שען. באופן אידיאלי, לא לשבור בניצב, אלא בזווית ~ 60 °. לשבור קרוב קצה (לא יותר מ 2-3 רוחבי מלקחיים הרחק בסופו של דבר, איור 2).

    איור 2
    איור 2. מחטי microinjection רצופות שבורות. המחט העליונה היא רצופה ואת קצה המחט התחתונה נשבר עם מלקחיים (חץ). מחטים מלאות בתמיסה המכילה אדום 0.05% פנול. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    1. לחצו על הדוושה הזרקת ברגל מספר פעמים על מנת לבדוק אם המחט היא שבורה. אחרי כמה דפיקות, טיפות אדומות זעירות צריכות להתחיל לצאת tהוא בסופו. אם לא, נסו לשבור את המחט מעט גבוה יותר.
    2. אם המחט יש בועת אוויר, להגדיל את יחידת לחץ בחזרה ולחץ על הדוושה מספר פעמים במהירות כדי לחשב את הבועה.
    3. התאם את הלחץ חזרה:
      1. השתמש פיפטה העברת הפנויה להציב כמה טיפות של מים קוצן על צלחת זכוכית.
      2. בעדינות להוריד את המחט לתוך המים.
      3. להגביר את הלחץ בחזרה עד זרם קלוש של נוזל ורוד עולה מהמחט (המציין לחץ חיובי).
        הערה: אם אין מספיק לחץ בגב, המחט תמשוך את הציטופלסמה ידי פעולת נימים. אם יש יותר מדי לחץ בחזרה, את עוצמת הזריקה יכולה להיות בטעות גדולה מדי.
      4. לחזור בו מחט ככל האפשר, כך שהוא לא יינזק בעת ההכנה העוברית (ראה להלן).
    4. לחלופין, כוונן את הלחץ חזרה הגדרה בלחץ גבוהה, כך זרם חזק מתמיד של נוזל יוצא מחט wתרנגולת הוא שקוע במים. לאחר מכן, הלחיצה על דוושת הרגל להזריק הופכת מיותרת; עם זאת, הזריקה חייבת להתבצע במהירות כדי למנוע הזרקה מעל.
      הערה: אל תנסה הטכניקה הזו כאשר לומדים הראשון להזריק.

    4. Microinjection

    1. כ -25 דקות לאחר הפריה, משתמשים בשני 10 μl טיפי pipet להסיר 5-10 העוברות מן המצמד והעברת צלחת הזכוכית.
    2. ובכל זאת באמצעות הטיפים pipet, בעדינות להפריד את העוברים לתוך החריצים הפרט של להב המסור. היזהר שלא לנקב עובר.
    3. באמצעות העברת pipet עם סוף לנתק כך עובר קוצן יוכל להיכנס, להוסיף מי קוצן מספיק כדי לכסות את העוברים, להשאיר את המים במשך 3-5 שניות, ולאחר מכן להסיר את עודפי המים עם pipet, עוזב נפח קטן של ציפוי מים כל עובר.
      הערה: מדי מים רבים יגרמו chorions להקשיח ולשבור את המחט, אבל נפח קטן של מים יש צורך להרים את chאוריון מן התא חלמון (איור 3 א - ב).
    4. החל עם הקליעה העובר משם, להחליק את צלחת זכוכית להתקרב כך העובר הראשון ממלא כ -25% של שדה הראייה.
    5. מנמיך את המחט לתוך שדה הראייה, ולאחר מכן השתמש טיפ 10 μl pipet בעדינות לסובב את העובר כדי לזהות את blastomere, בליטה מגורענת, צהובה מורמת מעט של הציטופלסמה על גבי החלמון (איור 3 ב), ולאחר מכן לסובב כך blastomere הוא ישירות בניצב בסופו של המחט (תוך שמירה על העובר הזחה של להב המסור, איור 3 ג).
      הערה: טיפות חלמון יכול להעביר עד העובר הוא הסתובב, ולכן אין להשתמש בהם כמסגרת התייחסות למיקום של blastomere.
    6. מנמיך את המחט לתוך הציטופלסמה אבל לא לדחוף ועד החלמון הבסיסי. החל לחץ לאט ובאופן שווה כאשר הפירסינג הסיסי כדי למנוע שבירת המחט. אםעיקולי מחט קשה, לחזור ולנסות שוב במיקום שונה במקצת.
    7. לחץ על דוושת רגל 3-4 פעמים להזריק כך בולוס אדום עם קצוות מפוזר מעט ממלא כ ~ 1/8 בקוטר של הציטופלסמה (ראו איור 3D).
      1. הימנע קבלת בולוס אדום עם קצוות חדים שלא מתחילים לפזר, דבר שמצביע על הזרקת בחלמון מתחת בציטופלסמה (איור 3E).
      2. אם כתם ורדרד-אדום בוהק מפזר במהירות, הכנס את המחט עוד לנקב את blastomere.
      3. אם בולוס ההזרקה הופך צהוב מיידי, לסובב את העובר על מנת להבטיח את blastomere היווה מטרה ולהזריק שוב (איור 3F).

    איור 3
    איור 3. מראה של עובר קוצן לפני ואחרי ההזרקה. כל העוברים שאובי הפרספקטיבת דואר להסתכל למטה מבעד למיקרוסקופ (למעט ג 'ו-ז). (א) לפני הוספת מים, עוברים מופרים יש מראה אחיד עם טיפות שמן צף בסמוך לחלקו העליון של החלמון. (ב) לאחר הוספת מים, הגלים הסיסיים, חושף blastomere שבולט מן החלמון והיא גלויה פרופיל. (ג) סיבוב של העובר כך המחט נכנסת בניצב הסיסי ו blastomere. (ג ') עם נוף צדדי של מחט אשר נקבה סיסית עם הקצה בציטופלסמה. (ד) הזרקה לתוך תוצאות הציטופלסמה ב נקודה אדומה עם קצוות מפוזרים כי לדעוך עם זמן. (E) הזרקה לתוך החלמון שבבסיס תוצאות הציטופלסמה ב נקודה אדומה עם קצוות מוגדרים. (F) הזרקה לתוך החלמון מול תוצאות הציטופלסמה ב שינוי צבע נגרמת pH מאדום לצהוב. (G) לרוחבלאור תוצאות הזרקה, עם סימן X על פני מקומות הזרקה תת-אידיאליים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    1. השתמש בפקדים micromanipulator לחזור בו את המחט, באמצעות קצה 10 μl pipet להחזיק את העובר אם היא נדבקת אל המחט.
    2. לאחר חוזרת בה המחט, להחליק את צלחת זכוכית כדי ליישר את העובר הבא עם המחט.
    3. לאחר הזרקת כל העוברים, השתמש העברת pipet להוסיף מים העוברים, ולאחר מכן לאסוף אותם פיפטה ההעברה ומניחי 150 מ"מ צלחת פטרי מלא מי קוצן.
    4. להתנגב צלחת זכוכית עם מגבת נייר כדי להימנע מצבירת יותר מדי מים.
    5. פזר עוברת טרי על המסור וחזור על שלבי 4.4 דרך 4.10.
    6. שמור ~ 10% של עוברים בקרות uninjected כדי להבטיח כי עוברי uninjected להתפתח באופן נורמלי ולהשתמש כפקדים wild-type עבור tהוא מבחן מולקולרי כמתואר להלן.

    5. טיפול הזרקת הודעה

    1. דגירה עוברים בצלחות פטרי על 18 מעלות צלזיוס לאחר ההזרקה עד הבקיעה 10. בעקבות בקיעה, זחלים אחוריים באקווריום כמתואר 10.
    2. בעדינות יוצק את היום אחד מי קוצן לאחר ההזרקה ולהחליף מי קוצן טריים. חלף עם מי קוצן טריים לפחות פעם בימים לאחר מכן.
    3. בדקו אם עובר מת או פגום יומי. סר עובר כאלה למניעת עששת מ מזהם את המים.

    6. ניתוח של תוצאות הזרקה

    1. עבור זריקה של כתבים ניאון, לפקח עוברים מדי יום בחדר חשוך באמצעות מיקרוסקופ לנתח ניאון עם GFP או מסנן RFP (תלוי transgene ניאון). לתבניות אנטומיות שיא של ביטוי גנים עם תמונות דיגיטליות ו / או תיאורים בכתב והכנת סיכומים של מספר הדגים עם הבעה שונהתחומי שיאון (איורים 4 ו -5).
      הערה: יש הקוצנים autofluorescent, תאי פיגמנט stellate הנראים תחת מסנני GFP החל לאחר הפריה 4 ימים (DPF).
      1. כדי ליצור קווים יציבים, שמורים עוברת עם קרינה לזיהוי ולגדול לבגרות כמתוארת 10.
      2. Outcross מוזרק דגים בוגרים לדגים wild-type באמצעות ההליך הפריה חוץ גופית המתואר בסעיף 2.2 וצאצאים מסך פלואורסצנטי כמתואר בשלב 6.1 לחפש הצאצאים פלורסנט, המציין שידור transgene מוצלח.
      3. כדי להמחיש הקרינה בקעו, הזחלים הם שוחים חופשיים, להוסיף 500 μl 0.8% Tricaine כדי בצלחת פטרי 150 מ"מ לטשטש דגים ולחכות עד להפסיק דגים נעים לתדמית. מייד לשטוף מספר פעמים עם מי קוצן טרי הבאים תצפית והדמיה.
      4. לחלופין, כדי לשמר קרינת הדמיה נוספת, להרדים זחלים0.025% (250 מ"ג / ליטר) Tricaine שנאגרו עם 0.1% סודיום ביקרבונט ולתקן במשך 4 שעות ב paraformaldehyde 4% ב 1x בופר פוספט (PBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס. אחסן 1x PBS עד שבועיים.
        הערה: עליות אוטומטי קרינת רקע לאורך זמן.
    2. אבחון PCR / Genotyping העיכול לזירוז מוטציה עם CRISPRs או TALENs - הביצועים הטובים ביותר ב 2 ימים לאחר ההפריה.
      1. השתמש העברת pipet למקום 10 עוברים מוזרקים (2 DPF, עדיין chorions) לתוך 10 הבארות הראשונות של צינור רצועת 12 גם PCR. הנח דגים מלאי uninjected בשנתי הבארות האחרונות.
      2. סר מי קוצן עודפים.
      3. הוסף 50 חיץ תמוגה μl (10 מ"מ טריס pH 8.3, 50 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ MgCl 2, 0.3% Tween-20, ו -0.3% NP-40) זה טוב.
      4. כמוסות מקום על צינורות לדגור על 95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ב thermocycler.
        הערה: החלמון יהפוך לבן גומי לאחר שלב הרתיחה.
      5. סר מכסה להשתמש CLE שונהטיפ 1,000 μl pipet מרוכך העובר בצינור אחד.
        הערה: פסולת לבנה תאסוף בתחתית של התחתית.
      6. להוסיף 2.5 μl של 10 מ"ג / K proteinase מ"ל היטב כל אחד.
      7. חלף מכסה לדגור על 55 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 לעכל חלבון, ואחריו 95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להשבית proteinase ק חנות ב -20 ° C כדי למנוע התפתחות עובש.
      8. בצע PCR באמצעות פולימראז נאמנות גבוהה הבאים הוראות היצרן. השתמש lysate העובר כתבנית DNA.
        הערה: היזהר להסיר נוזלים מלמעלה של צינור עבור תבנית ה- DNA, הימנעות מכל סיסי גלויים או פסולת חלמון בתחתית של התחתית.
      9. מערבבים את המוצר PCR נפח שווה עם תערובת אמן אנזים הגבלה המכיל חיץ 1x אנזים ספציפי 0.25 אנזים μl לדגימה. שמור תמיד מחצית מוצר PCR נימול כדי assay על ג'ל כדי לאשר מוצרי PCR הם בגודל החזה. דגירת PCR מעורבב עם אנזים על התנאים המתאימיםאנזים ההגבלה.
        הערה: אנזימים מסוימים עשויים לדרוש יחס אחר של חיץ אנזים למוצר PCR; להתאים את ריכוז החיץ אם בקרות uninjected לא מראות עיכול שלם.
      10. בעקבות עיכול, מוצרים לרוץ על ג'ל 1% agarose ליד סולם גודל DNA כדי לאשר בגדלי תוצר צפויים.
        הערה: להקות נימולו בעוברים מוזרקים להעיד על הנוכחות של נגעים מולקולריים (איור 6) ובקרות uninjected חייבים להתעכל לחלוטין לפרש תוצאות.
      11. כדי לאשר נגעים, לגזור להקות נימולו מן ג'ל agarose ולטהר DNA עם ערכת ג'ל חילוץ. השתמש רצף סנגר, רצוי להשתמש פריימר רצף פנימי אל פריימרים PCR, כדי לאשר נגעים. ב F 0 מוזרק עוברים, שילוב של נגעים יהיו נוכחים סביר, גרימת איכות סנגר לקרוא להשפיל סמוך לאתר היעד.
      12. כדי לייצר קו יציב, לשמור את כל העוברים המוזרקים מציפורניים כי המסך חיובי עבור נגעים מולקולריים. Gשורה למעלה דגים, outcross, ולאחר מכן להקרין קבוצת משנה של עבר F 1 עבור נגעים מולקולריים כמתואר בשלבי 6.2.1 דרך 6.2.11. אם נשאים הטרוזיגוטיים מזוהים, לגדול הנותרים F 1 עוברים לבגרות ולזהות אנשים הטרוזיגוטיים באמצעות DNA מופק קליפ סנפיר הזנב.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    עבור transgenes גן הכתב כי יש פעילות משפרת, זריקה מוצלחת תגרום ביטוי ספציפי, סלולארי של transgene (איור 4 א, ​​4C). דגים מוזרקים לאחר מכן ניתן outcrossed לייצר קווי יציבה (דוגמא קו BAC יציב שמוצג באיור 4B). הזרקת DNA לעוברי קוצן בדרך כלל תוצאות קטלניות גבוהה בהרבה RNA לבד. זה אופייני לראות עד 50% (לפעמים אפילו יותר) קטלני או מום (ראה האיור 4D - F, 4I) לאחר הזרקת כתב Tol2 בונה (דומה לשיטת meganuclease שתואר לעיל 21). עם זאת, התוצאות משתנות בהתאם נרחבת על המבנה הספציפי, המורפולוגיה העוברת, ורמת מיומנות. לקבלת משפר פעיל, 40-50% של עוברים בדרך כלל יציג ביטוי transgene רקמות ספציפיות, למשל סנפירי חציון החזה (Figure 5). מידת רקע הקרינה ספציפי (4G איור - I) משתנה בהתאם נרחב על האמרגן בשימוש; אמרגן hsp70l דג הזברה נוטה להיות דולף, במיוחד שרירי רקמה עצבית, ו BACS נוטה להיות ביטוי רקע גבוה בחלמון (בדומה 4G האיור). אמרגן 41 יקטין קרפיון בטא הוא פחות דולף אבל גם דוחף באופן משמעותי ביטוי של GFP חלש. הילוכים של transgenes פלסמיד Tol2 יכולים להיות גבוהים, עם עד 100% של ה- GFP + F 0 צאצאים מהונדסים לייצר דגים (טבלה 2). עם זאת, אחוז צאצאים נושאים את הגן משתנה מאוד, מ <1% עד 72% (טבלה 2). שמירת עוברים GFP + מוזרק רק מגביר יעילות העברת כלל. Bács נוטה להיות בעלי שיעור transgenesis נמוך בהרבה, עם רק עד 10% של עובר קוצן F 0 מוזרק מראים קרינה ברקמות צפויות. חוצהשיעור משימה של BACS נמוך מזו של בונת פלסמיד, עם רק עד 14% של קוצן הוקרן שידור BAC (הטבלה 2), דומה בקצב העברת הדיווח של 15% ב דג זברה 32.

    בניגוד היעילות הנמוכה יחסית של transgenesis BAC, בדרך כלל 70-100% של דגים הוקרנו הזריקו TALENs יש נגעי פסיפס (ב n = 10 מוזרק מצמדים שהוקרנו עבור נגעים). מספר זה יכול להיות נמוך יותר עם ​​זוג Talen יעיל פחות, ועשוי להשתנות עם איכות הזרקה. איור 6 הראה עיכול PCR / הגבלה במשך 10 עובר מן המצמד יחיד הזריק TALENs מיקוד אתר לחתוך PvuII בתוך Tfap2a. Amplicon נימול בכל אחת עובר המוזרק (נתיבי 1-10) מציין כי חלק מן התאים כל עובר לשאת נגעים על מוקד היעד, אם כי כל עובר הוא פסיפס מאוד עם להקה לחתוך wild-type משמעותי. thamplicon הדואר מעובר uninjected במסלולי 11-12 מתעכל באופן מלא עם PvuII. מוטציות-induced Talen מועברות בקלות לדור הבא. עם שני Talen סטים שונה, 50% ו -90% של הוקרן F 0 s משודרים נגעים לצאצאים, עם 20-90% של צאצאים נושא נגעים ב לופתת חיובית (לוח 3). היעילות בעוד CRISPR / Cas9 לא בוצעה אופטימיזציה ב קוצן, עם מדריך CRISPR אחד מיקוד Pitx2, אחד מתוך שלושה עוברים מוזרקים היה נגעים מבוססים על רצף סנגר של מוצר ה- PCR של יעד CRISPR (הלהקה לא-חתוך רצף הבא עיכול הגבלה, איור 7). ההפסד של איכות רצף באתר לחתוך החזה מצביע על שילוב של נגעים מולקולריים נוכח. דגי הקרנה Fin גזיר מבוגרים F 0 עבור נגעים באמצעות assay PCR ועיכול ההגבלה נמצאו דגי 10/22 עם נגעים סומטיים הסנפיר. לתת-קבוצת נציג של החיות האלה מוצגת באיור 8 </ Strong>; יש בודדים # 3 אחוז גבוה של ה- DNA עם נגעים, בעוד יש בודדים # 2 אחוז נמוך של ה- DNA עם נגעים.

    איור 4
    איור 4. דוגמאות של עוברים מוזרקים. (א) העובר פסיפס מוזרק עם כרית סיליקון שמניע ביטוי של GFP חזה (כוכבי) וסנפירים החציוני (חץ) בשעה שלאחר הפרית 5 ימים (DPF). סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (ב) קו יציב של BAC כתב שמניע ביטוי GFP בלב העוברי ב 4 DPF. (ג) העובר פסיפס מוזרק עם משפר Col2a1a שמניע ביטוי mCherry ב notochord ב 4 DPF. משפר A1a col2 שובט מ- DNA קוצן עם פריימרים 5'-CGCTCCTTGAGGGTTTGAGCTG-3 '5'-ATACTGTGCTCATTTCGGCCGT-3' אשר להגביר את משפר orthologous משומר שדווח דייל Topczewski2011 45. (ד) דוגמא של עובר מתפתח מוזרק בדרך כלל. (E - F) דוגמאות של עוברים לא תקינים עם טראומת הזרקה; E חסר בעין שמאל ו- F יש רקמת נמקי לאורך הצד הימני (ראשי חץ). (G) דוגמה של הביטוי GFP מפוזר ב חלמון, ככל הנראה תוצאה של הזרקת בחלמון ולא blastomere. (H) דוגמא ביטוי GFP הלא ספציפי באפידרמיס (ראש החץ). (I) מואר, הלא ספציפי, ביטוי של GFP פרטנית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 5
    איור 5. יעילות של הזרקת הכתב לבנות. עשר מצמד הזריקו constr משפר Bmp6 קוצן 190 נ"בuct שמניע סנפיר החזה וביטוי סנפיר החציוני 5 DPF 20. מכל מצמד, לפחות 20 עוברים דורגו על כך רקמות ספציפיות (חזה ו / או החציוני סנפיר) ו / או ספציפי (כל רקמות האחרות) ביטוי של GFP. אחוז של כל העוברים שורדים מוזרק שיש הביטוי הלא ספציפית רקמות ספציפיות מוצג בתור boxplot. קווים אופקיים מציינים את הרבעון הראשון, חציון ברבעון השלישי; שפם להאריך הנתון בתוך 1.5 IQR (טווח בין-רבעוני) הרבעון הראשון והשלישי. נתונים מעובדים מנתוני אריקסון et al. 2015. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 6
    איור 6. PCR ועיכול הגבלה למסך נגעים מושרים Talen. צמד Talen מיקוד Tfap2a > נוצר והזריק כמתואר. DNA הוכן כמתואר לעיל מ 2 עוברים DPF מוזרק ושבר 297 נ"ב שמסביב רצף היעד Talen היה PCR מוגבר על ידי DNA פולימרז באיכות גבוהה באמצעות פריימרים 5'-GGGTCGTTGACGTGCGAGTAA-3 '5'-AGCGGGACAACGTCATCACTTA-3 ". Lanes 1-10 מוזרק, נתיבי 11-12 הם uninjected, מתעכלים פקדים נתיבי 13-14 הן בקרות uninjected, לא מעוכלות. PvuII חותך את רצף wild-type לשתי כ להקות בגודל שווה. להקות נימול המצביעות על נוכחות של נגעים מולקולריים רצף היעד. כל העוברים מוזרקים נתיבי 1-10 להראות סימנים של נגעים מולקולריים (להקות מעוכלות), אולם כל העוברים או שיש מוטציות monoallelic ו / או הם פסיפס כפי שהם גם קצצו (wild-type) להקות. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

    e = "1"> איור 7
    איור 7. רצף סנגר מ CRISPR F 0 פסיפס / Cas9 מוזרק העובר. RNA מדריך CRISPR (5'-GTGGACCAACCTCACGG-3 ') נגד Pitx2 (מופיע בצד העליון) היה שיתוף הזריקו Cas9 mRNA (עיבד מ- פלסמיד pCS2-nCas9n כמתואר 38) ועוברים הוקרנו נגעים באמצעות assay אנזים הגבלה. הלהקה לא-חתוך חילוץ ג'ל להפיק ולרצף ידי רצף סנגר. איכות רצף מדרדרת באתר מחשוף חזה (חץ למטה) בשל תמהיל פסיפס של נגעים קיים בעובר מוזרק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    הספרה 8
    איור 8. ניתוח של CRISPR F 0 קליפים סנפיר הזנב. DNA הוכן קליפים סנפיר מ- F 0 קטינים העלה מעוברים הזריקו CRISPRs נגד Pitx2. היעד CRISPR / Cas9 היה מוגבר עם פריימרים 5'-CTCGGATGACCCTTCAAAAA-3 '5'-GGCCCAAATTACCCACATTT-3 ", והמוצר היה מתעכל עם EcoRI. ארבעה בני אדם מוצגים; מוצר נימול PCR הוא מצד שמאל וקבע מתעכל המוצר PCR נמצא בצד ימין עבור כל אדם ממוספרים. מוצרים בגודל של הלהקה נימול (~ 230 נ"ב) בנתיב מתעכל מעיד על קיומו של נגע. אנשים 2, 3 ו -4 כל להראות סימנים של נגע מולקולרי, הצביעו עם כוכביות, עם השתנה פסיפס בין יחידים. בגדלי סולם רלוונטיים מסומנים בצד שמאל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    לִבנוֹת GFP צאצאים / F0 הכולל הוקרן דגים (%) F1 צאצאי% חיוביים הערה
    BAC 6/46 (13%) 4-19%
    BAC B 1/41 (2%) 4%
    BAC C 5/42 (12%) 3-40%
    BAC D 3/22 (14%) 5-15%
    פלסמיד 2/38 (5%) 2-5% כל העוברים F0 הוקרן, לא רק GFP +
    פלסמיד B 3/16 (19%) <1-8% כל העוברים F0 הוקרן, לא רק GFP +
    פלסמיד C 1/11 (9%) 10%
    פלסמיד D 2/11 (18%) 1-45% פלסמיד D מוזרק2 רקע גנטי
    פלסמיד D 5/5 (100%) 16-72%
    פלסמיד E 2/3 (67%) 2-22%
    פלסמיד F 2/6 (33%) <1-65%
    פלסמיד G 3/8 (38%) 2-56%
    פלסמיד H 3/18 (17%) לא קלע
    פלסמיד לי 5/24 (21%) לא קלע

    טבלה 2:. יעילות העברת transgene עבור BACS ובונה משפר F 0 מוזרק עוברים הועלו לבגרות ואז outcrossed לדגים wild-type והצאצאים F 1 וכבש עבור GFP הקרינה. מספר אנשים F 0 ששידר את הגן הוא expressed כאחוז מכלל דגי F 0 הוקרן. הטווח של אחוז צאצאי F 1 נושאים את הגן גם מוצג עבור מצמדים אלה היו GFP דגים חיוביים.

    Talen % נגעי משדר F0 F1 צאצאי% חיוביים
    א 9/10 (90%) 20-90%
    B 4/8 (50%) 20-72%

    טבלה 3:. יעילות הילוכים שני זוגות Talen F 0 מוזרק עוברים הועלו לבגרות ואז outcrossed לדגים wild-type והצאצאים F 1 לגילוי נגעים Talen. אחוז האנשים המוזרקים משדר נגעים מוצג, כמו גם המגוון של אחוז צאצאים עם נגעים ב לופת אלהכי נגעים משודרים. Talen עם מיקוד משפר Bmp6 20, Talen B ממוקד Tfap2a (לא פורסם).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    חד-תאי הזרקה עוברת קוצן עבור transgenesis או עריכת הגנום מציג שלושה אתגרים מרכזיים. ראשית, ביחס עוברי דג זברה, הסיסי עוברי קוצן קשה ולעתים קרובות ישבור מחטים. בעיה זו ניתן להתגבר חלקית על ידי שימוש micropipettes זכוכית עבה וחזק וההזרקה בניצב הסיסי (ראה פרוטוקול, איור 2). ההבטחה כי מים כמה שפחות מתווסף עובר (רק מספיק כדי לגרום הסיסי להתנפח ולהרים מן התא) עוזר להפחית קשיות סיסית. הסיסי מתקשה לאורך זמן, כך עובדים במהירות לאחר הרטבת העוברים חשוב. שמירה על העוברים בתא לחות לפני הזריקה, כך שהם לא יתייבשו גם קריטי. המצמדים חלקים ואפילו עוברי אדם פשוט יש הרבה יותר עבה וקשוח chorions; לפעמים על מנת להזיז את העובר הבא או מנסה עם מצמד חדש הוא הפתרון הקל. זה הרבה יותר קל לדלג ד אחד העובר ifficult מאשר להחליף מחט פגום. לאחר מחטי גיבוי מוכנים יאפשר זריקות להמשיך במקרה של שבירת מחט. כאשר הזרקת BACS, זה נפוץ המחט כדי לסתום. המחט ניתנת מתפנה על ידי גירוד בעדינות או מחדש לשבור את הקצה עם מלקחיים, או באמצעות מתג לחץ אוויר הקבוע לטהר את הסותמים.

    שנית, זיהוי התא הראשון העובר הוא מאתגר; לעתים קרובות למדי הוא שטוח וקשה למתחילים לראות, במיוחד בלתי נראה כאשר אתה מסתכל ישירות על זה. לעתים קרובות blastomere ניתן לראות רק כבליטה מוגבהת מעט פרופיל. לכן, עדיף לזהות את התא בפרופיל (איור 3B) ואז בעדינות לסובב את העובר קדימה לצד כך התא תתמודד סוף המחט בזווית (אם כי התא יהיה לעתים קרובות להיות בלתי נראה מהזווית הזאת, את צבע כהה של blastomere באיור 3 הוא מוגזם לבהירות).

    e_content "> שלישי, מיקוד הציטופלסמה הוא גם קשה, במיוחד אם התא הראשון הוא שטוח במיוחד. היא כיוונה את החלק הכי השמן של blastomere (בדרך כלל במרכז) משפרת את הסיכוי של הזרקה לתוך הציטופלסמה. בעוד הזרקה בחלמון ליד הציטופלסמה יכול לייצר מהונדס דג בהצלחה, את היעילות נראית מוגברות קטלני ירד כאשר הציטופלסמה, מכוונת ניקור מחט אחת. לפעמים, מצמדי פרט יצטרכו בלסטומרים דק במיוחד, כך הימנעות החלמון היא כמעט בלתי אפשרית. ממתין יותר מ -25 דקות להתחיל זריקות עשויות לעזור (מצמד כמה לא יוצר blastomere בגודל מלא עד ~ הפרית 45 דקות פוסט), אבל אם בלסטומרים לא להגדיל את שטחיו, הוא לעתים קרובות קל יותר להשיג מצמד חדש של ביצים מאשר לנסות להזריק תאים שטוחים .

    זריקות קטלניות מוגזמות הבאים עלולות להתרחש מכמה סיבות. מחטים בלאנט ו / או גדול מדי בגודל מחט נשא עלול לגרום too הרבה נזק לתא ו / או הציטופלסמה הגורם לדלוף החוצה. חלק בונת DNA נראית במיוחד קטלני; הורדת ריכוז של ה- DNA עשויה לשפר את ההישרדות אך שיעורי transgenesis נמוך. ניקיון פלסמידים ראשון עם ערכת midiprep המכילה שטיפת רעלן פנימית ואחריו ערכת ניקוי PCR שנייה מפחית לבנות רעיל. לבסוף, עריכת הגנום עשויה לייצר פסד של מוטצית הפונקציה כי הוא קטלני לפיתוח עובר. הקטנת הריכוז של CRISPR או Talen mRNAs יכולה להגדיל את הפסיפס של העובר כדי למנוע קטלני, אך הוא עשוי להפחית את יעילות התאוששות אלל מוטנטי.

    פרוטוקול שפורסם בעבר להפקת הקוצנים מהונדס בשיטה meganuclease 21 דיווחו על שיעור התמסורת germline transgene 4-7% מהדגים מייסד 0 F. שיטת Tol2 דיווחה כאן הביאה עד לשיעור שידור germline transgene 72% מ- F 0 מייסד דגים (המציין integrat גנומי המרובהיונים). המחקר הקודם בשיטת meganuclease דיווח 40% של עוברים מוזרקים מראים ביטוי של GFP ספציפי, דומה לזה שדווח כאן. כך בעוד שיעורים דומים של מייסדי F 0 מהונדס הם נצפו עבור דג מהונדס שנוצר על ידי שני meganuclease ושיטות Tol2, קצב שידור germline מופיע הרבה יותר גבוה עבור transgenics בתיווך Tol2.

    כמו טכנולוגיות עריכת הגנום ממשיכות להתקדם, אפילו יותר מניפולציות גנטיות ספציפיות תהפוכנה אפשריות קוצן ומיני דגים אחרים. לדוגמה, בבימויו תיקון 46 ו הומולוגיים יאפשר חילופי אלל בין ימית הגנום קוצן מים מתוקים, ו CRISPRs שונה יכול לשמש במיוחד להפעיל או לעכב ביטוי גנים 47. טכנולוגיות המרגשות אלה לעריכה וניתוח הגנום תובלנה לתובנה חדשות לגבי הבסיס הגנטי של מורפולוגיים, פיסיולוגי מעניין רבים, פנוטיפים התנהגותיים sticklebacks ומיני דגים אחרים.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    החוקרים אין לי מה לחשוף.

    Acknowledgments

    עבודה זו מומנה בחלקה על ידי NIH R01 # DE021475 (CTM), גידול NIH Predoctoral הדרכה גרנט 5T32GM007127 (PAE), וכן מלגת מחקר לתארים מתקדמים NSF (NAE). אנו מודים קווין Schwalbach לביצוע BAC recombineering וזריקות, ניק Donde להפקת הנתונים רצף CRISPR סנגר, וקתרין ליפארי עבור משוב מועיל על פרוטוקול ההזרקה.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Stereomicroscope with transillumination Leica S6e/ KL300 LED
    Manual micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33 Marzhauser M33 Micromanipulator
    Pressure Injecion system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
    Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
    Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
    Magnetic base holder Applied Scientific Instrumentation Magnetic base
    Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
    Iron plate (magnetic base) Narishige IP
    Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-97
    Disposable transfer pipettes Fisher 13-711-7M
    0.5% phenol red in DPBS Sigma  P0290 injection tracer
    #5 forceps, biologie dumoxel  Fine Science Tools 11252-30 for needle breaking
    Micropipette Storage Jar World Precision Instruments E210 holds needles
    6", 6 teeth per inch plaster drywall saw Lenox 20571 (S636RP) hold eggs for injection
    13 cm x 13 cm glass plate any hardware store -
    Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID  World Precision Instruments 1B100-F4 *harder glass than zebrafish injection capillaries
    150 x 15mm Petri dish Fisher FB0875714 raise stickleback embryos
    35 mm x 10 mm Petri dish Fisher 08-757-100A store eggs pre-injection
    Instant Ocean Salt Instant Ocean SS15-10
    Sodium Bicarbonate Sigma S5761-500G
    Tricaine methanesulfonate/MS-222 Western Chemical Inc MS222 fish anaesthesia/euthanasia
    Sp6 transcription kit Ambion AM1340 For transcription of TALENs and transposase mRNA
    RNeasy cleanup kit Qiagen 74104 purify transposase or TALEN RNA
    QiaQuick PCR cleanup kit Qiagen 28104 clean up plasmids for injection
    Proteinase K 20 mg/ml Ambion AM2546 for DNA preparation
    Nucleobond BAC 100 kit Clontech 740579 for BAC DNA preparation
    NotI NEB R0189L
    Phusion polymerase Fisher F-530L
    Qiagen PlasmidPlus Midi kit Qiagen 12943 contains endotoxin rinse buffer
    QIAQuick Gel Extraction Qiagen 28704  for sequencing induced mutations
    Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol Sigma P2069-100ML
    Sodium acetate Sigma S2889-250G
    Ethanol (molecular biology grade) Sigma E7023-500ML
    Agarose Sigma A9539
    50x Tris-acetate-EDTA buffer ThermoFisher B49
    0.5-10 Kb RNA ladder ThermoFisher 15623-200
    Nanodrop  Spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 2000
    Paraformaldehyde Sigma 158127-500G
    10x PBS ThermoFisher 70011-044
    1 kb Plus DNA Ladder ThermoFisher 10787-018
    Potassium Chloride Sigma P9541-500G
    Magnesium Chloride Sigma M8266-100G
    NP-40 ThermoFisher 28324
    Tween 20 Sigma P1379-500ML
    Tris pH 8.3 Teknova T1083
    12-strip PCR tube Thermo Scientific AB-1113

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Bell, M. A., Foster, S. A. The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. Oxford University Press. (1994).
    2. Jones, F. C., et al. The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks. Nature. 484, (7392), 55-61 (2012).
    3. Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing. G3. 5, (7), 1463-1472 (2015).
    4. Miller, C. T., et al. Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci. Genetics. 197, (1), 405-420 (2014).
    5. Shapiro, M. D., et al. Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks. Nature. 428, (6984), 717-723 (2004).
    6. Colosimo, P. F., et al. Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles. Science. 307, (5717), 1928-1933 (2005).
    7. Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327, (5963), 302-305 (2010).
    8. O'Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA. eLife. e05290 (2015).
    9. Cleves, P. A., et al. Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, (38), 13912-13917 (2014).
    10. Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281, (1788), 20140822 (2014).
    11. Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution. EvoDevo. 5, (1), (2014).
    12. Ellis, N. A., et al. Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks. Development. 142, 2442-2451 (2015).
    13. Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367, (1587), 395-408 (2012).
    14. Hohenlohe, P. A., et al. Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags. PLoS Genet. 6, (2), e1000862 (2010).
    15. McKinnon, J. S., Rundle, H. D. Speciation in nature: the threespine stickleback model systems. Trends Ecol. Evol. 17, (10), 480-488 (2002).
    16. Shao, Y. T., et al. Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus. Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).
    17. Katsiadaki, I., et al. Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption. Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14, (5), 263-283 (2007).
    18. Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis. Mol. Ecol. 22, (3), 774-786 (2013).
    19. Barber, I. Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology. Trends Parasitol. 29, (11), 556-566 (2013).
    20. Erickson, P. A., et al. A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression. Dev. Biol. 401, (2), 310-323 (2015).
    21. Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks. Behaviour. 141, (11/12), 1345-1355 (2004).
    22. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech. Dev. 118, (1-2), 91-98 (2002).
    23. Carroll, S. B. Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134, (1), 25-36 (2008).
    24. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337, (6099), 1190-1195 (2012).
    25. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, (23), 9362-9367 (2009).
    26. Fisher, S., et al. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 1, (3), 1297-1305 (2006).
    27. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, (21), 11403-11408 (2000).
    28. Kikuta, H., Kawakami, K. Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors. Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. 69-84 (2009).
    29. Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Dev. Camb. Engl. 127, (9), 1953-1960 (2000).
    30. Kingsley, D. M., et al. New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks. Behaviour. 141, (11/12), 1331-1344 (2004).
    31. Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene. Genome Res. 13, (9), 2069-2081 (2003).
    32. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 6, (12), 1998-2021 (2011).
    33. Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice. BMC Genomics. 10, (1), 477 (2009).
    34. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15, (5), 321-334 (2014).
    35. Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39, (17), (2011).
    36. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29, (2), 143-148 (2011).
    37. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, (6096), 816-821 (2012).
    38. Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11, (6), 583-585 (2014).
    39. Kawakami, K., et al. A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish. Dev. Cell. 7, (1), 133-144 (2004).
    40. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
    41. Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish. Dev. Dyn. 236, (11), 3077-3087 (2007).
    42. Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40, (W1), W117-W122 (2012).
    43. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40, (15), e115 (2012).
    44. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) . 5th Edition, University of Oregon. Press: Eugene, OR. (2007).
    45. Dale, R. M., Topczewski, J. Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a. Dev. Biol. 357, (2), 518-531 (2011).
    46. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8, (11), 2281-2308 (2013).
    47. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression. Cell. 152, (5), 1173-1183 (2013).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics