Die Untersuchung der supramolekulare Organisation Photosynthetic Membranen innerhalb Gefrier gebrochen Blattgewebe von Cryo-Rasterelektronenmikroskopie

Biology

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Charuvi, D., Nevo, R., Kaplan-Ashiri, I., Shimoni, E., Reich, Z. Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (112), e54066, doi:10.3791/54066 (2016).

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Abstract

Cryo-Rasterelektronenmikroskopie (SEM) von gefrier gebrochenen Proben ermöglicht Untersuchung biologischer Strukturen mit nahezu nativen Bedingungen. Hier beschreiben wir eine Technik zur Untersuchung der supramolekulare Organisation von photo (thylakoid) Membranen innerhalb Blattproben. Dies wird durch die Hochdruck Einfrieren von Blattgewebe erreicht, gefrier Fracturing, Double-Layer-Beschichtung und schließlich Kryo-SEM-Bildgebung. Die Verwendung der Doppelschicht-Beschichtungsverfahren ermöglicht eine hohe Vergrößerung (> 100.000 ·) Bilder mit minimaler Strahlen Schäden an den tiefgefrorenen Proben sowie minimale Aufladungseffekte zu erwerben. Mit den beschriebenen Verfahren untersuchten wir die Veränderungen in der supramolekularen Verteilung des Photosystems und lichtsammelnden Antenne Proteinkomplexe, die während der Dehydratisierung der Auferstehungspflanze Craterostigma pumilum stattfinden, in situ.

Introduction

Oxygenic Photosynthese, mit Ursprung in der alten Cyanobakterien, wurde von Algen und Landpflanzen von endosymbiontischen Ereignisse geerbt, die zur Entwicklung des Chloroplasten Organell geführt. In allen heutigen oxygenic phototrophs, photosynthetischen Elektronentransport und die Erzeugung von Protonen-Antriebskraft und Reduktionskraft innerhalb abgeflachten sackartige Bläschen genannt 'thylakoid' Membranen durchgeführt. Diese Membranen beherbergen die Proteinkomplexe, die die lichtgetriebene Reaktionen der Photosynthese durchführen und ein Medium für die Energieübertragung zur Verfügung stellen. Die Thylakoidmembran von Pflanzen und (etwas) Algen sind in zwei verschiedene morphologische Domänen unterschieden: eng anliegend Membranbereiche genannt "grana" und unstacked Membranen, die das Grana miteinander verbinden, "Stroma Lamellen" genannt 1. Verschiedene Gefrierbruch-Studien von Pflanzen- und Algen Thylakoidmembran durchgeführt wurden, in den frühen 1970er Jahren beginnen. Wenn gefrier gebrochen, Membranenaufgeteilt entlang ihrer hydrophoben Kern 2, Erzeugen einer exoplasmic Fläche (EF) und eine protoplasmatische Fläche (PF), in Abhängigkeit von der zellulären Kompartiment der die Halbmembran grenzt, wie ursprünglich von Branton geprägt et al. . 1975 3 Pflanzen- und Algen thylakoids haben vier verschiedene Bruchflächen: EFs, EFU, PFs und PFU, mit "s" und "u" bezeichnet "gestapelt" und "ungestapelt 'Membranbereiche sind. Die Membranproteinkomplexe, die nicht gespalten oder gebrochen sind, haben die Tendenz, mit entweder der E- oder P-Seite der Membran zu bleiben. Die anfänglichen Beobachtungen , die die verschiedenen Bruchflächen der Thylakoide Teilchen unterschiedlicher Größen enthalten und Dichten 4 und die zahlreichen Untersuchungen , die folgten, führte zur Identifizierung und Korrelation zwischen den beobachteten Teilchen und den Membranproteinkomplexen, die die Lichtreaktionen durchzuführen 5-13 (siehe auch Bewertungen 14,15).

freEze-Bruchversuche von Thylakoidmembran sind in der Regel auf die Vorbereitung von Chloroplasten oder isolierten Thylakoidmembran durchgeführt (siehe aber 16,17), auf die Gefahr einer inhaltlichen Änderung in strukturellen und / oder supramolekulare Organisation , die während des Isolierungsverfahrens auftreten können. Folgende Fraktur werden Repliken durch Verdampfung von Platin / Kohlenstoff (Pt / C) hergestellt, dann mit einer dicken Schicht aus Kohlenstoff (C) und schließlich Verdau des biologischen Materials 18. Replikate werden durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) sichtbar gemacht. Die traditionelle Gefrierbruch-Replikatechnik weiterhin für die Untersuchung der supramolekulare Organisation von photosynthetischen Membranen und deren Anpassung an verschiedene, z. B. Licht, Bedingungen 19-23 als wichtiges Instrument dienen.

In unserer aktuellen Studie der homoiochlorophyllous Auferstehungspflanze Craterostigma 24 pumilum wollten wir die Veränderungen in der Supramolekularen Organisation o zu untersuchenf Thylakoidmembranen sowie in Gesamtzellorganisation während der Dehydratisierung und Rehydratisierung. Die Einzigartigkeit der homoiochlorophyllous Auferstehung Spezies ist, dass sie in der Lage sind die Bedingungen des Austrocknens, um zu überleben in ihren vegetativen Geweben (Blätter), während ihre Photosyntheseapparat zu halten. Sobald Wasser zur Verfügung steht, stellen sich diese Pflanzen und photosynthetische Aktivität wieder aufzunehmen innerhalb von Stunden bis wenigen Tagen 25. Für diese Studie cryo-scanning EM (SEM) Abbilden von gefrier frakturiert Blattproben wurde in Verbindung mit Hochdruck-Gefrieren für Probe Kryo-Immobilisierung. Diese Verfahren stellen ein Mittel zur Visualisierung tiefgefrorenen biologischen Proben in einem Zustand nahe ihrem nativen Zustand 26. Ein wesentlicher Vorteil ist, dass die Proben untersucht werden direkt nach dem Gefrierbruch und Beschichtung ohne aufeinanderfolgenden Schritten. Dies ist besonders relevant für die Untersuchung der Pflanzen bei unterschiedlichen relativen Wassergehalt (RWC), deren Hydratationszustand während der Herstellung beibehalten wird. Wieje ist ein entscheidender Nachteil, dass gefrorene hydratisierte Proben von Strahlenschäden während der Bebilderung kann leiden, insbesondere wenn sie bei hohen Vergrßerungen abgetastet, um eine genaue Messung der Grße der photo Komplexen erforderlich. Um dies zu überwinden, wird ein Verfahren 'Double-Layer - Beschichtung "(DLC) 27,28 kombiniert mit spezifischen Kryo-SEM - Bildgebung Bedingungen wurden verwendet genannt. Diese in Proben ergab , dass deutlich weniger Strahlenempfindlich sind und für die Aufklärung von wertvollen Informationen über die photosynthetische Protein supramolekulare Organisation und andere zelluläre Bestandteile der Auferstehungspflanze erlaubt C. pumilum bei hohen Vergrößerungen in situ.

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Protocol

1. Cryo-Fixierung von Blattgewebe durch Hochdruck-Freezing

Hinweis: In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie Hochdruck Einfrieren von Blattgewebe durchzuführen für eine Gefrierbruch-Experiment. Für Überlegungen zu Pflanzenproben zu sehen im Zusammenhang mit 29. Dies kann für andere Arten von Geweben oder Proben mit einigen Änderungen angepasst werden.

  1. Verwendung der Ecke einer Rasierklinge, kratzen die Unterseite des 0,1 mm Hohlraum einer 0,1 / 0,2 mm Aluminiumplättchen (Abbildung 1). Bereiten Sie mindestens ein Dutzend Plättchen (6 Proben). Seien Sie vorsichtig, nicht Messer Markierungen auf dem Umfang der Scheibe zu schaffen.
    1. Nach Kratzen, waschen Scheiben in absolutem Ethanol, trocknen lassen und in einer sauberen Schüssel halten.
  2. Bereiten Sie die Hochdruckgefriermaschine nach den Anweisungen des Herstellers. Füllen Sie den Hochdruckgefrier Alkohol Kammer der Maschine mit Isopropanol.
  3. Bereiten Sie eine hausgemachte vakuumunterstützten infiltration Gerät Gas in das Blattgewebe ein mit Flüssigkeit gefunden zu ersetzen.
    1. Fest verbinden, um das Ende einer 10 ml Spritze mit einer 200 & mgr; l-Pipettenspitze. Cut off ~ 1 cm von der Spitze. Machen Sie ein Loch in der Kappe von einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu dicht die Schnitt Spitze passen. Vakuum kann im Inneren des Rohrs erzeugt werden, indem der Kolben der Spritze gezogen wird.
  4. Schneiden Sie ein kleines Stück Blatt von der Pflanze mit einer Rasierklinge und mit einer Pinzette legen Sie das Blatt in einem Mikrozentrifugenröhrchen zur Hälfte gefüllt mit 1-Hexadecen. Infiltrieren Sie die Interzellularräume des Blattes mit der Flüssigkeit durch den Kolben vorsichtig ziehen Vakuum zu erzeugen, halten Sie für etwa 30 Sekunden, und lassen Sie dann den Kolben langsam.
  5. Entfernen Sie die Blattstück aus dem Rohr mit einer Pinzette. Schneiden Sie das Blatt mit einer Rasierklinge in Fall dicker als 0,2 mm ist und schneiden Sie ein kleines Stück, das in ein Plättchen passen.
  6. Ein sauberes Plättchen mit der geritzten Seite nach oben in die Halterung des Gefriermaschine und legen Sie dann das abgeschnittene Stück von leaf in den plättchen. Füllen Sie den verbleibenden Platz für das Blatt mit 1-Hexadecen umgibt. Schließen Sie das Sandwich ein weiteres Plättchen mit, mit den Kratzern das Blatt gegenüber.
  7. Schließen und den Halter festziehen und setzen Sie sie in die Kammer der Maschine. Drücken Sie dann die 'Jet' Taste zum Einfrieren (~ 2.100 Bars für 300 bis 500 ms), und schnell den Halter in flüssigem Stickstoff übertragen. Entfernen Sie vorsichtig die gefrorene Sandwich aus der Halterung mit vorgekühlten Pinzette, dabei nicht das Sandwich zu brechen.
    Hinweis: Geschlossen gefrorene Sandwiches sofort gebrochen Einfrieren sein kann oder in flüssigem Stickstoff für den späteren Gebrauch aufbewahrt. Verwenden Sie Schutzkleidung und Augen wenn Umgang mit flüssigem Stickstoff.

2. Gefrierbruch und Double-Layer - Beschichtung 27,28

  1. Bereiten Sie die Gefrierbruchmaschine zur Verwendung, einschließlich der beiden Pistolen für die Verdampfung von Platin / Kohlenstoff (Pt / C) und Kohlenstoff, nach den Anweisungen des Herstellers. Legen Sie die Pt / C-Pistole bei 45 Grad einnd die Kohlenstoffpistole bei 90 Grad.
    1. Vorprogrammieren ein Beschichtungsschema eines 2-nm-Schicht von Pt / C (Beschichtungsgeschwindigkeit von 0,02 bis 0,04 nm / sec) und einer 6-nm-Schicht aus Kohlenstoff (bei ~ 0,1 nm / sec).
      1. Geben Sie das Setup auf der Gefrierbruch-Maschine auf den Bildschirm. Wählen Sie eine Benutzernummer, wo das Beschichtungssystem gespeichert werden.
      2. Wählen Sie Pt / C für "Layer 1". Wählen Sie einen Zeitrahmen, z. B. 5 min (zu überschreiten , die notwendige Zeit benötigt , um die Beschichtung zu vervollständigen). Verwenden Sie die Auf-Ab-Pfeile, um eine Dicke von 2 nm zu definieren.
      3. Drücken Sie die "Ebene", um sich zu bewegen 2. Wiederholen Sie Schritt 2.1.1.2, mit der Ausnahme wählen Kohlenstoff-Schicht und einer Dicke von 6 nm definieren.
    2. Testen und Pistolenbetrieb einzustellen.
      1. Wählen Sie "Layer 1". Wählen Sie die Pt / C-Waffe durch Drücken der 'gun1' Taste und drücken Sie die "ON" Taste auf der Verdampfungssteuereinheit der Gefrierbruch-Maschine. Überwachen Sie die Verdampfungsrate und eine Einstellung mit der Spannung und Emissions Knöpfe until Erreichen einer Geschwindigkeit von 0,02-0,04 nm / s. Drücken Sie "OFF", um den Pt / C-Pistole ab.
      2. Wählen Sie "Layer 2". Wiederholen Sie 2.1.2.1, mit der Ausnahme, wählen Sie 'GUN2' und stellen Sie für eine Verdampfungsrate von ~ 0,1 nm / s.
  2. Kühlen Sie die Gefrierbruchsystem Stufe bis -140 ° C oder -160 ° C (für hydrierte oder dehydriert Blätter, beziehungsweise). Bringen Sie das Vakuum Kryo-Shuttleservice zur Maschine und füllen seine Kammer mit flüssigem Stickstoff. Druck in der Gefrierbruch Kammer gekühlt liegt üblicherweise zwischen 1 bis 8 x 10 -7 mbar.
  3. Legen Sie eine Gefriert Fracturing Probenhalter (geeignet für 3-mm-Plättchen) in die Ladestation. Flood die Ladestation Kammer mit flüssigem Stickstoff.
  4. Legen Sie zwei gefrorene Sandwiches auf den Halter eins nach dem anderen hochpräzisen Grad mit einer Pinzette. Ziehen Sie die erste Sandwich in den Halter und dann den Halter umdrehen um zu überprüfen, dass es sicher an seinem Platz sitzt. Wiederholen Sie dies für das zweite Sandwich.
  5. DEtach die gekühlte Shuttle von der Maschine Gefrierbruch und schließen Sie es an die Ladestation. Öffnen Sie das Wechselventil, einzuführen, um die zurückziehenden Arm in die Halterung und einrasten. Wieder einführen, den Arm mit dem Halter in das Shuttle und schließen Sie das Wechselventil die Ladestation Knopf. Bringen Sie den Shuttle-Bus zum Gefrierbruch-Maschine und stellen Sie den Halter in die Kammer mit dem eingezogenen Arm. Nehmen Sie den Shuttle-Bus von der Maschine.
  6. Richten Sie den Gefrierbruch Mikrotommessers zu einer Höhe, dass es die Top-Plättchen der Sandwiches abschlagen wird.
  7. Mit dem Mikrotom-Messer, brechen schnell die Sandwiches und dann sofort heben es auf Kontamination der Proben durch Trümmer Haften an dem Messer zu verhindern, und drehen Sie die gekühlte Blende oberhalb der neu freigelegten Ebene, die die Proben zu schützen vor einer möglichen Kontamination von Wassermolekülen in die Kammer.
  8. Bestreichen Sie die Proben mit Platin und Kohlenstoff.
    1. Geben Sie "Layer 1" auf der scReen. Schalten Sie den Pt / C-Pistole mit der Taste durch die 'ON' Taste gefolgt 'gun1' drücken. Untersuchen Sie die Verdampfungsrate und sobald es 0,02 erreicht - 0,04 nm / s, gleichzeitig die Proben aussetzen und drücken Sie die "Maßnahme", um die Dicke der abgeschiedenen Schicht zu überwachen.
      Hinweis: Waffe schaltet sich automatisch ab, wenn die Dicke des vorgewählten Wert erreicht hat.
    2. Decken Sie die Proben mit dem Verschluss, wenn Pt / C Verdampfungs abgeschlossen ist.
    3. Drücken Sie die "Ebene", um sich zu bewegen, um "Layer 2". Wiederholen Sie die Schritte 2.8.1 und 2.8.2, mit Ausnahme der Auswahl 'GUN2' (für Kohle) und eine Verdampfungsrate von ~ 0,1 nm / s.
  9. Wärmen Sie das Gefrierbruchsystem Stufe bis -120 ° C.

3. Cryo-Rasterelektronenmikroskopie

  1. Bereiten Sie das Rasterelektronenmikroskop für Kryo Arbeit.
    1. Wählen Bühne / Bühnen Initialise aus dem Hauptmenü und bestätigen.
    2. Wählen Sie Extras / GotO-Panel, und öffnen Sie das Bedienfeld "Airlock" indem Sie es aus der Liste auswählen. Klicken Sie auf 'Schließen Spalte Kammerventil' Taste. Entlüften Sie das Mikroskop Kammer durch die Vent-Taste unter dem "Vacuum" Registerkarte klicken.
    3. Wählen Sie Extras / Goto-Panel und öffnen Sie die "Stage-Punkte-Liste 'Panel. Wählen Sie die Kryo-Austauschposition die Bühne auf die richtigen Koordinaten für die Annahme des Probenhalters zu bewegen. Anmerkung: Die "Kryo-Wechselposition 'voreingestellt ist mit der Position der Vakuumtransfereinheit in Ausrichtung zu sein.
    4. Öffnen Sie die Probenkammer mit einem sauberen Paar Handschuhe und legen Sie die Kryo-Bühne auf der Hauptbühne des Mikroskops. Schließen Sie die Kammer und klicken Sie auf die Pump-Taste unter dem "Vakuum-Registerkarte".
    5. Kühlen Sie das Mikroskop auf -120 ° C. Füllen Sie das Mikroskop Dewar mit flüssigem Stickstoff. Aktivieren Sie die Wärme-Funktion auf der Kryo-Übertragungssteuereinheit bis -120 ° C, wenn die Temperatur der Bühne unter -120 ° C sinkt.
  2. Attach der Kryo-Transfer-Shuttle zum Mikroskop und übertragen den Probenhalter der einfahrenden Arm in das Mikroskop Kryo Bühne mit (wie in Schritt 2.5). Nehmen Sie den Shuttle vom Mikroskop.
  3. Klicken Sie auf das 'Open Spalte Kammerventil' Taste in der Airlock-Panel.
  4. Bewegen Sie vorsichtig den Probenhalter nahe der Objektivlinse (Arbeitsabstand von 1 bis 2 mm) mit dem Joystick. Wählen Sie eine 10-um-Öffnung in der 'Apertures' Tab. Doppelklicken Sie auf das EHT-Feld in der Registerkarte 'Gun'. Geben Sie 10 (kV) für das EHT Ziel und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf die untere EHT Registerkarte und wählen Sie "EHT On '.
  5. Wählen Sie 'InLens' von den Detektoren der Dropdown-Liste in der Registerkarte "Detektoren". Optimieren Sie Abbildungsbedingungen (Fokus, Helligkeit und Kontrast, Strahlausrichtung, Astigmatismus) als angemessen.
  6. Klicken Sie auf die Registerkarte "Scannen". Wählen Sie einen schnellen Scan ( "Scan-Geschwindigkeit = 1 ', zu einer Verweilzeit von 100 ns pro Pixel entspricht) Strahlenschäden zu minimieren unda 'Shop Auflösung "von 1.024 x 768 Pixel. Wählen Sie 'Line Avg' in der 'Noise Reduction "Drop-Down-Liste. Passen Sie den Wert von N 20 - 30 Zeilen für die Suche. Bewegen Sie die Probe des "Centre Point" Funktion (durch Drücken von Strg-Tab auf der Tastatur) für Regionen mit gebrochenen Zellen und Chloroplasten (2A und 2B) zu suchen.
  7. Erwerben Sie Bilder von gebrochenen Chloroplasten bei niedrigen Vergrößerungen (50-70 kX) (2C und 2D). Verwenden Sie die Zentrale Funktion "Funktion (durch Drücken von Strg-Umschalt-Tab auf der Tastatur) in interessante Chloroplasten Bruchflächen zu vergrößern und Bilder aufzunehmen , bei hohen Vergrößerungen (100-200 kX, 3 und 4). Verwenden Sie die gleichen Parameter wie in Schritt 3.6 für die Bildaufnahme, sondern ändern Sie die Zeile Avg Wert N> 100 zur Geräuschreduzierung 30.
    1. Drücken Sie Freeze auf dem Hauptmikroskop Steuereinheit oder in der Registerkarte 'Scannen' das Scannen zu stoppen und speicherndas Bild durch die 'Save TIFF' Taste drücken.

4. Bildanalyse

Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt ein kurzes Verfahren zur Segmentierung von Membranpartikeln aus der Gefrierbruch - REM - Aufnahmen der 31 Fidschi mit Open-Source - Paket. Ähnliche Ergebnisse können mit anderen Bildanalyse-Software erhalten werden.

  1. Bild öffnen mit Fidschi durch Image-Datei in das Hauptprogrammfenster ziehen. Wandeln Sie das Bild in 8-Bit durch die Auswahl Bild / Typ / 8-Bit. Wählen Sie Bild / Anpassen / Helligkeit / Kontrast und ggf. einstellen (5A).
  2. Die gerade Linie Werkzeug verwenden und eine Linie durch die Größe der eingebetteten Bildmaßstabsleiste ziehen. Analysieren Sie Select / Set-Skala. Geben Sie den richtigen Maßstab Informationen (bekannten Abstand und Längeneinheit) und klicken Sie auf OK. Speichern Sie diese angepasst skalierte Bild.
  3. Wählen Sie Prozess / Filter / Gaußsche Unschärfe (1,5 nm Radius) und klicken Sie auf OK (Abbildung 5B).
  4. Wählen Sie Bild / Anpassen / Auto Lokale Threshold (unter Verwendung des Niblack - Methode) und klicken Sie auf OK (Abbildung 5C).
  5. Wählen Sie Bearbeiten / Umkehren und dann Prozess / Binär / Watershed (5D).
  6. Zeichnen Sie einen Rahmen um den Bereich von Interesse (ROI) mit dem Freihandauswahlwerkzeug. Fügen Sie die Auswahl in die ROI-Manager, indem Sie Bearbeiten / Auswahl / In den Manager oder durch Klicken auf 'T'.
  7. Wählen Sie Bearbeiten / Löschen Outside (5E).
  8. Analysieren Sie Select / Set Messungen, wählen Sie die entsprechenden Parameter (zB Bereich, fit Ellipse).
  9. Analysieren Auswahl / Analysieren Partikel. Geben Sie einen geeigneten Bereich für die Größe der Partikel und markieren 'Ergebnisse anzeigen', 'In den Managers und, falls erforderlich, die "Ausschließen auf Kanten', und klicken Sie auf OK. Das Ergebnis ist in Figur 5F gezeigt.
  10. Öffnen Sie die gespeicherte skaliert abgebildete Datei (Schritt 4.2). Wählen Sie "Alle einblenden" und deaktivieren Sie "Labels" im ROI-Manager. Überprüfen Sie die ausgewählten particles legte auf das Originalbild und manuell hinzufügen oder eine Auswahl zu entfernen, indem Sie die "Hinzufügen" oder "Löschen" Tasten des ROI-Manager. Korrigieren Sie alle Auswahlen erforderlich durch das Freihandauswahlwerkzeug und die "Aktualisieren" Taste des ROI Manager (Figuren 5G und 5H) verwendet wird .
  11. Analysieren Sie die Daten, die die erhaltenen Messungen verwendet wird. Im Ergebnisfenster, klicken Sie auf Ergebnisse / Summarize zu erhalten, zum Beispiel die mittlere Fläche und mittlere Haupt- und Nebenachsen der Teilchen in dem ROI-Manager aufgelistet. Klicken Sie auf Ergebnisse / Vertrieb, wählen Sie einen Parameter (wie Area) und klicken Sie auf OK, um ein Histogramm für diesen Parameter anzuzeigen.

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt Kryo-REM - Aufnahmen von Blutplättchen Hochdruck eingefroren, gefrier gebrochen Craterostigma pumilum Blattstücke enthält. In einigen Proben sind große Regionen von gebrochenen Zellen erhalten (1A). In anderen, bleibt das Blattstück fest an der oberen Scheibe gebunden und zusammen mit ihm (1B) abgeschlagen. Aber auch im zweiten Fall können einige Blattgewebe zum Messer Rillen auf dem Plättchen (1B, Pfeilspitzen) und eine angemessene Menge von Daten kann immer noch durch Abbilden des leaf "Reste" gesammelt werden , befestigt bleiben, wenn sie gebrochen waren. Nach erfolgreicher Fraktur gefunden wird, werden geringer Vergrößerung Bilder von Zellen erworben interessierenden Bereiche zu identifizieren, in diesem Fall Chloroplasten (Abbildung 2).

Höhere Vergrößerung Bilder von Thylakoidmembran in C. pumilum Blätter werden in den 3 und 4. Die vier verschiedenen Bruchflächen, EFs, EFU, PFs und PFU dargestellt, kann (Figur 3) zu unterscheiden. Photosystem II (PSII), die größte Proteinkomplex in den Membranen gefunden ist, befindet sich in den beiden EFs (Grana) und EFU (Stroma Lamellen). Bei hydratisierten Bedingungen PSII Dichte ~ 3 - mal höher als in EFs in EFU (~ 1,550 & mgr; m - Komplexe -2 vs. ~ 550 & mgr; m - Komplexe -2, 3). Dies ist einer Basis zwischen diesen zwei kontinuierlichen Flächen zum Differenzieren. Ein weiterer Grund ist der Unterschied in den Hintergrund. Während die EFs Hintergrund glatt erscheint, ist die EFU Gesicht rauh und enthält Löcher , die die Spuren von frei stehenden PSI - Komplexe sind, die Fraktur an die komplementäre Fläche, die 10 PFU (Abbildung 3). Ein Beispiel für die Segmentierung von PSII Komplexe von der EFs Fläche der Thylakoidmembran ist in 5 gezeigt.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> während der Dehydratisierung von C. pumilum, die Dichte von PSII in den Grana Membranen (EFs) allmählich ab, etwa die Hälfte erreicht (~ 700 um Komplexe -2 bei ~ 15 % RWC, 4C) von der Dichte bei hydratisierten Bedingungen (100% RWC, 4A) Bemerkenswert ist , bei einer weiteren Austrocknung, zu . 5 - 10% RWC, PSII Komplexe in Zeilen und Arrays organisieren (Pfeile, Figuren 4D und 4E). für kompletten Datensatz finden 24. die Bildung eines solchen PSII - Arrays erfordert , dass einige ihrer gebundenen Antennenkomplexe, LHCII, von PSII lösen. Ein Beispiel für eine LHCII Komplexe in Reihen in den PFs organisiert, die auf organisierten PSII Komplexe ergänzen würde (in den EFs ) ist in Abbildung 4E (Pfeilspitze). PSII - Komplexe in den Arrays sowie das freistehende LHCII, sind wahrscheinlich zu sein , in einem photochemisch abgeschreckten Zustand, dazu dient , eine Foto-schützende Rolle. Diese strukturellen Neuordnungen gezeigt sind Teil der von der Auferstehungspflanze genutzt Mechanismen C. pumilum sich 24 im dehydrierten Zustand zu schützen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Niedrige Vergrößerung Cryo-REM - Aufnahmen von Thrombozyten mit Gefrier gebrochen C. pumilum Blattstücke. (A) einen großen Bereich von gebrochenen Zellen (gestrichelte Kontur) eines C. pumilum Blatt. (B) Die Blattstück wurde mit dem oberen Plättchen, aber einige Blattgewebe blieb an den Messermarkierungen am unteren Plättchen (Pfeilspitzen markieren einige davon) abgeschlagen. Die Regionen, die die Blattstücke umgeben, werden 1-Hexadecen (Sternchen) eingefroren. Maßstabsbalken:. 200 & mgr; m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 2
Abbildung 2. Zooming in Chloroplasten. (A) Eine Gruppe von gebrochenen photo (Mesophyll) Zellen (Sternchen) aus hydriertem Blattgewebe. Der größte Teil des Zellvolumens aus einer großen zentralen Vakuole enthalten, wobei alle cytoplasmatischen Bestandteile der Vakuole in einem schmalen Streifen umgibt. (B) Zwei benachbarte gebrochenen Zellen - die Zellwand (cw) markiert die Grenze zwischen den Zellen. Fünf Chloroplasten (c) sind offensichtlich in dem Bild, von denen nur eines gebrochen worden ist (gebrochene Ebene, die durch die Pfeilspitze markiert). (C und D) Beispiele für einzelne gebrochene Chloroplasten aus hydrierten (C) und dehydriert (D, ~ 15% relativer Wassergehalt [RWC]) Pflanzen. Die kleinen weißen Punkten (zB Pfeilspitzen) sind die Membranproteinkomplexen in den Thylakoidmembranen des Chloroplasten gefunden. Man beachte die massiven Vesikulation surrgründung die Chloroplasten in dem entwässerten Blatt (D) gefunden. Maßstabsbalken: 10 & mgr; m (A); 1 um (B); 200 nm (C und D). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Die supramolekulare Organisation Thylakoidmembran in pflanzlichen Geweben Ein gebrochener Chloroplasten , in denen die verschiedenen thylakoid Bruchflächen zu sehen sind:. Die exoplasmic Bruchflächen (EF) der beiden gestapelten (EFS) und unstacked (EFU) Membranbereiche enthalten Photosystem II (PSII) Komplexe; Die protoplasmic Bruchfläche von gestapelten Regionen (PFS) enthält die peripheren lichtsammelnden Antennenkomplexe von PSII, LHCII; Photosystem I (PSI) und die ATP-Synthase Bruch der protoplasmic Bruchfläche von unstacked Regionen (PFU); Cytochrome b 6 f Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Änderungen in Photosystem II Organisation bei Dehydration von C. pumilum EFs Gesichter der Thylakoidmembran von Pflanzen in unterschiedlichen RWC: (A) 100%, (B) ~ 40%, (C) ~ 15% und (D und E) von 5 bis 10%.. Während Austrocknung, das Gesicht ist die Dichte von PSII in den EFs allmählich von ~ 1500 Komplexe um -2 (A) bis ~ 700 Komplexe um -2 (~ 15% RWC, C). Insbesondere bei trockeneren Bedingungen (von 5 bis 10% RWC), einige PSII Komplexe organisieren in Zeilen und Arrays (D und E, Pfeile). Die Pfeilspitze (E) markiert den PFs Gesicht, mit LHCII Antenne erscheinen auch in Reihen organisiert werden, zwischen denen PSII Reihen würde in den komplementären EFs gefunden werden. Zusätzliche Informationen finden Sie auf dieser Daten 24. Maßstabsbalken:. 100 nm Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Ein Beispiel für die Segmentierung von Photosystem II Partikel. Mit der Fidschi Open-Source - Paket, Protein - Komplexe können aus den Bildern mit wenigen Schritten segmentiert werden (vollständige Einzelheiten des Verfahrens teilweise gefunden 4 des Protokolls Abschnitt). Bilder (A, Originalbild) mit dem Gauß - Filter (B) verschwommen; das Bild wird Schwellwertbildung eine automatische lokale th mitreshold Werkzeug (C); das Bild invertiert und der Wendepunkt- Algorithmus , um separate Objekte in engem Kontakt (D) gefunden angewandt; ein interessierender Bereich ausgewählt ist und die Außenseite wird gelöscht (E); Partikel (innerhalb einer benutzerdefinierten Größenbereich) werden unter Verwendung des Teilchenanalysators Funktion ausgewählt. Die sich ergebende Maske ist in (F) gezeigt ist . Die Partikel werden in die ROI - Manager hinzugefügt und auf das Originalbild überlagert (G) für Fehler oder fehlerhafte oder verpassten Partikel zu überprüfen. Die Liste der ROIs kann manuell bearbeitet werden, ersetzen, Löschen oder Hinzufügen von neuen ROIs, als angemessen. Die endgültige Benutzer bearbeitet Auswahl wird in (H) gezeigt. Maßstabsbalken:. 200 nm Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Die Technik in diesem Papier beschrieben ermöglicht Untersuchung von gefrier frakturiert Membranen im Zusammenhang mit gut erhaltenen Hochdruck eingefroren Pflanzengewebe durch Kryo-Rasterelektronenmikroskopie. Der große Vorteil dieser Verfahren zu verwenden, ist, dass die Probenvorbereitung rein physikalisch ist; keine Stufen Chemikalien oder Dehydrierung sind beteiligt notwendig. Somit ermöglicht es 26,32 biologische Strukturen in einer nahezu nativen Zustand zu studieren. Der Vorteil von Blattgeweben besteht darin , dass eine Informationen über die gesamte zelluläre Organisation erhalten sowie prüfungsspezifischen Membranen, wie die Thylakoidmembranen innerhalb ihrer nativen physiologischen Kontext, dh innerhalb des Chloroplasten. Ein weiterer Vorteil, zwingend notwendig , um C. Studium pumilum Pflanzen bei unterschiedlichen relativen Wassergehalt (RWC), ist , dass ihre Hydratationszustandes nicht während der Herstellung verändert wird. Dies ist im Gegensatz zu isolierten Chloroplasten unter Verwendung oder Thylakoidmembranen als Ausgangsmaterialfür ein Gefrierbruch-Experiment. Bei letzterem hat man auch zu berücksichtigen, dass einige strukturelle und / oder supramolekularen Veränderungen stattfinden wahrscheinlich während Organell / Membrantrennung.

Arbeiten mit Pflanzengewebeproben, die relativ dick sind [> 50 bis 100 & mgr; m, und kann wesentlich dicker sein, abhängig von der Art des Gewebes und Arten], diktiert die Verwendung von Hochdruck-Gefrieren (HPF) zur Proben Vitrifikation. Anwendung von hohem Druck [2,100 bar], bei dem die Schmelztemperatur von Wasser ist etwa -22 ° C, wirkt sich auf die Wasserstoffbindungsnetzwerk des Wassers, so dass es verlangsamt die Rate der Bildung von Eiskristallen nach unten. Daher ist die Wahrscheinlichkeit eines vitrified Probe erhalten hoch, selbst bei relativ langsamen Abkühlraten. HPF ist derzeit der einzige verfügbare Methode für die Vitrifikation von dicken, aber nicht mehr als 200 & mgr; m, Proben. Ein entscheidender Schritt für HPF von Pflanzengeweben ist Infiltration ihrer interzellulären Lufträume mit einem inerten4;. Raumfüller "vor dem Gefrieren, Gewebe Zusammenbruch unter dem hohen Druck (siehe Bewertungen 29,33) Im Fall von C. pumilum Blätter, deren Dicke bis zu 1 mm betragen, die Blätter müssen auch getrimmt zu verhindern oder vor dem HPF verdünnt.

Im Wesentlichen kann die Technik der Zubereitung replica 18 auch gefrier gebrochene Blattgewebe aufgetragen werden. Doch in unserer Erfahrung wurde eine ausreichende Ausbeute an intakten gebrochenen Bereiche, die nicht erhalten, da Repliken oft in kleine Stücke zersplittern. Außerdem wird für eine bestimmte Region von Interesse Suche wie Chloroplasten innerhalb fragmentierten Repliken von Pflanzengeweben unpraktisch. Dies liegt hauptsächlich daran Mesophyll (photo) Zellen eines großen zentralen Vakuole durch einen schmalen Cytoplasma - Streifen (2A) umgeben bestehen, die den Kern enthält, Chloroplasten und alle anderen Organellen. Somit stellen Chloroplasten nur einen sehr kleinen Bruchteil der Gesamtbruchfläche vonMesophyll Gewebe. Cryo-REM-Aufnahmen von gefrier gebrochenen Proben bietet eine Lösung für dieses Problem, da Proben direkt visualisiert werden folgende Bruch (und Beschichtung / Shadowing). Jedoch leidet dieses Verfahren unter der Einschränkung, dass gefrorenen hydratisierten Proben Strahlempfindlich und somit Abtastung bei hohen Vergrßerungen leicht beschädigt die Probe auf dem ersten Scan. Double-Layer - Beschichtung (DLC) 27,28 bietet eine Lösung für diese schwerwiegenden Nachteil.

Im DLC sind gebrochenen Proben in einer Weise beschichtet ähnlich, wie sie sind für Replik Vorbereitung. Zuerst wird eine dünne Schicht (1 - 3 nm) von Pt / C wird auf die Probe eingedampft, der Kontrast und die Leitfähigkeit bereitstellt. Dies wird durch eine dickere gefolgt (von 5 bis 10 nm), Schutzschicht aus Kohlenstoff. DLC mit einer hohen Beschleunigungsspannung kombiniert (10 kV) wurde auf Bildproben unter Verwendung des Rückstreuelektronen (BSE) Signal 28 verwendet. Die BSE-Signal, aus der Platinschicht Ursprung ermöglicht Oberflächeninformationen durch den Kohlenstoff zu erhaltenund gegebenenfalls Wasserdampf Verunreinigungsschicht, die praktisch transparent für die BSE bei hohen Beschleunigungsspannungen liegen (Wasserkontamination reichert sich in Experimenten, bei denen ein Vakuum-Kryo-Übertragungseinheit nicht verwendet wird, und die Bruchfläche ist der Atmosphäre ausgesetzt, auch wenn das ist für einen Bruchteil einer Sekunde). Zusätzlich Abbilden des BSE - Signal minimiert das Problem der Aufladungseffekte verwendet , die in Sekundärelektronen (SE) Detektions 27 ersichtlich sind. Mit dem Mikroskopaufbau hier beschriebenen Abbildungs ​​des SE-Signals mit dem In-lens SE-Detektor bei 10 kV ergab Informationen äquivalent zu derjenigen erhalten werden, wenn Proben wurden ausschließlich mit 2 beschichtet - 3 nm von Pt / C und abgebildet bei niedrigen Beschleunigungsspannungen. Der Unterschied besteht darin, dass Proben von DLC hergestellt und abgebildet als deutlich weniger strahlenempfindlichen beschrieben wurden. Dies ermöglichte es uns, sie bei hohen Vergrößerungen zu scannen und in vielen Fällen sogar mehrmals, und erlaubt wertvolle Informationen über photo Protein supramolecul zu erhaltenar Organisation und andere Zellbestandteile (Abbildungen 2 bis 4) 24.

Schließlich können die hier beschriebenen Verfahren können modifiziert werden, um die Struktur und / oder Membranprotein Organisation in anderen Arten von Proben zu untersuchen. Wir haben erfolgreich die Technik zu studieren die supramolekulare Organisation von photosynthetischen Membranen in Cyanobakterien und Algenzellen (Shperberg-Avni et al. Nicht veröffentlichte Daten) eingesetzt. Das wichtigste Kriterium ist das Finden der Balance zwischen so dünn, um eine Probe wie möglich ist, um die Chance für die Vitrifikation zu erhöhen, während Probe Intakt zu halten. Für verschiedene Arten von Proben, die Suspensionen oder tierischen / pflanzlichen Geweben sein kann, sollten verschiedene Verpackungen verwendet werden (beispielsweise in Bezug auf die Art der Blutplättchen für Hochdruck - Gefrieren verwendet wird ). Nach erfolgreicher Kryo-Immobilisierung erreicht wird, liefert die Kombination von Gefrierbruch, DLC und Kryo-SEM-Bildgebung ein ausgezeichnetes Mittel für infor zu erhaltenmationen über Membranprotein Organisation bei hoher Vergrößerung mit minimaler Strahlenschäden.

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Acknowledgements

Wir danken Andres Kaech (Universität Zürich) für seine hilfreiche Ratschläge auf Rasterelektronenmikroskopie Bildgebung. Diese Arbeit wurde von den Vereinigten Staaten und Israel Binationale landwirtschaftliche Forschung und Entwicklung Fonds unterstützt (Förder-Nr. US-4334-10, ZR), der Israel Science Foundation (Grant Nr. 1034/12, ZR) und der Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013 ZR). Die Elektronenmikroskopie-Studien wurden an der Irving und Cherna Moskowitz Center for Nano und Bio-Nano-Imaging am Weizmann Institute of Science durchgeführt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol abs Bio-Lab 052505
Isopropanol Bio-Lab 162605
1-hexadecene Sigma-Aldrich H7009
0.1/0.2 Platelets Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland 241 Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems.
High-precision-grade tweezers Electron Microscopy Sciences 72706-01 Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers.
High-pressure freezing machine Bal-Tec HPM 010 High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.
Freeze-fracture system Leica Microsystems EM BAF 060
Cryo preparation loading stage Leica Microsystems 16770228
Specimen holder for univeral freeze fracturing Leica Microsystems 16LZ04746VN Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm
Vacuum cryo-transfer shuttle Leica Microsystems EM VCT 100
Scanning electron microscope Zeiss Ultra 055
Cryo SEM stage Leica Microsystems 16770299905
Image acquisiton software SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH
Image analysis software Fiji/Image J, National Institute of Health http://fiji.sc/Fiji

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References

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