לימוד ההסתדרות המולקולרית של פוטוסינתזה ממברנות בתוך הרקמות ליף Freeze-שבר ידי Cryo-סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Charuvi, D., Nevo, R., Kaplan-Ashiri, I., Shimoni, E., Reich, Z. Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (112), e54066, doi:10.3791/54066 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

קריו סריקה במיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) של דגימות-שבר הקפאה מאפשר חקירה של מבנים ביולוגיים בתנאי יליד קרובים. כאן אנו מתארים טכניקה ללימוד הארגון המולקולרי של פוטוסינתטיים (תילקואיד) ממברנות בתוך דגימות עלים. זו מושגת על ידי הקפאה בלחץ גבוה של רקמות עלה, להקפיא-שבירה, ציפוי שכבה כפולה ולבסוף הדמית קריו-SEM. השימוש בשיטה ציפוי שכבה כפולה מאפשר רכישת הגדלה גבוהה (> 100,000X) תמונות עם נזק קרן מינימלי דגימות קפואות-hydrated כמו גם אפקטים טעינה מינימלית. שימוש בהליכים שתוארו חקרנו את השינויים בחלוקה מולקולרית של מתחמי photosystem וחלבון אנטנת אור-קציר המתרחשים במהלך ההתייבשות של pumilum Craterostigma צמח תחייתו, באתרו.

Introduction

פוטוסינתזה חמצנית, שמקורם כחוליות עתיקות, ירשה אצות וצמחים קרקע על ידי אירועי endosymbiotic שהובילו להתפתחות של אברון הכלורופלסט. בכל phototrophs חמצנית ימינו, הובלת האלקטרונים פוטוסינתטיים והדור בכוח פרוטון-מניע כוח צמצום מתבצעות בתוך שלפוחית ​​דמויי השק פחוס כינה 'תילקואיד' ממברנות. ממברנות אלה לשכן את קומפלקסי חלבוני המבצעות תגובות מונחים-האור של פוטוסינתזה ולספק בינוני עבור תמרת אנרגיה. הממברנות תילקואיד של צמחים ובעלי (חלק) אצות הם מובחנים לשני תחומים מורפולוגיים ברורים: אזורים קרום appressed בחוזקה שנקרא 'Grana' וממברנות unstacked בו מקשרים בין Grana, שנקרא 'lamellae stroma' 1. להקפיא שבר שונים מחקרים של צמח וממברנות תילקואיד אצות נערכו, החל בשנות ה -1970 המוקדמות. כאשר שבר-הקפאה, ממברנותלפצל יחד Core 2 הידרופובי שלהם, יצירת פנים exoplasmic (EF) ופנים protoplasmic (PF), תלוי בתא הסלולר אשר לגבולות חצי קרום, כפי שטבע במקור על ידי Branton et al. יש ב -1975 3 צמחים תילקואיד אץ ארבעה פרצופים שברים שונים:. מקדמי פליטה, EFu, PFS ו Pfu, עם 's' ו 'U' 'מוערם' ו 'unstacked' קרום אזורים מציינים, בהתאמה. מתחמי חלבון הממברנה, אשר אינם לפצל או שבורים, יש נטייה להישאר עם או E או P צד של הממברנה. התצפיות הראשוניות כי פניהם שבר השונים של תילקואיד מכילים חלקיקים בגדלים שונים וצפיפות 4, ואת חקירות רבות שלאחר מכן, הובילו לזיהוי קורלציה בין החלקיקים הנצפים ואת קומפלקסי חלבונים בממברנה מבצעות תגובות האור 5-13 (ראה גם ביקורות 14,15).

freEze-שבר ניסויים של ממברנות תילקואיד בדרך כלל מבוצעים על הכנות של כלורופלסטים או ממברנות תילקואיד המבודדות (אך ראה 16,17), בסיכון של כל שינוי ב מבני ו / או ארגון מולקולרי אשר עלול להתרחש במהלך ההליך בבידוד. בעקבות שבר, העתקים מוכנים ידי אידוי של פלטינה / פחמן (Pt / C), ולאחר מכן על ידי שכבה עבה של פחמן (C), ולבסוף עיכול של החומר הביולוגי 18. רפליקות הם דמיינו ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (TEM). הטכניקה להקפיא שבר-ההעתק המסורתית ממשיכה לשמש ככלי חשוב ללימוד הארגון המולקולרי של ממברנות פוטוסינתטיים והתאמתנו שונים, למשל., אור, תנאי 19-23.

במחקר האחרון שלנו של צמח תחיית homoiochlorophyllous Craterostigma pumilum 24, אנו בקשנו לבחון את השינויים שחלו o הארגון המולקולריממברנות תילקואיד f, כמו גם בארגון הסלולר הכוללת, במהלך התייבשות התייבשות. ייחודו של מיני תחייה homoiochlorophyllous הוא שהם מסוגלים לשרוד בתנאים של יובש ברקמות וגטטיבי שלהם (עלים), תוך שמירה על מנגנון הפוטוסינתזה שלהם. ברגע שמים זמינים, הצמחים האלה להתאושש ולהמשיך בפעילות פוטוסינתטיים בתוך שעות עד מספר ימים 25. לצורך המחקר, EM-סריקת קריו (SEM) הדמיה של דגימות עלים שבר הקפאה אוחדה עם בלחץ גבוה קופא-וקיבוע קריו מדגם. נהלים אלה לספק אמצעי לדמיין דגימות ביולוגיות קפוא hydrated בכל מדינה קרובה למצב הטבעי שלהם 26. יתרון עיקרי אחת הוא כי דגימות נבחנות ישירות לאחר שבר הקפאה וציפוי ללא מדרגות רצופות. זה רלוונטי במיוחד לחקירת צמחים תכולי מי ביחס שונה (RWC), כמדינת הידרציה שלהם נשמרת במהלך הכנה. אֵיךפעם, חיסרון קריטי אחד הוא כי דגימות קפואות-hydrated עלולים לסבול מנזק הקורה במהלך ההדמיה, במיוחד כאשר סרק בהגדלה גבוהה, נדרש עבור מדידה מדויקת של גודל של מתחמי פוטוסינתטיים. כדי להתגבר על זה, שיטה הנקראת 'ציפוי שכבה כפולה "(DLC) 27,28 בשילוב עם תנאי הדמית קריו-SEM ספציפיים נוצלו. אלה באו לידי ביטוי דגימות כי הם פחות קורה רגיש ואפשרנו להבהרת מידע רב ערך על ארגון פוטוסינתטיים חלבון מולקולרי ומרכיבים תאיים אחרים של הצמח ותחייתו ג pumilum בהגדלה גבוהה באתרו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. קריו קיבעון של רקמות ליף ידי הקפאה בלחץ גבוה

הערה: סעיף זה מתאר כיצד לבצע הקפאה בלחץ גבוה של רקמות עלו לניסוי להקפיא שבר. משיקולים הקשורים דגימות צמח לראות 29. זה יכול להיות מותאם עבור סוגים אחרים של רקמות או דגימות עם שינוי כלשהו.

  1. שימוש בפינה של סכין גילוח, לגרד את החלק התחתון של חלל 0.1 מ"מ של טסיות אלומיניום 0.1 / 0.2 מ"מ (איור 1). הכן לפחות תריסר טסיות (6 דגימות). קח זהירות לא ליצור סימני סכין על ההיקף של הדיסק.
    1. לאחר מגרד, לשטוף דיסקים באתנול מוחלטת, ולתת להם להתייבש ולשמור בצלחת נקייה.
  2. הכן את מכונת ההקפאה בלחץ גבוה פי הוראות היצרן. ממלא את חדר האלכוהול של מכונת ההקפאה בלחץ גבוה עם isopropanol.
  3. כן infiltratio תוצרת בית ואקום בסיועn המכשיר להחליף גז נמצא רקמת העלה עם נוזל.
    1. בחוזקה להתחבר טיפ 200 פיפטה μl עד הסוף של מזרק 10 מ"ל. חותכים ~ 1 ס"מ של קצה. עושים חור במכסה של צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל ל בחוזקה להתאים את קצה לחתוך. אבק יכול להיווצר בתוך הצינור על ידי משיכת הבוכנה של המזרק.
  4. חותכים חתיכה קטנה של עלים מצמח באמצעות סכין גילוח עם פינצטה מעמידים את עלה בתוך צינור microcentrifuge חצי מלא עם 1-hexadecene. לחדור את החללים בין תאית של העלה עם הנוזל על ידי משיכת הבוכנה בעדינות כדי ליצור ואקום, להחזיק למשך כ -30 שניות, ואז לאט לאט לשחרר את הבוכנה.
  5. הסר את פיסת עלה מהצינור באמצעות פינצטה. חתוך את עלה עם סכין גילוח במקרה זה הוא עבה יותר 0.2 מ"מ וחותכים חתיכה קטנה שתתאים לתוך טסיות.
  6. מניח טסיות נקי עם הצד השרוט לגמרי לתוך המחזיק של מכונת ההקפאה ולאחר מכן למקם את פיסת הקיצוץ של leaf לתוך טסיות. למלא את החלל שנותר סביב עלה עם 1-hexadecene. סיגרו את הכריך באמצעות טסיות אחר, עם השריטות מול העלים.
  7. סגור והדק את הבעל ולהכניס אותו לתוך התא של המכונה. ואז ללחוץ על כפתור "יט 'להקפיא (~ 2,100 ברים תמורת 300 - 500 אלפיות השניה), ובמהירות להעביר לבעל לתוך חנקן נוזלי. מוציאים בזהירות את הכריך קפוא מבעל באמצעות פינצטה מראש מקורר, נזהרת שלא שבר את הכריך.
    הערה: כריכים קפואים סגורים יכולים להיות הקפאה שברה מייד או לשמור חנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר. השתמש בגדי משקפי מגן בעת ​​טיפול בחנקן נוזלי.

2. Freeze-שברים-שכבה כפולה ציפוי 27,28

  1. הכן את מכונת שבר הקפאת לשימוש, כולל שני רובים לאידוי פלטינה / פחמן (Pt / C) ופחמן, על פי הוראות היצרן. מניחים את האקדח Pt / C ב 45 מעלותnd אקדח פחמן ב -90 מעלות.
    1. -תוכנית קדם ערכת ציפוי של שכבה 2 ננומטר של Pt / C (שיעור ציפוי 0.02 - 0.04 ננומטר / sec) ושכבת 6 ננומטר של פחמן (ב ~ 0.1 ננומטר / sec).
      1. הזן את ההתקנה, במסך של מכונת הקפאה-שהבר. בחר מספר משתמשים שבו ערכת הציפוי תישמר.
      2. בחר Pt / C עבור 'שכבה 1 ". בחר מסגרת זמן, למשל., 5 דק '(יעלה את הזמן הדרוש לצורך השלמת ציפוי). השתמש בחצים מעלה-מטה להגדיר בעובי של 2 ננומטר.
      3. לחץ על לחצן 'שכבה' לעבור שכבה חזור על שלב 2. 2.1.1.2, למעט פחמן בחר ולהגדיר בעובי של 6 ננומטר.
    2. בדוק ולהתאים פעולת אקדח.
      1. בחירה 'שכבה 1 ". בחר את אקדח Pt / C על ידי לחיצה על הכפתור "GUN1 'ולחץ על כפתור ON בשלט האידוי של מכונת הקפאה-שהבר. לפקח על קצב האידוי לערוך אותו באמצעות ידיות מתח ופליטת until עמד על שיעור של 0.02 - 0.04 ננומטר / sec. "OFF" לחץ על כדי לכבות את האקדח Pt / C.
      2. בחירה 'שכבה 2'. חזור 2.1.2.1, למעט בחירה 'GUN2' ולהתאים עבור שיעור האידוי של ~ 0.1 ננומטר / sec.
  2. מצנן את במת מערכת שבר הקפאת -140 C או C -160 (עלי hydrated או מיובשים, בהתאמה). צרף מעבורת העברת הוואקום קריו למכונית ולמלא הקאמרי שלה עם חנקן נוזלי. לחץ בתא ההקפאה-שבר מקורר הוא בדרך כלל בין 1 - 8 x 10 -7 mbar.
  3. הכנס בעל דגימה שבירה הקפאה (מתאים טסיות 3 מ"מ) לתוך תחנת הטעינה. להציף את תא טעינת התחנה עם חנקן נוזלי.
  4. טען שני כריכים קפואים על אחד בעל יד אחד באמצעות פינצטה כיתת דיוק גבוה. הדק את הכריך הראשון לתוך החזיק ואז להעיף את הבעל מעל לבדוק שזה מתאים בבטחה במקום. חזור על הכריך השני.
  5. Detach המעבורת המקוררת ממכשיר שהבר הקפיא ולחבר אותו אל תחנת הטעינה. פתח את שסתום ההסעות, להציג את הזרוע בהתכנסות אל הבעל וכלא אותו למקומו. מחדש להציג את הזרוע עם הבעל לתוך המעבורת לסגור את שסתום ההסעות באמצעות כפתור תחנת טעינה. צרף המעבורת למכונית להקפיא שבר ולהציג בעל ההחדרה עם היד חוזר בה. לנתק את ההסעות מהמכונה.
  6. יישר את הסכין microtome שבר הקפאת לגובה כזה שהוא יוריד את טסיות העליון של כריכים.
  7. עם סכין microtome, במהירות לשבור את הסנדוויצ'ים, ומייד ולהעלות אותו על מנת למנוע זיהום של הדגימות ידי היצמדות פסולה אל הסכין, ולהפוך את התריס המקורר מעל למישור שנחשף מחדש כדי להגן על הדגימות מפני זיהום אפשרי על ידי מולקולות מים החדר.
  8. מעיל דגימות עם פלטינה ופחמן.
    1. הזן 'שכבה 1 "על SCreen. הפעל את האקדח Pt / C על ידי לחיצה על כפתור "GUN1 'ואחריו כפתור ON. לבדיקת קצב האידוי ברגע שהוא מגיע 0.02 - 0.04 ננומטר / sec, בו זמנית לחשוף את הדגימות ולחצו על כפתור "מדוד" לפקח על עובי השכבה שהופקדה.
      הערה: האקדח יכבה באופן אוטומטי כאשר העובי הגיע הערך שנבחר מראש.
    2. מכסה את הדגימות עם התריס כאשר אידוי Pt / C הושלם.
    3. לחץ על לחצן 'שכבה' לעבור 'שכבה 2'. חזור על שלבים 2.8.1 ו 2.8.2, למעט בחירת 'GUN2' (עבור פחמן) ושיעור אידוי של ~ 0.1 ננומטר / sec.
  9. מומלץ לחמם את במת מערכת שבר הקפאת -120 C.

3. Cryo-מיקרוסקופ אלקטרוני סורק

  1. הכן את מיקרוסקופ אלקטרונים סורק לעבודה קריו.
    1. בחר שלב / שלב initialise מהתפריט confirm הראשי.
    2. בחרו כלים / Goto לוח, ולפתוח בלוח airlock 'על ידי בחירה מתוך הרשימה. לחץ על הכפתור 'הטור הסגור לשכת Valve ". Vent תא מיקרוסקופ על ידי לחיצה על כפתור Vent תחת הלשונית 'אבק'.
    3. בחר כלים / גוטו לוח, ולפתוח בלוח שלב נקודות רשימה '. בחר את מיקום שער קריו לעבור לשלב לקואורדינטות הראויות לקבל את בעל המדגם. הערה: עמדת קריו-החליפין 'מוגדר מראש להיות בקנה אחד עם עמדת יחידת העברת ואקום.
    4. פתח את תא הדגימה עם זוג נקי של כפפות והכנס את הבמה cryo על הבמה המרכזית של המיקרוסקופ. סגור את התא ולחץ על כפתור המשאבה בכרטיסייה 'האבק'.
    5. מצננים את מיקרוסקופ כדי -120 C. מלאו את המיקרוסקופ דיואר עם חנקן נוזלי. הפעל את פונקציית חום על יחידת הבקרה קריו-העברת -120 C פעם את הטמפרטורה של שלב יורדת מתחת -120 C.
  2. עו"דACH מעבורת קריו-העברת המיקרוסקופ ולהעביר בעל המדגם באמצעות הזרוע בהתכנסות אל במת cryo מיקרוסקופ (כמו בשלב 2.5). לנתק את המעבורת מן מיקרוסקופ.
  3. לחץ על כפתור 'טור להרחיב לשכת Valve' בלוח מנעל האוויר.
  4. בזהירות להזיז את בעל הדגימה קרוב העדשה האובייקטיבית (עבודה מרחוק 1 - 2 מ"מ) באמצעות ג'ויסטיק. בחר צמצם 10 מיקרומטר על הכרטיסייה 'הפתחים'. לחץ לחיצה כפולה על שדה EHT בכרטיסייה 'אקדח'. זן 10 (ק) עבור יעד EHT ולחץ על אישור. הקישו על הכרטיסייה EHT התחתונה ובחר "EHT ביום '.
  5. בחירה 'InLens' מהרשימה הנפתחת גלאי בכרטיסייה 'גלאי'. לייעל את תנאי הדמיה (פוקוס, בהירות והניגודיות, יישור קרן, אסטיגמציה) על פי צורך.
  6. לחץ על הכרטיסייה 'סריקה'. בחר סריקה מהירה ( 'מהירות סריקה = 1', המתאים להתעכב זמן של 100 NSEC לפיקסל) כדי למזער את הנזק הקורה, ואתא 'ברזולוצית חנות' של 1,024 x 768 פיקסלים. בחר "קו ממוצע 'ברשימה הנפתחת' הפחתת רעש '. התאם את הערך של N כדי 20 - 30 קווים לחיפוש. הזז את המדגם באמצעות הפונקציה 'Centre Point' (על ידי לחיצה לשונית מלאה במקלדת) כדי לחפש אזורים עם תאי שבר כלורופלסטים (איורים 2 א ו -2).
  7. לרכוש תמונות של כלורופלסטים שבר בהגדלות נמוכות (50 - 70 KX) (איור 2 ג ו 2D). השתמש בפונקצית 'תכונת המרכז' (על ידי לחיצה מלאה-Shift-Tab במקלדת) כדי להתקרב אל פן שבר הכלורופלסט מעניינים לרכוש תמונות בהגדלה גבוהה (100 - 200 KX, איורים 3 ו -4). השתמש באותו הפרמטרים כמו בשלב 3.6 לרכישת תמונה, אבל לשנות את הערך הממוצע ליין N> 100 עבור הפחתת רעש 30.
    1. Freeze לחץ על יחידת בקרת מיקרוסקופ הראשית או בלשונית 'הסריקה' כדי לעצור את הסריקה ולשמוראת התמונה על ידי לחיצה על כפתור "שמור TIFF '.

ניתוח תמונה 4.

הערה: סעיף זה מתאר הליך קצר עבור פילוח של חלקיקי קרום מתמונות SEM-שבר הקפאה באמצעות חבילת הקוד פתוח 31 פיג'י. ניתן להשיג תוצאות דומות עם תוכנת ניתוח תמונה אחרת.

  1. פתח את התמונה עם פיג'י ידי גרירת קובץ התמונה לתוך חלון התוכנה הראשי. המר את התמונה לפורמט 8-bit על ידי בחירת תמונה / סוג / 8 סיביות. תמונה בחר / התאם / בהירות / ניגודיות ולהתאים לפי הצורך (איור 5 א).
  2. באמצעות כלי הקו הישר, למתוח קו את גודל סרגל קנה מידת תמונה המוטבע. בחר לנתח / סט סולם. הזן את הפרטים בקנה המידה הנכונים (מרחק ידוע יחיד אורך) ולחץ על אישור. שמור תמונה מותאמת מותאם זה.
  3. תהליך / מסננים בחרו / לטשטש גאוס (1.5 רדיוס ננומטר) ולוחצים על אישור (איור 5).
  4. תמונה בחר / התאם / Auto מקומי סף (בשיטת Niblack) ולחץ על אישור (5C איור).
  5. בחר ערוך / הפוך ואז תהליך / בינארי / פרשת המים (5D איור).
  6. צייר גבול סביב האזור של (ROI) העניין עם כלי בחירת Freehand. מוסיפים את הבחירה למנהל ROI על ידי בחירת ערוך / בחירה / הוסף מנהל או על ידי לחיצה על 'T'.
  7. בחר עריכה / נקה בחוץ (איור 5E).
  8. בחר לנתח / מדידות גדר, לבחור את הפרמטרים המתאימים (למשל, אזור, אליפסה בכושר).
  9. בחר לנתח / לנתח חלקיקים. זן טווח מתאים לגודל של חלקיקים ולסמן 'תוצאות תצוגה', 'הוסף מנהל', ואם יש צורך, 'אל תכלול בקצוות "אפשרות ולחץ על אישור. התוצאה מוצגת באיור 5F.
  10. פתח את הקובץ צלם מדורגים הציל (שלב 4.2). בחר "הצג הכל", ובטל את הסימון 'תוויות' במנהל ההחזר על ההשקעה. סקור את partic שנבחרles הניח על התמונה המקורית והוסף ידני או סר של בחירות באמצעות 'הוסף' או על 'מחק' כפתורים של מנהל ROI. תקן כל בחירות צורך על ידי שימוש באפשרות בחירת Freehand ואת הכפתור 'עדכן' של מנהל ROI (דמויות 5G ו 5H).
  11. לנתח את הנתונים באמצעות המדידות שהתקבלו. בחלון התוצאות, לחץ על תוצאות / סכם להשיג, למשל, באזור הרע, רעת סרן וגרזנים מינור של החלקיקים המופיעים במנהל ההחזר על ההשקעה. לחץ תוצאות / הפצה, בחר פרמטר (כגון פינה) ולחץ על אישור כדי להציג היסטוגרמה עבור פרמטר זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג קריו-SEM תמונות של טסיות המכיל בלחץ גבוה קפוא, להקפיא-שבר Craterostigma pumilum עלה חתיכות. בדגימות מסוימות, אזורים גדולים של תאים שבר מתקבלים (איור 1 א). במקרים אחרים, פיסת העלה נשארת הדוקה לדיסק העליון והוא יחוסל יחד עם זה (איור 1B). עם זאת, גם במקרה השני, כמה רקמת העלה עשוי נשארים מחוברים חריצים הסכין על טסיות (איור 1B, ראשי חץ) וכן כמות נכבדה של נתונים עדיין יכול להיות שנאספו על ידי הדמיה עלה "שאריות", בתנאי שהם היו שבורות. לאחר נמצא שבר מוצלח, תמונות בהגדלה נמוכות של תאים נרכשות לזהות אזורים של עניין, ב כלורופלסטים במקרה זה (איור 2).

תמונות גדלות גבוהה של ממברנות תילקואיד ב C. pumilum העלים מוצגים איורים 3 ו -4. ארבעה הפרצופים שבר שונים, מקדמי הפליטה, EFu, PFS ו Pfu, ניתן להבחין (איור 3). Photosystem II (PSII), שהוא מורכב החלבון הגדול ביותר שנמצא הקרומים, ממוקם בשני מקדם הפליטה (Grana) ו EFu (lamellae stroma). בתנאי hydrated, צפיפות PSII היא ~ 3 פעמים גבוהה יותר מאשר מקדמי פליטת EFu (~ 1,550 מתחמי מיקרומטר -2 לעומת ~ 550 מתחמים מיקרומטר -2, איור 3). זהו בסיס אחד להבחנה בין שני פרצופים רציפים אלה. נוסף הוא הבדל הרקע שלהם. בעוד ברקע המקדם הפליטה מופיע חלק, פן EFu מחוספסים מכילים חורים כי הם העקבות של מתחמי PSI מנותקים, אשר שבר על פן משלימים, 10 Pfu (איור 3). דוגמא לפילוח מתחמי PSII מעל פני מקדמי הפליטה של הממברנה תילקואיד מוצגת באיור 5.

ove_content "FO: keep-together.within-page =" 1 "> במהלך התייבשות של pumilum ג, צפיפות PSII בממברנות Grana (EFS) פוחתת בהדרגה והגיע כמחצית (~ 700 מתחמי מיקרומטר -2 ב ~ 15 RWC%, איור 4C) של צפיפות שלהם בתנאי התייבשות (100% RWC, איור 4 א) יש לציין, עם התייבשות נוספת, עד 5 -. 10% RWC, מתחמי PSII לארגן לשורות ומערכים (חיצים, תרשימים 4D ו 4E). עבור בסיס נתונים מלאים, ראה 24. כינונה של מערכי PSII כזה מחייב כי חלק ממתחמי האנטנה הנכנס שלהם, LHCII, להתנתק PSII. דוגמא מתחמי LHCII המאורגנים שורות PFS זה יהיה משלים מתחמי PSII מאורגנים (ב מקדם הפליטה מוצג) באיור 4E (ראש חץ). מתחמי PSII ב המערכים, כמו גם את LHCII המנותקת, צפויים להיות במצב רווה photochemically, ממלא את תפקידי צילום מגן. rearrangements המבני אלה כחלק מהמנגנונים מנוצלים על ידי הצמח ותחייתו ג pumilum להגן על עצמה במצב מיובש 24.

איור 1
איור 1. נמוך הגדלה קריו SEM תמונות של טסיות עם Freeze-שבר ג pumilum ליף הבתרים. (א) אזור גדול של תאים שבר (מתאר מקווקו) של ג עלה pumilum. (ב) חתיכת העלה הועפה עם טסיות העליון, אבל כמה רקמת עלה נשארת קשורה סימני הסכין על טסיות התחתונה (ראשי חץ לסמן כמה כאלה). האזורים סביב חתיכות עלה קפואים 1-hexadecene (כוכביות). ברי סולם:. 200 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אף אוזן גרון "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 2
איור 2. התקרבות אל כלורופלסטים. (א) קבוצת פוטוסינתטיים שבורה (mesophyll) תאים (כוכביות) של רקמת העלה התייבשות. רוב נפח התא מורכב vacuole המרכזי גדול, עם כל המרכיבים ציטופלסמית סביב vacuole ברצועה צרה. (ב) שני תאים שבורים שכנות - דופן התא (CW) מסמנים את הגבול בין התאים. חמש כלורופלסטים (ג) יבואו לידי ביטוי גם את התמונה, רק אחד מהם כבר שבר (המטוס שבר בסימן ראש חץ). (C ו- D) דוגמאות כלורופלסטים שבר יחיד מתוך hydrated (C) ומיובשים (D, ~ 15% תכולת המים היחסית [RWC]) צמחים. הנקודות הלבנות הקטנות (למשל, ראשי החץ) הן קומפלקסי חלבונים הממברנה הנמצאים בתוך ממברנות תילקואיד של הכלורופלסט. שימו לב SURR vesiculation מסיביounding הכלורופלסט נמצא העלה המיובש (D). ברי סולם: 10 מיקרומטר (א); 1 מיקרומטר (ב); 200 ננומטר (C ו- D). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. הארגון המולקולרי של תילקואיד ממברנות בתוך רקמות צמח הכלורופלסט שבר שבו הפרצופים שברי תילקואיד השונים ניתן לראות:. פניהם שבר exoplasmic (EF) של שני המוערמים (EFS) unstacked (EFu) אזורי הממברנה מכילים photosystem II (PSII) מתחמים; הפנים שבר protoplasmic של אזורים מוערמים (PFS) מכיל מתחמי היקפי אור-קציר האנטנה של PSII, LHCII; Photosystem אני (PSI) ושבר synthase ATP על הפנים שבר protoplasmic של אזורים unstacked (Pfu); ב ציטוכרום 6 ו אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. שינויי Photosystem שני הארגון במהלך ההתייבשות של ג pumilum מקדמי הפליטה פרצופים של ממברנות תילקואיד של צמחים בבית RWC שונים: (א) 100%, (B) ~ 40%, (C) ~ 15%, ו- (D ו- E) 5 - 10%.. במהלך התייבשות, צפיפות PSII ב מקדם הפליטה להתמודד פוחתת בהדרגה מ ~ 1,500 מתחמי מיקרומטר -2 (א) ל ~ 700 מתחמי מיקרומטר -2 (~ 15% RWC, C). יש לציין, ב בתנאים יבשים (5 - 10% RWC), כמה PSשניית מתחמים לארגן לשורות ומערכים (D ו- E, חיצים). ראש החץ (E) מסמן את הפנים PFS, עם אנטנה LHCII המופיעים גם להיות מאורגן בשורות, בין אשר שורות PSII יהיה למצוא מקדם הפליטה משלימים. לקבלת מידע נוסף על נתונים אלה ראו 24. ברי סולם:. 100 ננומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. דוגמה פילוח Photosystem השנייה חלקיקים. באמצעות חבילת קוד פתוח פיג'י, קומפלקסים חלבונים ניתן לפלח מהתמונות עם מספר צעדים (להשלים הליך מפורט נמצא חלק 4 של סעיף לפרוטוקול). תמונות (A, תמונה מקורית) מיטשטשים עם מסנן גאוס (B); התמונה thresholded באמצעות ה מקומית אוטומטיתכלי reshold (C); התמונה היא הפוכה אלגוריתם פרשת המים מוחל על מנת אובייקטים נפרדים נמצאים בקשר הדוק (ד); אזור של אינטרס נבחר מבחוץ מנוקה (E); חלקיקים (בטווח גודל המוגדר על ידי משתמש) נבחרו באמצעות פונקצית מנתח חלקיקים. המסכה וכתוצאה מכך מוצגת (F). חלקיקים אלה מתווספים מנהל ROI והועברו התמונה המקורית (G) כדי לבדוק אם יש שגיאות או עבור חלקיקים פגומים או שלא נענו. רשימת ROIs ניתן לערוך באופן ידני, החלפה מחיקה או הוספת ROIs חדש, לפי צורך. הבחירה שנערך על ידי המשתמש הסופית מוצגת (H). סרגל קנה מידה:. 200 ננומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הטכניקה המתוארת במאמר זה מאפשר חקירה של ממברנות-שבר הקפאת בהקשר של השתמרו היטב רקמות הצמח קפוא בלחץ גבוה על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים קריו-סריקה. היתרון העיקרי של שימוש נהלים אלה הוא כי הכנת מדגם היא פיזית גרידא; שום צעדי שימוש בחומרים כימיים או התייבשות נחוצים. לכן, זה מאפשר לימוד מבנים ביולוגיים בכל מדינה כמעט טבעית 26,32. היתרון של שימוש ברקמות עלה הוא כי ניתן לקבל מידע על הארגון הסלולר הכוללת, כמו גם ממברנות ספציפיים מחקר, כגון ממברנות תילקואיד, בתוך ההקשר הפיזיולוגי מולדתם, כלומר, בתוך הכלורופלסט. יתרון נוסף, הכרחי ללימוד ג צמחי pumilum על תכני מי ביחס שונים (RWC), הם כי מדינת הידרציה שלהם אינה משתנית במהלך הכנה. זה בניגוד ניצול כלורופלסטים מבודדים או ממברנות תילקואיד כחומר המוצאעבור ניסוי להקפיא שבר. בחודש האחרון, יש גם לקחת בחשבון כי כמה שינויים מבניים ו / או מולקולריים סביר להתרחש במהלך הבידוד אברון / קרום.

עבודה עם דגימות רקמות הצמח, שהן יחסית עבה [> 50 - 100 מיקרומטר, והוא יכול להיות עבה באופן משמעותי בהתאם לסוג של רקמות ומינים], מכתיב את השימוש בלחץ גבוה הקפאה (HPF) עבור vitrification המדגם. הפעלת לחץ גבוה [2,100 בר], שבו טמפרטורת ההתכה של מים היא כ C -22 °, משפיעה על רשת אג"ח מימן המים כך שהוא מאט את קצב היווצרות קרח קריסטל. לכן, הסיכוי של קבלת מדגם מזוגג הוא גבוה אפילו בשיעורי קירור איטיים יחסית. HPF היא כיום השיטה זמינה רק עבור vitrification של עבה, עדיין לא תעלה על 200 מיקרומטר, דגימות. שלב קריטי עבור HPF של רקמות צמח הוא חדיר במרחבים האוויריים אינטר שלהם עם אינרטי4;. מילוי החלל "לפני ההקפאה, כדי למנוע קריסת רקמה תחת הלחץ הגבוה (ראה סקירות 29,33) במקרה של עלי pumilum ג, עובי אשר יכול להיות עד 1 מ"מ, העלים גם צריכים להיות מטופחים או דליל לפני HPF.

בעיקרו של דבר, את הטכניקה של הכנת העתק 18 יכולה להיות מיושמת גם להקפיא-שבר רקמות עלה. עם זאת, הניסיון שלנו, תשואה מספקת של אזורים השלמים שברים לא הושגה, מאז העתקים לעתים קרובות שבר לרסיסים קטנים. יתר על כן, בחיפוש עבור אזור מסוים של עניין כגון כלורופלסטים יכול להיות מעשי בתוך העתקים מקוטעים של רקמות צמח. הסיבה העיקרית לכך היא mesophyll (פוטוסינתזה) תאים מורכבים של vacuole מרכזי גדול מוקף רצועת ציטופלסמית צר (איור 2 א), הכולל את הגרעין, כלורופלסטים וכל אברונים אחרים. לפיכך, כלורופלסטים מייצגים רק חלק קטן מאוד של אזור שבורה הכולל שלרקמות mesophyll. קריו SEM הדמיה של דגימות-שבר הקפאה מציעה פתרון לבעיה זו מאז דגימות הם דמיינו ישירות הבאים שברים (וציפוי / הצללה). עם זאת, שיטה זו סובלת מגבלה קפוא hydrated דגימות הם הקורה רגיש ובכך סריקה בהגדלה גבוהה בקלות נזקים המדגם על הסריקה הראשונה. ציפוי שכבה כפולה (DLC) 27,28 מציע פתרון חיסרון רציני זה.

ב DLC, דגימות שבר הם מצופים באופן דומה לאופן שבו הם להכנת העתק. ראשית, שכבה דקה (1 - 3 ננומטר) של Pt / C הוא התאדה על המדגם, מתן בניגוד ומוליכות. זה ואחריו עבה (5 - 10 ננומטר), שכבת מגן של פחמן. DLC בשילוב עם מתח מאיץ גבוה (10 ק) שמש דגימות תמונה באמצעות אלקטרוני backscattered (BSE) האות 28. אות BSE, שמקורם משכבת ​​הפלטינה מאפשרת קבלת מידע שטח דרך פחמןוגם, אולי, שכבת מזהם אדי מים, שהן כמעט שקופים BSE במתח אץ גבוה (זיהום מים מצטבר ניסויים שבם יחידת ההעברה-קריו ואקום אינה משמשת ואת המשטח שהבורה חשוף האווירה, גם אם זה הוא לשבריר של שנייה). בנוסף, הדמיה באמצעות האות BSE למזער את בעיית הטעינה תופעות אשר יבואו לידי ביטוי גם אלקטרונים משניים (SE) זיהוי 27. עם התקנת מיקרוסקופ המתוארת כאן, ההדמיה של אות SE עם גלאי SE In-העדשה ב 10 kV ניב מקביל מידע לזו המתקבלת כאשר דגימות צופה רק עם 2 - 3 ננומטר של Pt / C הדמיה במתח אץ נמוך. ההבדל הוא כי דגימות שהכינו DLC צלמו כמתואר היו הרבה פחות קורה רגישות. עובדה זו אפשרה לנו לסרוק אותם בהגדלה גבוהה ובמקרים רבים אפילו שוב ושוב, ואיפשר קבלת מידע רב ערך על supramolecul חלבוני מערכת הפוטוסינתזהארגון ar ומרכיבים תאיים אחרים (איורים 2 - 4) 24.

לבסוף, בהתאם לנוהל המתואר יכול להיות שונה כדי ללמוד את הארגון חלבון מבנה ו / או קרום בסוגים אחרים של דגימות. השתמשנו בהצלחה בטכניקה זו כדי לחקור את הארגון המולקולרי של ממברנות פוטוסינתטיים בתאי כחוליות ו אצות (Shperberg-אובניים et al. נתונים שלא פורסמו). השיקול העיקרי הוא למצוא את האיזון בין הצורך רזה מדגם ככל האפשר, על מנת להגדיל את הסיכוי vitrification, תוך שמירה על תקינות המדגם. עבור סוגים שונים של דגימות, אשר יכולות להיות השעיות או ברקמות בעלי חיים / צמח, אריזות שונות אמורות לשמש (למשל, במונחים של הסוג של טסיות מנוצלת להקפאה בלחץ גבוה). לאחר מושגת קריו-וקיבוע מוצלח, השילוב של שבר הקפאה, DLC ו cryo-SEM הדמיה מספק אמצעי מצוין להשגת אינפוראינפור ארגון חלבון הממברנה בהגדלה גבוהה עם נזק קרן מינימלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

אנו מודים אנדרס Kaech (אוניברסיטת ציריך) עבור עצות מועילות שלו על סריקת הדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים. עבודה זו נתמכה על ידי המחקר החקלאי הדו-לאומית ארה"ב-ישראל ופיתוח הקרן (מענק לא. ארה"ב-4334-10, ZR), הקרן הלאומית למדע (מענק לא. 1034/12, ZR), והתכנית מדע האדם Frontier (RGP0005 / 2013, ZR). המחקרים במיקרוסקופ אלקטרונים נערכו בבית אירווינג צ'רנה מוסקוביץ 'מרכז ננו וביו-ננו הדמיה במכון ויצמן למדע.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol abs Bio-Lab 052505
Isopropanol Bio-Lab 162605
1-hexadecene Sigma-Aldrich H7009
0.1/0.2 Platelets Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland 241 Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems.
High-precision-grade tweezers Electron Microscopy Sciences 72706-01 Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers.
High-pressure freezing machine Bal-Tec HPM 010 High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.
Freeze-fracture system Leica Microsystems EM BAF 060
Cryo preparation loading stage Leica Microsystems 16770228
Specimen holder for univeral freeze fracturing Leica Microsystems 16LZ04746VN Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm
Vacuum cryo-transfer shuttle Leica Microsystems EM VCT 100
Scanning electron microscope Zeiss Ultra 055
Cryo SEM stage Leica Microsystems 16770299905
Image acquisiton software SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH
Image analysis software Fiji/Image J, National Institute of Health http://fiji.sc/Fiji

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26, (7), 625-639 (1999).
  2. Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55, (5), 1048-1056 (1966).
  3. Branton, D., et al. Freeze-Etching Nomenclature. Science. 190, (4209), 54-56 (1975).
  4. Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes - Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas. J. Cell Biol. 48, (3), 594-619 (1971).
  5. Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1. Eur. J. Cell Biol. 31, (2), 305-314 (1983).
  6. Staehelin, L. A. Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes. Invitro. J. Cell Biol. 71, (1), 136-158 (1976).
  7. Miller, K. R. A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I - Changes in Unstacked Membrane Regions. Biochim. Biophys. Acta. 592, (1), 143-152 (1980).
  8. Miller, K. R., Cushman, R. A. Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II - Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle. Biochim. Biophys. Acta. 546, (3), 481-497 (1979).
  9. Miller, K. R., Staehelin, L. A. Analysis of Thylakoid Outer Surface - Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions. J. Cell Biol. 68, (1), 30-47 (1976).
  10. Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein. Carlsberg Res. Commun. 44, (5), 305-336 (1979).
  11. Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes - a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex. Eur. J. Cell Biol. 59, (1), 176-186 (1992).
  12. Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants. Biochim. Biophys. Acta. 851, (2), 239-248 (1986).
  13. Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes. J. Cell Biol. 70, (2), 400-418 (1976).
  14. Staehelin, L. A. Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes. Photosynth. Res. 76, (1-3), 185-196 (2003).
  15. Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants. Plant J. 70, (1), 157-176 (2012).
  16. Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity - Freeze-Fracture Evidence. Protoplasma. 178, (1-2), 57-65 (1994).
  17. Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy. J. Electron Microsc. Tech. 13, (4), 288-299 (1989).
  18. Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51694 (2014).
  19. Kirchhoff, H., et al. Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts. Biochemistry. 46, (39), 11169-11176 (2007).
  20. Johnson, M. P., et al. Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts. Plant Cell. 23, (4), 1468-1479 (2011).
  21. Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement. Biochemistry. 43, (28), 9204-9213 (2004).
  22. Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems. Plant Cell Environ. (2015).
  23. Goral, T. K., et al. Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis. Plant J. 69, (2), 289-301 (2012).
  24. Charuvi, D., et al. Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant. Plant Physiol. 167, (4), 1554-1565 (2015).
  25. Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants. Plant Stress. 1, (1), 72-84 (2007).
  26. Walther, P. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy. Schatten, H., Pawley, J. B. Springer. New York. 245-261 (2008).
  27. Walther, P., Müller, M. Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy--present state and applications. Scanning. 19, (5), 343-348 (1997).
  28. Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy. J. Microsc. 179, (Pt 3) 229-237 (1995).
  29. Hess, M. W. Cryopreparation methodology for plant cell biology. Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).
  30. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184, (2), 355-360 (2013).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  32. Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212, (1), 34-43 (2003).
  33. Nevo, R., et al. Architecture of Thylakoid Membrane Networks. Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics