Studerer Supramolecular Organisering av foto Membraner innen Freeze frakturerte Leaf Vev av Cryo-scanning elektronmikroskopi

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Charuvi, D., Nevo, R., Kaplan-Ashiri, I., Shimoni, E., Reich, Z. Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (112), e54066, doi:10.3791/54066 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cryo-scanning elektronmikroskopi (SEM) av fryse oppsprukket prøvene tillater undersøkelse av biologiske strukturer i nærheten innfødte forhold. Her beskriver vi en teknikk for å studere supra organiseringen av foto (thylakoid) membraner innen blad prøver. Dette oppnås ved høytrykks-frysing av blad vev, fryse-frakturering, tolags belegg og til slutt Cryo-SEM avbildning. Bruk av dobbel-layer coating metoden gjør det mulig å skaffe høy forstørrelse (> 100,000X) bilder med minimal bjelke skade på frosne hydrert prøver samt minimale lading effekter. Ved hjelp av de beskrevne prosedyrer vi undersøkt endringer i supra distribusjon av photosystem og lys for innhøsting antenne protein komplekser som finner sted i løpet av dehydrering av oppstandelsen anlegget Craterostigma pumilum, in situ.

Introduction

Oxygenic fotosyntese, med opprinnelse i det gamle cyanobakterier, ble arvet av alger og landplanter ved endosymbiotic hendelsene som førte til utviklingen av kloroplast organeller. I alle dagens oxygenic fotoautotrofi, er fotoelektrontransport og generering av proton-drivkraft og redusere strøm utføres innenfor flate sekklignende vesikler betegnes 'thylakoid' membraner. Disse membranene huse protein komplekser som utfører lys-drevet reaksjoner av fotosyntese og gir et medium for energioverføring. De thylakoid membraner av planter og (noen) alger er differensiert i to forskjellige morfologiske domener: tett appressed membran regioner kalles "grana" og stablede membraner som interconnect den grana, kalt 'stroma lameller' en. Ulike frysebrudd studier av anlegg og alge thylakoid membraner er gjennomført, starter i begynnelsen av 1970-tallet. Når fryse brukket, membranerdelt langs deres hydrofobe kjerne 2, genererer en exoplasmic flate (EF) og en protoplasmiske flate (PF), avhengig av cellerommet som de halv membran grenser, som opprinnelig skapt av Branton et al. . i 1975 tre Plant og alge thylakoids har fire forskjellige frakturflatene: EFS EFU, PFS og PFU, med "s" og "U" betegner "stablet" og "unstacked 'membran regioner, henholdsvis. Membranproteinkomplekser, som ikke er delt eller brutt, har tendens til å forbli med enten E eller P-siden av membranen. De første observasjonene at de ulike bruddflatene på thylakoids inneholder partikler av ulik størrelse og tetthet 4, og de ​​mange undersøkelsene som fulgte, førte til identifisering og sammenheng mellom de observerte partikler og membran protein komplekser som utfører lyset reaksjoner 5-13 (se også vurderinger 14,15).

freEze-brudd eksperimenter thylakoid membraner er vanligvis utføres på preparater av kloroplaster eller isolerte thylakoid membraner (men se 16,17), med fare for noen endring i strukturelle og / eller supra organisasjon som kan oppstå under isoleringsprosedyren. Etter brudd, blir kopier fremstilles ved fordampning av platina / karbon (Pt / C), og deretter med et tykt lag av karbon (C), og endelig spaltning av det biologiske materiale 18. Kopier er visualisert ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Den tradisjonelle fryse-fraktur-replika teknikk fortsetter å tjene som et viktig verktøy for å studere supra organiseringen av foto membraner og deres tilpasning til annen, f.eks., Lys, forholdene 19-23.

I vår siste undersøkelse av homoiochlorophyllous oppstandelse anlegget Craterostigma pumilum 24, rettet vi å undersøke endringer i supra organisasjon of thylakoid membraner, så vel som i total cellulær organisasjon, under dehydrering og rehydrering. Det unike med homoiochlorophyllous oppstandelse arter er at de er i stand til å overleve forholdene i uttørking i deres vegetative vev (blader), og samtidig beholde sin fotoapparat. Når vann er tilgjengelig, disse plantene gjenvinne og gjenoppta fotosynteseaktiviteten i løpet av timer til et par dager 25. For denne studien, ble cryo-skanning EM (SEM) avbildning av fryse brukket blad prøver kombinert med høyt trykk frysing for prøve kryo-immobilisering. Disse prosedyrene gi et middel til å visualisere frossen hydrert biologiske prøver på en stat nær sin opprinnelige tilstand 26. En hoved fordel er at prøver er undersøkt direkte etter fryse brudd og belegg uten suksessive trinn. Dette er spesielt relevant for etterforskningen av planter på ulike relative vanninnhold (RWC), som deres hydrering tilstand opprettholdes under forberedelse. Hvordannoensinne, er en viktig ulempe at frosne hydrert prøver kan lide av bjelken skade under bildebehandling, spesielt når de skannes ved høy forstørrelse, som kreves for nøyaktig måling av størrelsen av foto komplekser. For å overvinne dette, en metode som kalles "double-layer coating" (DLC) 27,28 kombinert med spesifikke cryo-SEM bildeforhold ble utnyttet. Disse resulterte i prøver som er betydelig mindre strålefølsomme og lov for belysning av verdifull informasjon om foto protein supra organisasjon og andre cellulære bestanddeler av oppstandelsen anlegget C. pumilum ved høye forstørrelser i situ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cryo-fiksering av Leaf vev ved Høytrykksfryse

Merk: Denne delen beskriver hvordan du utfører høytrykks frysing av blad vev for en fryse-fraktur eksperiment. For vurderinger knyttet til planteprøver se 29. Dette kan tilpasses for andre typer av vev eller prøver med noen modifikasjoner.

  1. Ved hjelp av hjørnet av et barberblad, skraper bunnen av 0,1 mm hulrom av en 0,1 / 0,2 mm aluminiumsplate (figur 1). Forbered minst et dusin plater (6 prøver). Ta forsiktighet for ikke å skape kniv merkene på omkretsen av platen.
    1. Etter å skrape, vaske plater i absolutt etanol, la dem tørke og holde en ren tallerken.
  2. Forbered høytrykks frysing maskin i henhold til produsentens instruksjoner. Fyll høytrykksfryse maskinens alkohol kammer med isopropanol.
  3. Forbered en hjemmelaget vakuum-assistert infiltration anordning for å erstatte gassen som finnes i bladvevet med væske.
    1. Tett koble en 200 ul pipette til enden av en 10 ml sprøyte. Skjær av ~ 1 cm av spissen. Lag et hull i lokket av en 1,5 ml mikrosentrifugerør til tett passe kuttet spissen. Vakuum kan opprettes på innsiden av røret ved å trekke stempelet av sprøyten.
  4. Skjære et lite stykke av blad fra planten ved hjelp av et barberblad og med pinsett plassere bladet inne i et mikrosentrifugerør halvfylt med 1-heksadecen. Infiltrere inter områder av bladet med væsken ved å dra forsiktig i stempelet for å skape vakuum, hold i ca 30 sekunder, og deretter langsomt slipper stempelet.
  5. Fjern bladet stykke fra røret ved hjelp av pinsett. Trim bladet med et barberblad i tilfelle det er tykkere enn 0,2 mm og skjær et lite stykke som vil passe inn i en plate.
  6. Plasser en ren blodplate med ripete siden opp i den iskalde maskinens holderen og plasser deretter avkappede leaf inn i blodplater. Fyll den resterende plassen rundt blad med en-heksadecen. Lukk sandwich med en annen plate, med riper overfor bladet.
  7. Lukk og skru holderen og sett den inn i maskinen kammeret. Deretter trykker du på "Jet-knappen for å fryse (~ 2100 barer for 300-500 millisekunder), og raskt overføre holderen i flytende nitrogen. Fjern forsiktig den frosne sandwich fra holderen ved hjelp av forhåndskjølte pinsett, tar seg ikke å sprekke sandwich.
    Merk: Lukkede frosne sandwicher kan være fryse brukket umiddelbart eller oppbevares i flytende nitrogen for senere bruk. Bruk verneklær og vernebriller ved håndtering av flytende nitrogen.

2. Freeze-brudd og Double-layer Coating 27,28

  1. Fremstille frysebrudd maskin for bruk, både pistoler for fordampning av platina / karbon (Pt / C) og karbon, i henhold til produsentens instruksjoner. Plasser Pt / C pistolen mot 45 grader ennd karbon pistol på 90 grader.
    1. Pre-programmet et malingssystem av en to-nm sjikt av Pt / C (belegg hastighet 0,02 til 0,04 nm / sek) og en 6-nm lag av karbon (på ~ 0,1 nm / sek).
      1. Skriv inn oppsett på fryse-fraktur maskinens skjerm. Velg et brukernummer der belegget ordningen vil bli lagret.
      2. Velg Pt / C for 'Layer 1 ". Velge en tidsperiode, f.eks., 5 min (for å overskride den nødvendige tid for å fullføre belegg). Bruk opp-ned-pilene for å definere en tykkelse på 2 nm.
      3. Trykk på "Layer" -knappen for å gå til Layer 2. Gjenta trinn 2.1.1.2, bortsett velger karbon og definere en tykkelse på 6 nm.
    2. Test og juster pistol drift.
      1. Velg "Lag 1". Velg Pt / C pistol ved å trykke på "GUN1 knappen og trykk på" ON "knappen på fordampning kontrollenheten av fryse-fraktur maskin. Overvåk fordampning hastighet og justere den ved hjelp av spenning og utslipps knotter until nådd en hastighet på 0,02 til 0,04 nm / sek. Trykk på 'OFF' for å slå av Pt / C pistol.
      2. Velg "Layer 2". Gjenta 2.1.2.1, bortsett velger 'GUN2' og justere for en fordampingen av ~ 0,1 nm / sek.
  2. Avkjøl fryse fraktur systemet scenen til -140 ° C eller -160 ° C (for hydrerte eller dehydrerte blader, henholdsvis). Fest vakuum cryo overføring transport til maskinen og fylle sin kammer med flytende nitrogen. Trykket i den avkjølte fryse brudd kammeret er vanligvis mellom 1 - 8 x 10 -7 mbar.
  3. Sett en fryse oppsprekking prøveholder (egnet for 3 mm plater) i lastestasjonen. Flood lastestasjonen kammer med flytende nitrogen.
  4. Last to frosne smørbrød på holderen én etter én ved hjelp av høy presisjon klasse pinsett. Stram først smørbrød i holderen og deretter snu holderen over for å sjekke at den passer godt på plass. Gjenta for den andre sandwich.
  5. Detach den avkjølte buss fra fryse brudd maskinen og koble den til lastestasjonen. Åpne vekselventil, introdusere tilbaketrekkingsarmen inn i holderen og lås den på plass. Gjeninnføre armen med holderen inn i shuttle og lukke vekselventil ved hjelp av lastestasjonen knott. Fest transport til fryse-fraktur maskin og innføre holderen inn i kammeret med tilbaketrekkingsarmen. Ta shuttle fra maskinen.
  6. Juster fryse brudd mikrotomkniv til en høyde slik at det vil kutte ut de beste plater av smørbrød.
  7. Med mikrotomkniv, raskt bryte smørbrød, og deretter umiddelbart heve den opp for å hindre forurensning av prøvene av rusk klynger seg til kniven, og slå den avkjølte skodde over nylig utsatt plan for å skjerme prøvene fra mulig forurensning av vannmolekyler i kammeret.
  8. Smør prøver med platina og karbon.
    1. Skriv "Layer 1" på fmreen. Slå på Pt / C pistol ved å trykke på "GUN1" etterfulgt av "ON" -knappen. Undersøke fordampningshastigheten og når den har nådd 0,02 til 0,04 nm / sek, samtidig utsette prøvene og trykke på "Mål" for å overvåke tykkelsen av det avsatte lag.
      Merk: Gun vil slå seg av automatisk når tykkelsen har nådd forhåndsvalgt verdi.
    2. Dekk prøvene med lukkeren når Pt / C fordampning er fullført.
    3. Trykk på "Layer" -knappen for å flytte til "Layer 2". Gjenta trinn 2.8.1 og 2.8.2, med unntak av å velge "GUN2 '(for karbon), og en fordampning hastighet på ~ 0,1 nm / sek.
  9. Varm fryse fraktur systemet scenen til -120 ° C.

3. Cryo-scanning elektronmikroskopi

  1. Klargjør scanning elektronmikroskop for kryo arbeid.
    1. Velg Stage / Stage Initialise fra hovedmenyen og bekreft.
    2. Velg Verktøy / Goto Panel, og åpne 'Airlock' panel ved å velge den fra listen. Klikk "Close Column Chamber Valve" -knappen. Vent mikroskopet kammeret ved å klikke på Vent-knappen under "Vacuum" -kategorien.
    3. Velg Verktøy / Goto Panel, og åpne 'Stage Points List' panel. Velg cryo-utveksling posisjon til å flytte scenen til de riktige koordinatene for å akseptere prøveholderen. Merk: "cryo-utveksling stilling 'er forhåndsinnstilt for å være i flukt med posisjonen til vakuum-overføringsenheten.
    4. Åpne prøven kammeret med en ren par hansker og sett cryo-scenen på hovedscenen av mikroskopet. Lukk kammeret og klikk på Pump knappen under "Vacuum kategorien '.
    5. Avkjøl mikroskop til -120 ° C. Fyll mikroskop Dewar med flytende nitrogen. Aktiver varmefunksjonen på den kryo-overføringsstyreenheten til -120 ° C når temperaturen av scenen faller under -120 ° C.
  2. AttACH den cryo-overføring transport til mikroskopet og overfører prøveholderen ved hjelp av tilbaketrekningsarmen inn i mikroskopet cryo trinnet (som i trinn 2.5). Løsne buss fra mikroskop.
  3. Klikk på "Åpne Column Chamber Valve" -knappen i luftslusen Panel.
  4. Flytt forsiktig prøveholderen nær objektiv (arbeidsavstand 1-2 mm) med joysticken. Velg en 10-mikrometer åpning i 'Vindu' Tab. Dobbeltklikk på EHT feltet i kategorien "Gun". Skriv inn 10 (kV) for EHT målet og klikk på OK. Klikk på fanen nederst EHT og velg "EHT On '.
  5. Velg 'InLens "fra detektorer rullegardinlisten i" Detektorer "-kategorien. Optimalisere bildeforhold (fokus, lysstyrke og kontrast, bjelke justering, astigmatisme) som passer.
  6. Klikk på fanen "Scanning". Velg en rask skanning ( 'Scan Speed ​​= 1', tilsvarende en oppholdstid på 100 nanosekunder per piksel) for å minimere bjelke skade, ogen "Lagre oppløsning" av 1024 x 768 piksler. Velg "Linje Gjennomsnittlig 'i' Noise Reduction rullegardinlisten. Juster verdien av N til 20 - 30 linjer for å søke. Flytt prøven ved hjelp av 'Centre Point' funksjon (ved å trykke Ctrl-tab på tastaturet) for å søke etter regioner med brutte celler og kloroplaster (figur 2a og 2b).
  7. Hente bilder av brukket kloroplaster ved lave forstørrelser (50-70 Kx) (figur 2C og 2D). Bruk 'Centre Feature-funksjon (ved å trykke Ctrl-shift-tab på tastaturet) for å zoome inn interessante kloroplast frakturflatene og hente bilder med høy forstørrelse (100-200 Kx, figur 3 og 4). Bruk de samme parametrene som i trinn 3.6 for bildeopptak, men endre linje Gjennomsnittlig verdi til N> 100 for støyreduksjon 30.
    1. Trykk Freeze på hoved mikroskop kontrollenheten eller i kategorien "Skanning 'for å stoppe skanningen og lagrebildet ved å trykke på "Lagre TIFF-knappen.

4. Bildeanalyse

Merk: Denne delen beskriver en kort prosedyre for segmentering av membran partikler fra fryse brudd SEM bilder ved hjelp av Fiji 31 open-source-pakken. Liknende resultater kan oppnås med annen programvare for bildeanalyse.

  1. Åpne bilde med Fiji ved å dra bildefilen inn i hovedvinduet til programmet. Konverter bildet til 8-bit ved å velge Image / Type / 8-bit. Velg Bilde / juster / lysstyrke / kontrast og justere etter behov (figur 5A).
  2. Bruke Rett Linje verktøyet, tegne en linje på størrelse med den innebygde bildeskalaen bar. Velg Analyser / Set Scale. Skriv inn riktig skala informasjonen (kjent avstand og Enhet for lengde) og klikk OK. Lagre dette justert skalert bildet.
  3. Velg Prosess / Filter / Gaussian blur (1,5 nm radius) og klikk OK (figur 5B).
  4. Velg Bilde / juster / Auto Lokal Threshold (med Niblack metoden) og klikk OK (figur 5C).
  5. Velg Rediger / Invert og deretter Process / Binary / Watershed (figur 5D).
  6. Tegn en ramme rundt den regionen av interesse (ROI) med Freehand markeringsverktøyet. Legg utvalget til ROI leder ved å velge Rediger / Utvalg / Legg til Manager eller ved å klikke på 'T'.
  7. Velg Rediger / slett Utenfor (figur 5E).
  8. Velg Analyser / Set Målinger, velge de riktige parametrene (f.eks område, passer ellipse).
  9. Velg Analyser / Analyser Partikler. Skriv inn et passende område for størrelsen på partiklene og merk 'Vis resultater', 'Legg til Manager "og, om nødvendig, den" Ekskluder på kantene' og klikk på OK. Resultatet er vist på figur 5F.
  10. Åpne den lagrede skalert avbildes fil (trinn 4.2). Velg "Vis alle", og fjern merket "Etiketter" i ROI Manager. Gjennomgå valgt particles legges på originalbildet og manuelt legge til eller fjerne valg ved å bruke "Legg til" eller "Slett" knappene på ROI Manager. Korrigere eventuelle valg nødvendige ved hjelp av Freehand Selection-verktøyet og "Oppdater" -knappen på ROI Manager (Tall 5G og 5H).
  11. Analysere dataene ved hjelp av innhentet målinger. I Resultater klikker Resultater / Oppsummer å få tak i, for eksempel, var gjennomsnittlig området, og mener større og mindre aksene partiklene oppført i ROI Manager. Klikk Resultater / Distribusjon, velge en parameter (for eksempel Area) og klikk OK for å vise et histogram for denne parameteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser cryo-SEM bilder av blodplater som inneholder høytrykks frosset, fryse frakturerte Craterostigma pumilum blad stykker. I noen eksempler blir store regioner av brukne celler erholdt (figur 1A). I andre forblir bladet stykket tett bundet til den øvre platen og blir dyttet ned sammen med den (figur 1B). Men selv i det andre tilfellet, noe blad vev kan forbli festet til kniven sporene på blodplater (figur 1B, pilhoder) og en god del av data fortsatt kan samles inn ved å avbilde blad "restene", forutsatt at de var brukket. Etter vellykket brudd er funnet, er lave forstørrelse bilder av celler kjøpt for å identifisere områder av interesse, i dette tilfellet kloroplaster (figur 2).

Høyere forstørrelse bilder av thylakoid membraner i C. pumilum Bladene er vist i figurene 3 og 4. De fire forskjellige frakturflatene, EFs, EFU, PFS og PFU, kan skilles fra hverandre (figur 3). Photosystem II (PSII), som er den største proteinkomplekset som finnes i membranene, ligger både i EFs (grana) og EFU (stroma lameller). Ved hydratiserte betingelser, er PSII tetthet ~ 3 ganger høyere i EFs enn i EFU (~ 1.550 komplekser mikrometer -2 vs ~ 550 um komplekser -2, figur 3). Dette er en basis for å skille mellom disse to kontinuerlige ansikter. En annen er forskjellen i deres bakgrunn. Mens EFs bakgrunnen ser glatt, er det EFU ansiktet grov og inneholder hull som er fotavtrykk av frittliggende PSI komplekser, som brudd på komplementær ansiktet, PFU 10 (figur 3). Et eksempel for segmentering av PSII komplekser fra EFS flate av thylakoid membranen er vist i figur 5.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Under dehydrering av C. pumilum, tettheten av PSII i Grana membraner (EFS) synker gradvis, og nådde omtrent halvparten (~ 700 komplekser mikrometer -2 på ~ 15 % RWC, figur 4C) av deres tetthet på hydrerte forhold (100% RWC, figur 4A) Spesielt ved nærmere dehydrering, 5 -. 10% RWC, PSII komplekser organisere i rader og rekker (piler, figur 4D og 4E). for fullstendig datasett, se 24. Dannelse av slike PSII arrays krever at noen av deres bundne antenne komplekser, LHCII, løsner fra PSII. Et eksempel på LHCII komplekser organisert i rader i PFS som ville være komplementær til organiserte PSII komplekser (i EFS ) er vist i figur 4E (pilspiss). PSII komplekser i matriser, samt frittliggende LHCII, er sannsynlig å være i en fotokjemisk slukket tilstand, som serverer en foto-beskyttende rolle. Disse strukturelle rearrangements er del av mekanismene som brukes av oppstandelsen anlegget C. pumilum å beskytte seg selv i dehydrert tilstand 24.

Figur 1
Figur 1. Lav forstørrelse Cryo-SEM Bilder av Blodplater med Freeze-oppsprukket C. pumilum Leaf Pieces. (A) En stor region av frakturerte celler (stiplet omriss) av en C. pumilum blad. (B) Et blad stykket ble slått av med topp blodplate, men noen blad vev forble festet til knivmerker på bunnen blodplater (pilspisser merke noen av disse). Regionene rundt bladet stykker er frosset 1-heksadecen (stjerne). Skala barer:. 200 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 2
Figur 2. zoomer inn i kloroplaster. (A) En gruppe med brukket foto (mesophyll) celler (skjult) av hydratisert bladvev. De fleste av cellevolumet består av et stort sentralt vakuole, med alle cytoplasmiske bestanddeler rundt vakuolen i en smal stripe. (B) To nabo brukne celler - celleveggen (cw) markerer grensen mellom cellene. Fem kloroplaster (c) er synlig i bildet, bare en av hvilke har blitt frakturert (brukket plan markert med pilspissen). (C og D) Eksempler på enkelt brukket kloroplaster fra hydrert (C) og dehydrert (D, ~ 15% relativ vanninnhold [RWC]) planter. De små hvite prikker (f.eks pilspisser) er membranproteinkomplekser innenfor de thylakoid membraner av kloroplast. Legg merke til den massive blæredannelse surrounding kloroplasten som finnes i det dehydrerte bladet (D). Skala barer: 10 mm (A); 1 um (B); 200 nm (C og D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Supramolecular Organisering av Thylakoid Membraner innen plantemateriale En brukket kloroplast der de ulike thylakoid frakturflatene kan sees. De exoplasmic frakturflatene (EF) av begge stablet (EFS) og stablede (EFU) membran regioner inneholde photosystem II (PSII) komplekser; Den protoplasmiske frakturflaten av stablet regioner (PFS) inneholder de perifere lys innhøsting antenne komplekser av PSII, LHCII; Photosystem I (PSI) og ATP syntase brudd på protoplasmiske frakturflaten av stablede områder (PFU); Cytokrom b 6 f Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Endringer i Photosystem II Organisering under Dehydrering av C. pumilum EFs vender fra thylakoid membraner av planter på forskjellige RWC: (A) 100%, (B) ~ 40%, (C) ~ 15%, og (D og E) 5 - 10%.. Under dehydratisering, tettheten av PSII i EFS vender gradvis avtar fra ~ 1500 komplekser um -2 (A) til ~ 700 mikrometer komplekser -2 (~ 15% RWC, C). Spesielt på tørrere forhold (5-10% RWC), noen PSII komplekser organisere i rader og rekker (D og E, piler). Pilspissen (E) markerer PFS ansikt, med LHCII antenne vises også være organisert i rader, i mellom hvilke PSII rader ville bli funnet i de komplementære EFs. For ytterligere informasjon om dette se 24. Skala barer. 100 nm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Eksempel på Segmentering av Photosystem II Partikler. Bruke Fiji open-source pakken, protein komplekser kan segmenteres fra bildene med noen få skritt (full detaljert fremgangsmåte som finnes i del 4 i protokollen avsnitt). Bilder (A, original image) blir uskarpt med Gaussian filter (B); bildet blir terskel ved hjelp av en automatisk lokal threshold verktøy (C); bildet er snudd rundt, og vannskillet algoritme brukes for å skille mellom gjenstander som finnes i nær kontakt (D); en region av interesse er valgt og utsiden er fjernet (E); partikler (innenfor en brukerdefinert størrelse rekkevidde) er valgt ved hjelp av partikkelanalysefunksjonen. Den resulterende maske er vist i (F). Partikler er lagt til ROI Manager og lagt over det opprinnelige bildet (G) for å se etter feil eller om det er feil eller savnet partikler. Listen over Rois kan redigeres manuelt, erstatte, slette eller legge til nye Rois, som passer. Den endelige brukeren redigert valget er vist i (H). Skala:. 200 nm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den teknikk som er beskrevet i denne artikkelen tillater undersøkelse av fryse-frakturert membraner innenfor rammen av godt bevarte høytrykks frosne plantevev med kryo-scanning elektronmikroskopi. Den store fordelen med å bruke disse prosedyrene er at prøveopparbeidelse er rent fysisk; ingen trinn som involverer kjemikalier eller dehydrering er nødvendig. Dermed kan det å studere biologiske strukturer på en tilnærmet opprinnelig tilstand 26,32. Fordelen med å bruke blad vev er at man kan få informasjon om den totale mobil organisasjonen, samt studere spesifikke membraner, som for eksempel thylakoid membraner, innenfor sitt eget fysiologisk sammenheng, dvs. innenfor kloroplast. En annen fordel, viktig å studere C. pumilum planter på ulike relative vanninnhold (RWC), er at deres hydrering staten ikke er endret under forberedelse. Dette er i motsetning til anvendelse av isolerte kloroplastene eller thylakoid membraner som utgangsmaterialetfor en fryse-fraktur eksperiment. I det sistnevnte, har man også å ta hensyn til at noen strukturelle og / eller supramolekylære endringer sannsynlig finne sted i løpet av organeller / membran isolasjon.

Arbeide med plante vevsprøver, som er forholdsvis tykk [> 50-100 um, og kan være betydelig tykkere, avhengig av typen av vev og arter], dikterer bruken av høytrykks frysing (HPF) for prøve forglassing. Anvendelse av høyt trykk [2100 bar], ved hvilken smeltetemperaturen for vannet er omtrent -22 ° C, påvirker hydrogenbinding nettverk av vannet slik at den bremser ned hastigheten av iskrystalldannelse. Derfor er sjansen for å få en vitrified prøve høy selv ved relativt langsom avkjøling priser. HPF er i dag den eneste metoden tilgjengelig for forglassing av tykke, men som ikke overstiger 200 mikrometer, prøver. Et kritisk punkt for HPF plantemateriale er infiltrasjon av deres inter luftrom med en inert4;. Plass filler "før den fryses, for å forhindre vev kollaps under høyt trykk (se vurderinger 29,33) I tilfelle av C. pumilum blader, og at tykkelsen kan være opp til 1 mm, bladene må også være trimmet eller tynnet før HPF.

I hovedsak kan teknikken med replika preparat 18 også bli brukt til å fryse-frakturert blad vev. Men i vår erfaring, tilstrekkelig utbytte av intakte brukket områder ble ikke oppnådd, siden replikaer ofte fragmentere til små biter. Videre søker etter et bestemt område av interesse, slik som kloroplaster kan være upraktisk innenfor fragmentert kopier av plantemateriale. Dette er hovedsakelig fordi mesophyll (fotoceller) består av et stort sentralt vakuolen omgitt av en smal strimmel cytoplasmisk (figur 2A), som omfatter kjernen, kloroplaster og alle andre organeller. Således kloroplaster bare utgjør en meget liten brøkdel av det totale areal på brukketmesophyll vev. Cryo-SEM avbildning av fryse-frakturert prøvene gir en løsning på dette problemet, siden prøvene er direkte visualisert følgende brudd (og belegg / skygging). Imidlertid lider denne metoden med den begrensning at frosne hydrert prøvene er strålefølsomme og dermed skanning ved høye forstørrelser lettest skader prøven på første skanningen. Double-layer coating (DLC) 27,28 tilbyr en løsning på dette alvorlig ulempe.

I DLC, er brukket prøver belagt på en måte som ligner på hvordan de er for replika forberedelse. Først, et tynt lag - er (1 3 nm) Pt / C inndampet på prøven, noe som gir kontrast og ledningsevne. Dette etterfølges av en tykkere (5 - 10 nm), beskyttende sjikt av karbon. DLC kombinert med en høy akselererende spenning (10 kV) ble brukt til bildeprøver ved bruk av tilbakespredte elektron (BSE) signal 28. BSE-signalet, som stammer fra platinalaget gjør det mulig å innhente informasjon overflaten gjennom karbonog, eventuelt, vanndamp forurensende lag, som er praktisk talt gjennomsiktig for BSE ved høye akselerasjonsspenninger (vannforurensning samler seg i forsøk hvor et vakuum-cryo overføringsenheten ikke er i bruk, og den frakturerte overflate er utsatt for atmosfæren, selv om denne er for en brøkdel av et sekund). I tillegg avbildning ved hjelp av BSE signalet minimeres problemet med lading virkninger som er tydelig i sekundære elektron (SE) deteksjon 27. Med mikroskop oppsettet beskrevet her, avbildning av SE signalet med In-objektivet SE detektor ved 10 kV gitt tilsvarende informasjon som oppnås når prøvene ble belagt utelukkende med 2-3 nm fra Pt / C og avbildes ved lav akselererende spenninger. Forskjellen er at prøvene utarbeidet av DLC og avbildes som beskrevet var betydelig mindre strålefølsomme. Dette gjorde oss i stand til å skanne dem på høy forstørrelse og i mange tilfeller også gjentatte ganger, og tillot skaffe verdifull informasjon om foto protein supramolecular organisasjon og andre cellulære bestanddeler (figur 2 - 4) 24.

Endelig kan fremgangsmåtene beskrevet her modifiseres for å studere strukturen og / eller membranprotein organisasjon i andre typer prøver. Vi har nå ansatt teknikken til å studere supra organiseringen av foto membraner i cyanobakterietoksiner og algeceller (Shperberg-Avni et al. Upubliserte data). De viktigste hensyn er å finne balansen mellom å ha så tynne en prøve som mulig, for å øke sjansen for forglassing, samtidig som prøven intakt. For forskjellige typer prøver, som kan være suspensjoner eller dyr / plantevev, bør forskjellig emballasje brukes (for eksempel i form av typen av blodplater som anvendes for høytrykks frysing). Når vellykket cryo-immobilisering er oppnådd, kombinasjonen av fryse-brudd, DLC og cryo-SEM bildebehandling gir et utmerket middel for å få informasjon på membran protein organisasjon ved høy forstørrelse med minimal bjelke skade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Vi takker Andres KAECH (University of Zurich) for hans nyttige råd om elektronmikroskope bildebehandling. Dette arbeidet ble støttet av USA-Israel binational Agricultural Research and Development Fund (gi no. US-4334-10, ZR), Israel Science Foundation (gi nr. 1034/12, ZR), og Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013, ZR). Elektron mikroskopi studiene ble utført ved Irving og Cherna Moskowitz Senter for Nano og Bio-Nano Imaging ved Weizmann Institute of Science.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol abs Bio-Lab 052505
Isopropanol Bio-Lab 162605
1-hexadecene Sigma-Aldrich H7009
0.1/0.2 Platelets Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland 241 Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems.
High-precision-grade tweezers Electron Microscopy Sciences 72706-01 Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers.
High-pressure freezing machine Bal-Tec HPM 010 High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.
Freeze-fracture system Leica Microsystems EM BAF 060
Cryo preparation loading stage Leica Microsystems 16770228
Specimen holder for univeral freeze fracturing Leica Microsystems 16LZ04746VN Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm
Vacuum cryo-transfer shuttle Leica Microsystems EM VCT 100
Scanning electron microscope Zeiss Ultra 055
Cryo SEM stage Leica Microsystems 16770299905
Image acquisiton software SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH
Image analysis software Fiji/Image J, National Institute of Health http://fiji.sc/Fiji

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26, (7), 625-639 (1999).
  2. Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55, (5), 1048-1056 (1966).
  3. Branton, D., et al. Freeze-Etching Nomenclature. Science. 190, (4209), 54-56 (1975).
  4. Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes - Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas. J. Cell Biol. 48, (3), 594-619 (1971).
  5. Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1. Eur. J. Cell Biol. 31, (2), 305-314 (1983).
  6. Staehelin, L. A. Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes. Invitro. J. Cell Biol. 71, (1), 136-158 (1976).
  7. Miller, K. R. A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I - Changes in Unstacked Membrane Regions. Biochim. Biophys. Acta. 592, (1), 143-152 (1980).
  8. Miller, K. R., Cushman, R. A. Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II - Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle. Biochim. Biophys. Acta. 546, (3), 481-497 (1979).
  9. Miller, K. R., Staehelin, L. A. Analysis of Thylakoid Outer Surface - Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions. J. Cell Biol. 68, (1), 30-47 (1976).
  10. Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein. Carlsberg Res. Commun. 44, (5), 305-336 (1979).
  11. Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes - a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex. Eur. J. Cell Biol. 59, (1), 176-186 (1992).
  12. Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants. Biochim. Biophys. Acta. 851, (2), 239-248 (1986).
  13. Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes. J. Cell Biol. 70, (2), 400-418 (1976).
  14. Staehelin, L. A. Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes. Photosynth. Res. 76, (1-3), 185-196 (2003).
  15. Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants. Plant J. 70, (1), 157-176 (2012).
  16. Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity - Freeze-Fracture Evidence. Protoplasma. 178, (1-2), 57-65 (1994).
  17. Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy. J. Electron Microsc. Tech. 13, (4), 288-299 (1989).
  18. Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51694 (2014).
  19. Kirchhoff, H., et al. Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts. Biochemistry. 46, (39), 11169-11176 (2007).
  20. Johnson, M. P., et al. Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts. Plant Cell. 23, (4), 1468-1479 (2011).
  21. Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement. Biochemistry. 43, (28), 9204-9213 (2004).
  22. Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems. Plant Cell Environ. (2015).
  23. Goral, T. K., et al. Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis. Plant J. 69, (2), 289-301 (2012).
  24. Charuvi, D., et al. Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant. Plant Physiol. 167, (4), 1554-1565 (2015).
  25. Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants. Plant Stress. 1, (1), 72-84 (2007).
  26. Walther, P. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy. Schatten, H., Pawley, J. B. Springer. New York. 245-261 (2008).
  27. Walther, P., Müller, M. Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy--present state and applications. Scanning. 19, (5), 343-348 (1997).
  28. Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy. J. Microsc. 179, (Pt 3) 229-237 (1995).
  29. Hess, M. W. Cryopreparation methodology for plant cell biology. Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).
  30. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184, (2), 355-360 (2013).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  32. Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212, (1), 34-43 (2003).
  33. Nevo, R., et al. Architecture of Thylakoid Membrane Networks. Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics