Correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन करने के लिए β-amyloid सजीले टुकड़े के साथ सहभागिता microglial

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Neuroscience

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Summary

यह लेख methoxy-X04 है, जो रक्त मस्तिष्क बाधा पार और चुनिंदा बीटा pleated घने कोर Aβ सजीले टुकड़े में पाया चादरों को बांध का उपयोग कर अल्जाइमर रोग के माउस मॉडल में amyloid सजीले टुकड़े Aβ visualizing के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। यह immunostaining और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए प्रसंस्करण के लिए पूर्व पट्टिका युक्त ऊतक वर्गों के पूर्व स्क्रीनिंग की अनुमति देता है।

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Bisht, K., El Hajj, H., Savage, J. C., Sánchez, M. G., Tremblay, M. È. Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques. J. Vis. Exp. (112), e54060, doi:10.3791/54060 (2016).

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Abstract

एक विस्तृत प्रोटोकॉल से पहले अल्जाइमर रोग के माउस मॉडल से मस्तिष्क वर्गों में amyloid Aβ सजीले टुकड़े की पहचान करने के लिए यहाँ प्रदान की जाती है पूर्व embedding immunostaining और ऊतक प्रसंस्करण के लिए (विशेष रूप से आयनित कैल्शियम बाध्यकारी एडाप्टर अणु 1 (IBA1), एक कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन microglia द्वारा व्यक्त के लिए) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम)। Methoxy-X04 एक फ्लोरोसेंट रंजक कि रक्त मस्तिष्क बाधा पार और चुनिंदा घने कोर Aβ सजीले टुकड़े में पाया बीटा pleated शीट को बांधता है। methoxy-X04 के साथ पशुओं के इंजेक्शन से पहले बलिदान करने के लिए और मस्तिष्क निर्धारण पूर्व स्क्रीनिंग और समय लेने वाली जोड़तोड़ के साथ आगे की प्रक्रिया के लिए पट्टिका युक्त मस्तिष्क वर्गों के चयन की अनुमति देता है। यह विशेष रूप से उपयोगी है जब विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों या परतों कि बहुत कुछ सजीले टुकड़े हैं, केवल वर्गों का एक छोटा सा अंश में मौजूद हो सकती है के भीतर जल्दी ई विकृति का अध्ययन कर रहा है। कांगो लाल, Thioflavin एस, और Thiofl साथ ऊतक वर्गों का पोस्टमार्टम प्रसंस्करणAvin टी (या यहां तक ​​कि methoxy-X04 के साथ) β-pleated शीट लेबल कर सकते हैं, लेकिन अतिरिक्त डाई दूर करने के लिए इथेनॉल के साथ व्यापक समाशोधन की आवश्यकता है और इन प्रक्रियाओं ultrastructural संरक्षण के साथ असंगत हैं। यह भी Aβ (और अन्य सेलुलर ऐसे IBA1 के रूप में मार्कर) हित के क्षेत्रों से सभी वर्गों मस्तिष्क पर लेबलिंग के लिए प्रदर्शन करने के लिए, केवल सही स्थान पर Aβ सजीले टुकड़े युक्त एक छोटा सा अंश उपज के लिए अक्षम हो जाएगा। महत्वपूर्ण बात है, Aβ सजीले टुकड़े अभी भी दिखाई दे ईएम के लिए ऊतक प्रसंस्करण के बाद इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ जांच करने के लिए क्षेत्रों की एक सटीक पहचान (आम तौर पर कुछ वर्ग मिलीमीटर के लिए नीचे) की अनुमति के लिए कर रहे हैं।

Introduction

Amyloid Aβ पट्टिका गठन अल्जाइमर रोग (ई) के मुख्य नयूरोपथोलोगिकल बानगी है। हालांकि बढ़ती सबूत रोग प्रगति 1,2 में प्रतिरक्षा प्रणाली की महत्वपूर्ण भूमिका चलता है। विशेष रूप से, preclinical और नैदानिक ​​अध्ययन से नए डेटा एक मुख्य चालक और ई विकृति के लिए योगदान के रूप में प्रतिरक्षा रोग की स्थापना की। इन निष्कर्षों के साथ, मध्य और परिधीय प्रतिरक्षा कोशिकाओं ई 3 के लिए के रूप में आशाजनक चिकित्सीय लक्ष्यों में उभरा है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल Aβ पट्टिका बयान और ईस्वी में microglial प्ररूपी परिवर्तन के बीच संबंधों में नए अंतर्दृष्टि उत्पन्न करने के लिए प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) को जोड़ती है। इस प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट रंजक methoxy-X04 की विवो इंजेक्शन में उपयोग करके विज्ञापन के माउस मॉडल में Aβ सजीले टुकड़े की लेबलिंग की अनुमति देता है। Methoxy-X04 एक कांगो लाल व्युत्पन्न है कि आसानी से मस्तिष्क पैरेन्काइमा प्रवेश करने के लिए रक्त मस्तिष्क बाधा पार और उच्च एक साथ β-pleated शीट बाध्य कर सकते हैffinity। चूंकि डाई फ्लोरोसेंट है, यह दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ 4 Aβ पट्टिका बयान के vivo का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक बार जब Aβ के लिए बाध्य, methoxy-X04 अलग कर देना नहीं है या सजीले टुकड़े से दूर फिर से विभाजित है, और यह समय के साथ इसके प्रतिदीप्ति बरकरार रखती है। यह आम तौर पर मस्तिष्क की गतिशीलता 5 के गैर इनवेसिव इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए सतही तौर पर किया जाता है। प्रतिदीप्ति भी एल्डिहाइड निर्धारण निम्न बनी हुई है, correlative पोस्टमार्टम विश्लेषण करती है, Aβ सजीले टुकड़े 6 के आसपास के क्षेत्र में neuronal मौत की जांच सहित के लिए अनुमति देता है।

इस प्रोटोकॉल एपीपी SWE / PS1A 246E चूहों से मस्तिष्क वर्गों का चयन करने के methoxy-X04 के गुणों का लाभ लेता है (एपीपी-PS1; एपीपी जीन Lys670Asn / Met671Leu पर एक डबल उत्परिवर्तन coexpressing, और मानव presenilin PS1-A264E संस्करण) 7 कि Aβ का प्रदर्शन हित के विशिष्ट क्षेत्रों (हिप्पोकैम्पस सीए 1, तबके radiatum, और lacunosum-moleculare में सजीले टुकड़े) पूर्व एम्बेड करने microglial मार्कर आयनित कैल्शियम बाध्यकारी एडाप्टर अणु 1 (IBA1 के खिलाफ immunostaining) microglial सेल निकायों और ईएम के साथ प्रक्रियाओं कल्पना करने के लिए पहले। चूहों transcardial छिड़काव के माध्यम से methoxy-X04 समाधान, 24 घंटा मस्तिष्क निर्धारण करने से पहले की intraperitoneal इंजेक्शन दिया जाता है। राज्याभिषेक मस्तिष्क वर्गों एक vibratome का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं। हिप्पोकैम्पस सीए 1 युक्त धारा तबके radiatum और lacunosum-moleculare में Aβ सजीले टुकड़े की उपस्थिति के लिए एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के तहत जांच कर रहे हैं। IBA1 के लिए Immunostaining, आज़मियम tetroxide पोस्ट-निर्धारण, और प्लास्टिक राल एम्बेडिंग तब चयनित मस्तिष्क वर्गों पर प्रदर्शन कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल के अंत में, वर्गों, आगे ultrastructural गिरावट के बिना संग्रहीत किया जा सकता Ultrathin सेक्शनिंग और ultrastructural परीक्षा के लिए तैयार है। महत्वपूर्ण बात है, सजीले टुकड़े अभी भी मौजूद प्रोटोकॉल के रूप में, अलग-अलग एंटीबॉडी के साथ immunostaining उदाहरण के लिए IBA1 के बाद फ्लोरोसेंट रहे हैं। वे गहरे रंग की टी बननेहान आज़मियम tetroxide पोस्ट-निर्धारण के बाद उनके आसपास के neuropil, methoxy-X04 धुंधला है, जो सही, कुछ वर्ग मिलीमीटर के हित के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए, आम तौर पर नीचे में मदद करता है की स्वतंत्र रूप से संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ जांच की जाए।

इस correlative दृष्टिकोण ultrastructural स्तर पर जांच करने के लिए विशिष्ट मस्तिष्क वर्गों की पहचान करने के लिए एक कारगर तरीका प्रदान करता है। यह विशेष रूप से उपयोगी है जब जल्दी ई पैथोलॉजी, विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों या परतों के भीतर है कि केवल कुछ Aβ सजीले टुकड़े हैं, केवल ऊतक वर्गों का एक छोटा सा अंश में मौजूद हो सकती है अध्ययन कर रहा है। इन बार के दौरान विशेष रूप से, यह बस सही स्थान पर Aβ सजीले टुकड़े युक्त एक छोटा सा अंश उपज के लिए कई मस्तिष्क वर्गों पर (जैसे IBA1 के रूप में अन्य सेलुलर मार्करों के लिए और दोहरी लेबलिंग) Aβ के लिए immunostaining का उपयोग करने के लिए अक्षम हो जाएगा। इसके अलावा, methoxy-X04 के साथ लाइव चूहों के इंजेक्शन बलिदान करने के लिए और ऊतक प्रसंस्करण नहीं करता compromis से पहलेई ultrastructural संरक्षण। इस तरह तय ऊतक वर्गों पर कांगो लाल, Thioflavin एस, Thioflavin टी या methoxy-X04 के साथ पोस्टमार्टम धुंधला रूप में वैकल्पिक तरीकों इथेनॉल में धुंधला भेदभाव, 8-11, जो आसमाटिक तनाव का कारण बनता है और फैटी बाधित की आवश्यकता होती है। कांगो लाल भी एक ज्ञात मानव कैसरजन 12 है।

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Protocol

नोट: सभी प्रयोगों को मंजूरी दे दी है और पशु की देखभाल के दिशा-निर्देशों पर कनाडा परिषद के अनुरूप संस्थागत पशु आचार समिति के दिशा निर्देशों के तहत प्रदर्शन किया, गया के रूप में Université Laval के पशु की देखभाल समिति द्वारा प्रशासित। उम्र के 4 और 21 महीने के बीच एपीपी-PS1 नर चूहों का इस्तेमाल किया गया। 25 भोजन और पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच के साथ डिग्री सेल्सियस - इन जानवरों 22 में एक 12 घंटा प्रकाश अंधेरे चक्र के तहत रखे गए थे।

1. methoxy-X04 समाधान तैयार

  1. एक समाधान 10% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO), 45% प्रोपलीन ग्लाइकोल, और 45% सोडियम फास्फेट खारा बफर (100 मिमी फॉस्फेट बफर में 0.9% सोडियम क्लोराइड युक्त में methoxy-X04 भंग द्वारा एक 5 मिलीग्राम / methoxy-X04 9 मिलीलीटर समाधान तैयार , 7.4 पीएच)।
    1. एक Microbalance का प्रयोग, methoxy-X04 परिसर के 5 मिलीग्राम वजन। एक धूआं हुड के तहत, DMSO में methoxy-X04 भंग करने और हलचल जब तक एक स्पष्ट हरे समाधान प्राप्त की है। क्रमिक प्रोपलीन ग्लाइकोल और पीएच जोड़नेosphate खारा बफर इसके अतिरिक्त प्रत्येक के साथ सरगर्मी है।
    2. एक रोटेटर हे / एन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान हलचल। एक पीले हरे पायस प्राप्त करते हैं। समाधान गिरावट के बिना अप करने के लिए दो महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

2. methoxy-X04 समाधान इंजेक्शन

  1. छिड़काव करने से पहले 24 घंटा, चूहों का वजन और शरीर के वजन के 10 मिलीग्राम / किग्रा एक 27 आधा जी सुई का उपयोग की एक खुराक पर प्रत्येक माउस methoxy-X04 की intraperitoneal इंजेक्शन दे।

3. इंजेक्शन चूहों के Transcardial छिड़काव

  1. छिड़काव से पहले दिन पर, फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), 3.5% acrolein, और 4% paraformaldehyde (पीएफए) समाधान 13 की उचित मात्रा तैयार करने और उन्हें 4 डिग्री सीओ / एन पर स्टोर।
    नोट: ये समाधान दोनों छिड़काव और पूर्व embedding immunohistochemistry के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। जब acrolein के साथ काम करना विशेष ध्यान रखना है, क्योंकि यह संक्षारक और दोनों को विषैला होता हैशोधकर्ताओं और पर्यावरण। इसके अलावा, क्योंकि acrolein प्लास्टिक के लिए संक्षारक है, हमेशा के लिए उपयुक्त कांच के बने पदार्थ का उपयोग acrolein समाधान तैयार करने के लिए।
  2. छिड़काव के दिन, 25 माइक्रोन कण प्रतिधारण के मोटे फिल्टर पेपर का उपयोग करके पीएफए ​​और acrolein फिल्टर।
  3. छिड़काव के दौरान, 25 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर, acrolein के 75 एमएल, और क्रमिक माउस संचलन में पीएफए ​​के 150 मिलीलीटर पीबीएस के 15 मिलीलीटर, वितरित करने के लिए एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग करें।
    सावधानी बरतें। पीएफए ​​और acrolein के हानिकारक धुएं से बचने के लिए एक धूआं हुड के अंदर सख्ती से छिड़काव प्रदर्शन करना।
    1. पंप सेट करने के लिए, पीबीएस समाधान में एक छोर डालें, पीबीएस के साथ ट्यूबिंग (लगभग 15 मिलीलीटर पकड़) को भरने, और दूसरे छोर से एक 25 जी पंखों वाला रक्त संग्रह सुई ठीक। सभी समय में, यह सुनिश्चित करें कि ट्यूबिंग किसी भी फंस हवाई बुलबुले से मुक्त है।
    2. पीबीएस के साथ भरा टयूबिंग के साथ छिड़काव पंप स्थापित करने के बाद acrolein बोतल में सीधे ट्यूब रखें।
  4. एकएक 90 मिलीग्राम / सोडियम pentobarbital के शरीर के वजन खुराक किलो intraperitoneally एक 27 आधा जी सुई का उपयोग इंजेक्शन के साथ एक समय में एक माउस aesthetize। पूंछ / पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए प्रतिक्रियाओं का आकलन करें। आगे बढ़ना ही अगर माउस इस तरह के प्रतिकूल, दर्दनाक उत्तेजनाओं को अनुत्तरदायी है।
  5. काम की सतह के लिए forepaws और hindpaws टेप से लापरवाह स्थिति (चेहरा ऊपर की ओर के साथ पीठ पर झूठ बोल) में माउस सुरक्षित और ध्यान से अन्य अंगों को नुकसान के कारण के बिना दिल का पर्दाफाश। डायाफ्राम puncturing के बाद जल्दी से काम करने के लिए सुनिश्चित करें।
    1. वक्ष midline ribcage के लिए दुम शुरुआत के साथ शल्य कैंची के साथ त्वचा के माध्यम से एक चीरा प्रदर्शन और हंसली के लिए व्याख्यान चबूतरे आगे बढ़ें।
    2. उदर ribcage के आधार के साथ दो अतिरिक्त पार्श्व चीरों बनाओ। धीरे ले जाते हैं और त्वचा की दो फ्लैप पिन, पूरे वक्ष गुहा का पर्दाफाश करने के लिए सुनिश्चित कर रही है।
    3. कुंद संदंश के साथ जिफाएडा प्रक्रिया को पकड़ वक्ष गुहा का पर्दाफाश करने के लिए और बताया कैंची स्थिरएस। डायाफ्राम और ribcage के माध्यम से कट, फेफड़े puncturing से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है, और clavicles को चीरा व्याख्यान चबूतरे बने हुए हैं। डायाफ्राम puncturing के बाद जल्दी से काम करने के लिए सुनिश्चित करें।
  6. धीरे कुंद संदंश के साथ पेरिकार्डियल थैली आंसू। , दिल कुंद संदंश के साथ स्थिर पकड़ो सही आलिंद में कटौती, और पीबीएस के अर्क शुरू करते हैं। इसके तत्काल बाद डालने के बाएं वेंट्रिकल में रक्त संग्रह सुई।
  7. (ट्यूबिंग में) 3 मिनट (75 एमएल के लिए इसी) के लिए Acrolein द्वारा पीछा किया पीबीएस के साथ माउस फिर 6 मिनट (150 मिलीलीटर के लिए इसी) के लिए पीएफए ​​के लिए स्विच छिड़कना। समाधान स्विचन ट्यूब में प्रवेश करने से रोकने के लिए बुलबुले से पहले पंप प्रवाह को थामने के लिए सुनिश्चित करें।
  8. माउस सिर काटना और तय मस्तिष्क निकालने के लिए और यह सीधे जगह एक गिलास 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 2 घंटे के लिए 4% पीएफए ​​युक्त शीशी में।
    1. मस्तिष्क निकालने के लिए, खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए त्वचा के माध्यम से कटौती करने के लिए कैंची और चिमटी का उपयोग करें। ध्यान से खोपड़ी सेशन तोड़नेआंखों के बीच में एन, और यह के छोटे टुकड़े बंद चिप अंतर्निहित मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए।
    2. ध्यान से अवगत कराया मस्तिष्क और बाद तय vibratome सेक्शनिंग के लिए आगे बढ़ने से पहले एक अतिरिक्त 2 घंटे के लिए 4% पीएफए ​​के साथ इसे हटा दें।

4. मस्तिष्क सेक्शनिंग एक vibratome का उपयोग

  1. ठंडा पीबीएस के साथ तय मस्तिष्क 3 बार धोएं। एक तेज धार का प्रयोग, घ्राण बल्ब हटाने के लिए (जब तक कि इस क्षेत्र के जांच के अधीन है) और मस्तिष्क 2 में transversally काट - लगभग बराबर ऊंचाई के 3 टुकड़े, जो सभी के आदेश प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए एक साथ sectioned जा सकता है।
  2. खड़ी नमूना प्लेट ट्रे में सुरक्षित पर मस्तिष्क के ऊतकों के टुकड़े गोंद। सुनिश्चित करें कि चिकनी कटौती की सतह नमूना थाली करने के लिए मजबूती से चिपक जाती है और सेक्शनिंग प्रक्रिया के दौरान उखाड़ फेंकना नहीं मिलता है सुनिश्चित करें। ट्रे में पर्याप्त पीबीएस समाधान जोड़ें जब तक पूरे मस्तिष्क की सतह पूरी तरह से डूबे हुए है। यह वीं रखने के लिए महत्वपूर्ण हैई मस्तिष्क टुकड़े और बाद वर्गों पूरी तरह से इस कदम भर पीबीएस में डूबे।
  3. vibratome में ट्रे जगह, 0.5 मिमी / सेकंड, 90 हर्ट्ज के लिए सेक्शनिंग आवृत्ति, और आदेश में 50 माइक्रोन मोटी वर्गों उपज में 50 माइक्रोन के लिए चारा मोटाई के लिए सेक्शनिंग गति समायोजित करें। फिर 20 मिलीलीटर कांच cryoprotectant समाधान (40% पीबीएस, 30% इथाइलीन ग्लाइकॉल, और 30% ग्लिसरॉल) युक्त शीशियों ठीक एक तूलिका का उपयोग करने में वर्गों हस्तांतरण। -20 डिग्री सेल्सियस तक आगे उपयोग पर शीशियों स्टोर। वैकल्पिक रूप से, निम्न चरणों में वर्णित के रूप में तत्काल जांच के लिए पीबीएस में वर्गों रहते हैं।

5. methoxy-X04 से सना हुआ सजीले की उपस्थिति के लिए धारा स्क्रीनिंग

  1. एक stereotaxic माउस मस्तिष्क की सहायता 14, चयन मस्तिष्क ब्याज के क्षेत्र से युक्त वर्गों, उदाहरण के लिए, के रूप में उपस्थित उदाहरण में प्रयुक्त हिप्पोकैम्पस सीए 1 महीने के। 24 अच्छी तरह से संस्कृति पर्याप्त cryoprotectant समाधान युक्त प्लेट के भीतर एक कुएं में प्रत्येक अनुभाग की जगहइतनी के रूप में बाहर सुखाने से वर्गों को रोकने के लिए।
  2. प्रत्येक अनुभाग क्रमिक जांच करते हैं, वर्गों बाहर सुखाने, निम्न प्रक्रिया का उपयोग कर से बचने के लिए:
    1. पीबीएस की एक छोटी बूंद एक डिस्पोजेबल विंदुक के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड में जोड़ें, और छोटी बूंद पर खंड जगह है।
    2. एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे अनुभाग की जाँच करें methoxy-X04 लेबल Aβ सजीले टुकड़े युक्त क्षेत्रों की पहचान करने के लिए।
      नोट: methoxy-X04 आसानी से एक प्रतिदीप्ति पराबैंगनी (यूवी) फिल्टर (उत्तेजना 340 - 380 एनएम) का उपयोग करते देखे जा सकते हैं।
  3. खुर्दबीन मंच चलते बिना प्रतिदीप्ति मोड में उज्ज्वल क्षेत्र में ब्याज (आरओआई) के क्षेत्रों की छवियों के रूप में अच्छी तरह से कब्जा है, के बाद से प्रत्येक छवि के आदेश के संरचनात्मक क्षेत्र के लिए सीधे सजीले टुकड़े की उपस्थिति सहसंबंधी में दोनों क्षेत्रों में एक ही क्षेत्र दिखाना चाहिए ऊतक अनुभाग।
  4. बचाने के लिए और पशु संख्या के हिसाब से लिए गए चित्रों का नाम है। इसके अलावा थाली में अच्छी तरह से संख्या और टा चित्रों के क्षेत्र रिकॉर्डकेन। उदाहरण के लिए, पूर्व: 9978A1B; पशु संख्या: 9978; खैर संख्या: A1; फील्ड: ब्राइट। अनुभाग में अच्छी तरह से उसके नामित में वापस जगह एक बार इमेजिंग पूरा हो गया है।
    नोट: अंत में, जांच की प्रत्येक खंड के लिए दो चित्रों के उज्ज्वल क्षेत्र में एक और यूवी क्षेत्र में एक और प्राप्त कर रहे हैं।
  5. दो छवि जम्मू में (उज्ज्वल क्षेत्र में एक और यूवी क्षेत्र में अन्य) एक ही रॉय की छवियों को खोलें, और MosaicJ प्लगइन का उपयोग कर, दो छवियों के किनारों पंक्ति में है और गठबंधन और संयुक्त छवि बचाने के लिए अच्छी तरह से संख्या के हिसाब से यह से आया।
  6. विशेष जानवर की संख्या के साथ एक अलग फ़ोल्डर में सेव करें। चित्र संयोजन की पहचान करने और ऊतक अनुभाग में सजीले टुकड़े स्थानीय बनाना, और दो अलग अलग क्षेत्रों (उज्ज्वल और यूवी) में पूरी अनुभाग का एक पूरा दृश्य के लिए है।
  7. जांच प्रक्रिया के पूरा होने के बाद, एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति cryoprotectant युक्त थाली में -20 डिग्री सेल्सियस पर जांच वर्गों स्टोर तक immunostaining या आगे की प्रक्रिया CA हैबाहर rried।

IBA1 के लिए 6. पूर्व embedding Immunostaining

नोट: आरटी पर एक धीरे धीरे आगे बढ़ घुमाव पर थाली रखकर चुने गए स्वतंत्र रूप से अस्थायी वर्गों पर IBA1 के लिए immunostaining प्रदर्शन करना।

  1. अच्छी तरह से लगभग 1 मिलीलीटर पीबीएस, प्रत्येक धोने के 10 मिनट के लिए स्थायी साथ वर्गों 3 बार धोएं।
  2. 10 मिनट के लिए पीबीएस समाधान में 0.3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ अंतर्जात पराक्सिडेजों बुझाने। यह कदम गैर विशिष्ट peroxidase गतिविधि है, जो पृष्ठभूमि धुंधला से बचने के लिए महत्वपूर्ण है रोकता है।
  3. 10 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस में ऊतक 3 बार धोएं।
  4. 30 मिनट के लिए पीबीएस समाधान में 0.1% सोडियम borohydride में वर्गों सेते हैं। यह कदम निर्धारण कदम से किसी भी शेष एल्डीहाइड को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है, और अगर acrolein ऊतक निर्धारण में प्रयोग किया जाता है, विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।
  5. 10 मिनट प्रत्येक समय के लिए पीबीएस 3 बार में ऊतक को धो लें और सभी बुलबुले को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें।
  6. 1 घंटे के लिए वर्गों ब्लॉक।अलग एंटीबॉडी अलग अवरुद्ध बार और समाधान की आवश्यकता हो सकती है। (पीएच 7.4 टीबीएस) IBA1 के लिए, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 3% गोजातीय सीरम albumin, और 0.01% ट्राइटन X-100 50 मिमी Tris बफर खारा में युक्त बफर अवरुद्ध तैयार करते हैं।
    नोट: अवरुद्ध कदम अविशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के बंधन को रोकने के लिए है। ट्राइटन X-100 के कम एकाग्रता बेहतर धुंधला के लिए झिल्ली की मामूली permeabilization की अनुमति देता है, और काफी कम ईएम के तहत ऊतक के सबसे ultrastructural सुविधाओं की रक्षा करने के लिए है।
  7. ऊतक से अवरुद्ध बफर निकालें, और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में सेते (खरगोश विरोधी IBA1, पतला [1: 1,000] अवरुद्ध बफर में) 4 डिग्री सीओ / एन पर।
  8. 10 मिनट प्रत्येक समय के लिए टीबीएस में 3 बार धोएं।
  9. 90 मिनट के लिए 0.05 एम टीबीएस में: माध्यमिक एंटीबॉडी में सेते (बकरी विरोधी खरगोश बायोटिन संयुग्मित) [200 1]।
  10. 5 मिनट प्रत्येक समय के लिए टीबीएस में धो 5 बार।
  11. टीबीएस में Avidin बायोटिन जटिल समाधान में सेते हैं (: [100 1] Avidin [1 100], बायोटिन)1 घंटे के लिए समाधान।
  12. 5 मिनट प्रत्येक समय के लिए टीबीएस में धो 5 बार।
  13. 0.05% diaminobenzidine (थपका) और 8 मिनट के लिए टीबीएस में 0.015% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ IBA1 धुंधला प्रकट करते हैं।
    नोट: थपका विकास के समय को प्रोटोकॉल के लिए प्रोटोकॉल से भिन्न हो सकते हैं और जल्दी से एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत दाग वर्गों का परीक्षण करके निर्धारित किया जाना चाहिए।
    नोट: IBA1 के लिए, स्पष्ट रूप से एक 20X पर सेल निकायों और IBA1 से सना हुआ microglia की प्रक्रियाओं कल्पना करने में सक्षम होना चाहिए (प्रतिनिधि उदाहरण के लिए चित्र 2 देखें)। थपका का उपयोग करते हुए सतर्क रहें, के रूप में यह एक ज्ञात कैसरजन है।
  14. ओवर-विकासशील ध्यान वर्गों (जैसा कि ऊपर वर्णित है) इस कदम के दौरान निगरानी के द्वारा बचें। 5 मिनट प्रत्येक समय के लिए 5 बार ठंडा पंजाब में वर्गों धोने से प्रतिक्रिया बंद करो।

7. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए प्रसंस्करण

  1. एक कांच की शीशी में पीबीएस में 1% आज़मियम tetroxide समाधान तैयार है। आज़मियम tetroxide सहज है; जी कवरएल्यूमीनियम पन्नी के साथ लड़की शीशी प्रकाश से समाधान की रक्षा के लिए।
    , आज़मियम tetroxide का उपयोग कर के रूप में यह एक बहुत ही खतरनाक रासायनिक है सावधान रहो। इस और एक धूआं हुड के अंदर निम्न चरणों का प्रदर्शन।
  2. वर्गों से पीबीएस निकालें और फ्लैट के ठीक एक तूलिका का उपयोग कर उन्हें फैल गया। बाहर सुखाने से वर्गों रखने के लिए एक समय में इस कदम से एक अच्छी तरह से प्रदर्शन करते हैं। तुरंत, आज़मियम tetroxide जोड़ने के रूप में वर्गों में किसी भी सिलवटों स्थायी हो जाएगा और ऊतक पद आज़मियम निर्धारण समतल करने के लिए ही वर्गों को तोड़ने के प्रयास करने से पहले होगा वर्गों समतल करने के लिए सुनिश्चित करें।
  3. तह से वर्गों को रोकने के लिए आरटी पर 30 मिनट के लिए आज़मियम tetroxide में वर्गों को विसर्जित कर दिया, एक हस्तांतरण विंदुक के साथ एक समय में आज़मियम tetroxide की एक बूंद को जोड़ने। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ अच्छी तरह से कवर प्रकाश से वर्गों की रक्षा के लिए।
    नोट: यह कदम वर्गों के भीतर लिपिड को ठीक करता है। ऊतक आज़मियम पोस्ट-निर्धारण के बाद बहुत अंधेरा दिखाई देगा।
  4. वर्गों आज़मियम Tetro में हैंxide, 20 ग्राम घटक एक मिश्रण से एक डिस्पोजेबल बीकर में प्लास्टिक राल तैयार, 20 ग्राम घटक बी, 0.6 ग्राम घटक सी, और 0.4 ग्राम घटक डी ऊपर के क्रम में एक साथ घटकों का मिश्रण है और अच्छी तरह से एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर उन्हें मिश्रण जब तक एक वर्दी का रंग प्राप्त की है।
  5. एल्यूमीनियम वजन बर्तन करने के लिए तैयार मिश्रण स्थानांतरण। एक बार वे निर्जलित कर दिया है कि वे ऊतक वर्गों प्राप्त होगा।
  6. 35%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%: निम्न क्रम में 2 मिनट के लिए इथेनॉल की सांद्रता बढ़ाने में वर्गों निर्जलीकरण।
  7. 2 मिनट प्रत्येक समय के लिए अवशिष्ट इथेनॉल निकालने के लिए, 3 बार प्रोपलीन आक्साइड में वर्गों विसर्जित कर दिया। 20 मिलीलीटर कांच की शीशियों में 24 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली से निर्जलित वर्गों निकालें। हमेशा जब प्रोपलीन आक्साइड के साथ काम कर के रूप में यह प्लास्टिक घुल कांच की शीशियों का उपयोग करें, और सावधानी बनाए रखने के लिए, के रूप में यह खतरनाक है।
  8. प्रोपलीन आक्साइड soluti से वर्गों के हस्तांतरण के लिए एक तुला कांच विंदुक टिप या एक ठीक तूलिका का प्रयोग करेंराल में और पर आरटी पर घुसपैठ के लिए छोड़ हे / एन। सावधान प्रोपलीन आक्साइड के साथ राल कमजोर करने के लिए नहीं हो।
  9. पाली-क्लोरो-फ्लोरो त्रिकोणीय-इथाइलीन (PCTFE) filmsheets पर राल के साथ एम्बेड करें अनुभाग:
    1. 15 मिनट PCTFE filmsheets पर वर्गों embedding से पहले - 10 के लिए 60 डिग्री सेल्सियस ओवन - एल्यूमीनियम वजन नमूनों युक्त व्यंजन एक 50 में रखें।
    2. जब वर्गों embedding, एक एल्यूमीनियम एक समय में पकवान वजन के साथ काम करते हैं। ठीक एक तूलिका का उपयोग करना, एक PCTFE फिल्म शीट पर राल की एक पतली परत उभर आती है।
    3. एल्यूमीनियम PCTFE फिल्म पत्रक के लिए पकवान वजन से एक समय में ऊतक के एक भाग ले जाएँ। ऊतक के आसपास से अतिरिक्त राल निकालें, यह परेशान करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा।
    4. PCTFE फिल्म पत्रक के लिए पकवान वजन एक से सभी वर्गों के जाने के बाद, पहली बार एक दूसरे के ऊपर PCTFE चादर जगह है, ऊतक के एक सैंडविच बनाने और 2 चादरों के बीच में राल।
  10. 5 में 3 दिनों के लिए एक मशीन में राल भाजन5 - 60 डिग्री सेल्सियस।
  11. सामग्री अब Ultrathin सेक्शनिंग और ultrastructural परीक्षा, विशेष तकनीक है जो अक्सर ईएम कोर सुविधाओं से प्रदर्शन कर रहे हैं के लिए तैयार है। ultrastructural गिरावट के बिना आरटी पर सुरक्षित रूप से PCTFE फिल्म चादर के बीच नमूने संग्रहित करें।
    नोट: Ultrathin सेक्शनिंग और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी परीक्षा के लिए बाद के चरणों में एक अलग प्रोटोकॉल 13 में समझाया जाता है।

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Representative Results

यह खंड परिणाम है कि प्रोटोकॉल के विभिन्न महत्वपूर्ण कदम पर प्राप्त किया जा सकता है दिखाता है। हिप्पोकैम्पस सीए 1, तबके radiatum, और lacunosum-moleculare: विशेष रूप से परिणाम मस्तिष्क वर्गों विशिष्ट क्षेत्र में methoxy-X04 दाग सजीले टुकड़े हैं और ब्याज की परतों से युक्त का उदाहरण दिखाते हैं। सजीले टुकड़े और हिप्पोकैम्पस के क्षेत्रीय / परतदार संगठन क्रमिक यूवी और उज्ज्वल क्षेत्र फिल्टर (चित्रा 1) के संयोजन का उपयोग कल्पना कर रहे हैं। चुने हुए मस्तिष्क वर्गों बाद में immunostained कर रहे हैं और ईएम के लिए कार्रवाई की, जबकि उनके Aβ सजीले टुकड़े का ट्रैक रखने, विचार है कि वे अभी भी फ्लोरोसेंट निम्नलिखित immunostaining हैं, और आज़मियम tetroxide और एम्बेडिंग (चित्रा 1) के साथ इलाज के बाद आसपास के neuropil से अधिक गहरा हो गया है। इस लोका पर आधारित इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ जांच करने के लिए एक क्षेत्रों (आम तौर पर कुछ मिलीमीटर चुकता) की पहचान करने की अनुमति देता हैसजीले टुकड़े के tion। इसके अलावा, IBA1 साथ microglia की पूर्व embedding immunostaining के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित है। इस प्रोटोकॉल मस्तिष्क वर्गों के भीतर microglial सेल निकायों, बड़े और छोटे प्रक्रियाओं (चित्रा 2) के एक असाधारण दृश्य के रूप में अच्छी तरह से एंटीबॉडी के प्रवेश अर्जित करता है। यह इस प्रकार ultrastructural स्तर पर microglial सेल निकायों और प्रक्रियाओं की पहचान, और Aβ सजीले टुकड़े (आंकड़े 3 और 4) के साथ उनकी बातचीत के अध्ययन की सुविधा।

आकृति 1
चित्रा 21 महीने की उम्र में एपीपी-PS1 चूहे प्रकाश माइक्रोस्कोपी का प्रयोग, फ्लोरोसेंट रंजक methoxy-X04। एबी के प्रणालीगत इंजेक्शन के बाद में Aβ प्लैक्स 1. दृश्य) एक हिप्पोकैम्पस उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति साधनों का उपयोग कर खंड की दोहरी इमेजिंग। क्षेत्रों और ब्याज की परतों के उज्ज्वल क्षेत्र के तहत कल्पना कर रहे हैं380 एनएम (बी) - (ए), और Aβ सजीले टुकड़े क्रमिक 340 की एक श्रृंखला में एक यूवी फिल्टर का उपयोग कर स्थानीय। सीडी)) से पहले एक और हिप्पोकैम्पस खंड की दोहरी इमेजिंग (सी और बाद में (डी) पूर्व embedding IBA1 के लिए immunostaining, आज़मियम tetroxide, इथेनॉल में निर्जलीकरण में पोस्ट-निर्धारण द्वारा पीछा किया, और के रूप में संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए आवश्यक एक प्लास्टिक राल में embedding। ध्यान दिया जाना चाहिए, पट्टिका (एक बिंदीदार रेखा से घेर लिया) अभी भी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए ऊतक प्रसंस्करण पर दिख रहा है। सजीले टुकड़े Visualizing जब ऊतक ब्लॉक trimming एक सटीक क्षेत्रों के उच्च स्थानिक संकल्प पर छवि के लिए चयन के लिए अनुमति देता है। स्केल सलाखों = ए और बी के लिए 300 माइक्रोन, सी और डी के लिए 150 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. वीआई लाइट सूक्ष्म स्तर पर IBA1 धुंधला द्वारा 21 महीने की उम्र में एपीपी-PS1 चूहे में microglial सेल शरीर और ललित प्रक्रियाओं के sualization। एबी) IBA1 से सना हुआ microglia के उदाहरण एक संकुल वितरण दिखा जब वे Aβ सजीले टुकड़े (methoxy-X04 के correlative प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा की पहचान के साथ संबद्ध है, एक बिंदीदार रेखा से घेर लिया) के रूप में पहले आज़मियम tetroxide पोस्ट-निर्धारण और प्लास्टिक राल एम्बेडिंग मनाया। सीडी) IBA1 से सना हुआ आज़मियम tetroxide पोस्ट-निर्धारण और प्लास्टिक राल एम्बेड करने के बाद Aβ सजीले टुकड़े के साथ जुड़े microglia के उदाहरण हैं। ध्यान दें कि सजीले टुकड़े आज़मियम पोस्ट-निर्धारण के बाद उनके आसपास के neuropil से अधिक गहरा हो जाते हैं, इस प्रकार अपने स्थान पर नज़र रखने की अनुमति देता है। स्केल बार = 250 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3. Aβ सजीले टुकड़े हैं और IBA1-immunostaining Ultrastructural स्तर। ए) घने कोर Aβ पट्टिका अपनी कॉम्पैक्ट fibrillary संरचना द्वारा मान्यता प्राप्त करने के उदाहरण पर 6 महीने की उम्र में एपीपी-PS1 चूहे में (इनसेट को देखने की दोहरी दृश्य) और dystrophic neurites के साथ एसोसिएशन भोजी के ultrastructural सुविधाओं के साथ। बी) IBA1 से सना हुआ microglial प्रक्रिया (मीटर का उदाहरण; बैंगनी रंग में रंग) पास Aβ पट्टिका कि amyloid जमा होते हैं पाया। Mitochondrial परिवर्तन (तारक द्वारा दिखाया गया है) भी microglial प्रक्रिया के भीतर देखा जा सकता है। ध्यान दिया जाना चाहिए, इस तस्वीर ऊतक राल सीमा पर अधिग्रहण कर लिया था (सफेद, चित्र के अधिकार पर) जहां एंटीबॉडी और धुंधला तीव्रता के प्रवेश अधिक से अधिक है। स्केल सलाखों = एक के लिए 2 माइक्रोन, 1 माइक्रोन बी के लिए यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


6 महीने की उम्र में एपीपी-PS1 चूहे में IBA1-immunostained Microglia की चित्रा 4. अतिरिक्त उदाहरण के साथ ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी। ईस्वी) IBA1 से सना हुआ microglial सेल शरीर और प्रक्रियाओं (एम) ऊतक राल सीमा से आगे का अधिग्रहण के उदाहरण के रूप में मनाया , एंटीबॉडी के एक उत्कृष्ट प्रवेश दिखा रहा है और तीव्रता इस प्रोटोकॉल का उपयोग अनुभाग के भीतर गहरी धुंधला हो जाना। बी.वी. = रक्त वाहिका, डी = डेन्ड्राइट, में शामिल किए जाने के =, एस = वृक्ष के समान रीढ़, टी अक्षतंतु टर्मिनल =। तीर synaptic clefts दिखा। स्केल सलाखों = 1 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल ईएम के साथ घने कोर Aβ सजीले टुकड़े को निशाना बनाने के लिए एक correlative दृष्टिकोण बताते हैं। विवो इंजेक्शन में methoxy-X04 मस्तिष्क वर्गों है कि विशेष क्षेत्रों के भीतर Aβ सजीले टुकड़े हैं और ब्याज की परतों के हिप्पोकैम्पस सीए 1, तबके radiatum, और lacunosum-moleculare होते हैं, उदाहरण के लिए के तेजी से चयन अनुमति देता है। वर्तमान उदाहरण में, methoxy-X04 पूर्व स्क्रीनिंग पूर्व embedding अध्ययन करने के लिए कैसे अलग microglial phenotypes घने कोर Aβ सजीले टुकड़े की उपस्थिति में ultrastructural स्तर पर synapses के साथ बातचीत के लिए IBA1 immunostaining के साथ जोड़ दिया गया था।

Microglia अपने परिवेश के लिए अविश्वसनीय रूप से जिम्मेदार हैं और उनके भड़काऊ गतिविधि लंबे सामान्य मस्तिष्क समारोह को कम और ई की उन्नति को बढ़ाने के संदर्भ में अध्ययन किया गया है। विशेष रूप से, इन कोशिकाओं को उनके व्यापक सक्रियण और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स की रिहाई के कारण neurodegenerative प्रक्रियाओं में फंसा रहे थे, Chr के लिए अग्रणीonic neuroinflammation, और सामान्य मस्तिष्क के विघटन 15 homeostasis। हाल के वर्षों में, हालांकि, इन निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं भी सक्रिय रूप से स्वस्थ मस्तिष्क में neuronal सर्किट फिर से तैयार करने के लिए नए रोगजनक तंत्र 16,17 की पहचान करने के लिए अग्रणी दिखाया गया। Synapses पर उनके शारीरिक भूमिकाओं ईस्वी में neuroinflammation दौरान dysregulated बन सकता है, exacerbated synaptic हानि, वर्तमान में सबसे अच्छा विभिन्न neurodegenerative शर्तों 18,19 भर में संज्ञानात्मक गिरावट के रोग सहसंबंधी में जिसके परिणामस्वरूप।

पिछले प्री-embedding IBA1 धुंधला विधि 13 में किए गए संशोधनों अब ultrastructural स्तर पर मस्तिष्क वर्गों भर में एंटीबॉडी की बेहतर पहुंच है, साथ ही microglial सेल निकायों और ठीक प्रक्रियाओं के दृश्य की अनुमति। कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल है कि ultrastructural गिरावट पर विचार जब तक ऊतक वर्गों के प्लास्टिक राल एम्बेडिंग माउस छिड़काव से कड़ाई से प्रदर्शन किया जा करने की जरूरत हैकिसी भी बीच में कदम पर होने वाली सेलुलर झिल्ली, अंगों, cytoskeletal तत्वों, आदि की अखंडता से समझौता कर सकता।

इस प्रोटोकॉल पूरी तरह घने कोर Aβ सजीले टुकड़े कल्पना करने के लिए (धारा 6 को छोड़ते हुए) के द्वारा किसी भी immunostaining के बिना किया जा सकता है, लेकिन यह भी Aβ बयान के संबंध के साथ ई रोगजनन के जटिल तंत्र का अध्ययन करने के रूप में विभिन्न एंटीबॉडी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है सतही तौर पर व्युत्पन्न मैक्रोफेज, अंतर्जात microglia, astrocytes, oligodendrocytes और उनके पूर्वज, साथ ही कई न्यूरोनल उपप्रकार सहित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं, पर ध्यान केंद्रित।

Methoxy-X04 के vivo इंजेक्शन ध्यान में रखते हुए, इस प्रोटोकॉल जो पोस्टमार्टम मानव मस्तिष्क के नमूनों के साथ इसके उपयोग precludes तय मस्तिष्क वर्गों पर नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, इसके विपरीत Aβ के खिलाफ immunostaining जो Aβ के घुलनशील और अघुलनशील रूपों, के लिए बाध्य रंगों के उपयोग लेबल के लिए बीटा pleated रोंऐसे methoxy-X04 के रूप में heet प्रोटीन संरचनाओं केवल घने कोर सजीले टुकड़े हैं, जो एक और सीमा गठन के दृश्य के लिए अनुमति देता है।

फिर भी, महत्वपूर्ण अनुप्रयोगों microglia और अन्य विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं, जो ओवरलैप और उनकी गतिविधियों को बढ़ाने, और पट्टिका homeostasis और ई विकृति विज्ञान के पाठ्यक्रम पर न्यूरोनल समारोह पर प्रत्यक्ष प्रभाव हो सकता है की भूमिका का अध्ययन शामिल हो सकते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Methoxy-X04 Tocris Bioscience 4920 10 mg substrate per tablet
Propylene glycol Sigma Aldrich W294004 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-1 Caution: toxic
Sodium Chloride NaCl Sigma S9625
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876
Tris Hydrochloride Fisher BioReagents BP153500
Acrolein Sigma 110221 Caution: Toxic
Paraformaldehyde Granular Electron Microscopy Sciences 19210 Caution: Toxic
Filter paper Fisher 09-790-14F
Peristaltic Pump with Tubing ColeParmer cp.78023-00
Excel Winged blood Collection Set Needles 25 G Becton Dickinson 367341
Extrafine Forceps F.S.T 11152-10 Tip shape: curved
Scissors F.S.T 14090-09 Tip shape: straight
Hartman Hemostats F.S.T 13003-10 Tip shape: curved
Surgical Scissors F.S.T 14004-16 Tip shape: straight
Micro Dissecting Scissors ROBOZ surgical store 5818
Glass scintillation vials Fisher Scientific 74515-20
Vibrating Blade Microtome Leica VT1000 S Leica Biosystems  14047235612
Vibratome blades Electron microscopy Sciences 71990
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
24-well Tissue Culture Plates Fisher Scientific 353047
Ethylene Glycol Fisher BioReagents BP230-4
Glycerol Fisher BioReagents BP229-4
Hydrogen Peroxide, 30% J.T.BAKER cat: 2186-01
Sodium borohydride Sigma 480886
Tris HCl Fisher BP153-500ML
Fetal bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F1051
Bovine serum albumin (BSA), fraction V Thomas Scientific C001H24
Triton X-100 Sigma T8787
Anti IBA1, Rabbit  WAKO 019-19741
Goat Anti-Rabbit IgG Jackson Immunoresearch 111066046
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) Vector Labs PK-6100
3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) Sigma D5905-50TAB Caution: toxic
Osmium tetroxide, 4% solution Electron Microscopy Sciences 19150 Caution: toxic
Durcupan™ ACM single component A Sigma 44611 Resin Caution: Toxic
Durcupan™ ACM single component B Sigma 44612 Hardener Caution: Toxic
Durcupan™ ACM single component C Sigma 44613 Plasticizer Caution: Toxic
Durcupan™ ACM single component D Sigma 44614 Accelerator Caution: Toxic
Ethanol LesAlcoolsdeComerce 151-01-15N
Propylene oxide Sigma 110205 Caution: corrosive
Aluminum weigh dishes Electron Microscopy Sciences 70048-01
ACLAR®–Fluoropolymer Films Electron Microscopy Sciences 50425
Oven/Incubator VWR

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References

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