الاستراتيجية غشائي أنبوب خلية تشكيل الفحص: مقارنة خارج الخلية مصفوفة وعامل نمو مخفض خارج الخلية مصفوفة

Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Xie, D., Ju, D., Speyer, C., Gorski, D., Kosir, M. A. Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix. J. Vis. Exp. (114), e54074, doi:10.3791/54074 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

من أجل الحصول على العناصر الغذائية الضرورية للبقاء على قيد الحياة، تتطلب الأورام الخبيثة الوصول إلى مجرى دم المريض. للحصول على هذا الوصول، والخلايا السرطانية تفرز الإشارات الكيميائية التي تحفز نمو أوعية دموية جديدة إلى الورم، وبالتالي اختطاف عملية فيزيولوجية طبيعية تعرف باسم الأوعية الدموية 2. بل هو أيضا من خلال الأوعية الدموية التي تم إنشاؤها عن طريق الأوعية الدموية التي الانبثاث (أي انتشار السرطان إلى أعضاء أخرى) يمكن أن يحدث. لأن عملية تكوين الأوعية الدموية مسألة حيوية جدا لتطور هذه مجموعة واسعة من السرطانات، فمن هدفا جذابا في مجال البحوث العلاج المضادة للسرطان 3.

واحد الطريقة المستخدمة لتحديد الأوعية الدموية لقياس قدرة الخلية الاصلية البطانية لتشكيل الأنابيب عند وضعه على المصفوفة خارج الخلية. لأن تشكيل هذه الأنابيب هو خطوة حاسمة مبكرة في الأوعية الدموية، واختبار الظروف البيئية (على سبيل المثال، وجود أو عدم وجود التعاون نظرايوفر mpound) التي يمكن أن تحفز أو منع تشكيل أنبوب نظرة ثاقبة الخطوات المحددة التي يمكن أن تستهدف تمنع تكوين الأوعية الدموية. والبطانية أنبوب خلية تشكيل الفحص هي واحدة من الأكثر استخداما على نطاق واسع 4 طرق في المختبر الذي يقيس قدرة الخلايا على تشكيل الأنابيب. وهو فحص بسيط، الأمر الذي يتطلب عددا قليلا نسبيا من المكونات وفترة قصيرة ثقافة 5. ولعل الأهم من ذلك، ومع ذلك، هو أن البيانات المكتسبة من هذا النوع من الاختبار هو قياس الكمي.

مثال لاستخدام مقايسة تشكيل أنبوب ينطوي على مقارنة التطورات أنابيب من خلايا بطانة الأوعية الدموية نمت على المصفوفة خارج الخلية مقابل عامل النمو انخفاض (GFR) المصفوفة خارج الخلية. المصفوفة خارج الخلية هو الطابق السفلي يشبه الغشاء مادة معزولة من خلايا الورم اللحمي والمكونات الرئيسية هي laminin، النوع الرابع الكولاجين، عوامل النمو والبروتيوغليكان. بعض المركبات لها تأثيرات مختلفة على قدرة الخلية على شكل أنابيب عندما تكون فيبيئة مع عوامل النمو المنخفض وانخفاض بروتيوغليكان كبريتات heparan (HSPGs). HSPGs هي عنصر من عناصر المصفوفة خارج الخلية التي خفضت بشكل ملحوظ في معدل الترشيح الكبيبي المصفوفة خارج الخلية. على سبيل المثال، إذا كانت الفرضية هي أن مثبطات تكوين الأوعية الدموية، مثل SB225002، التي تمنع مستقبلات CXCR2، لديها قدرة أضعف إلى حد كبير لقطع تشكيل أنبوب عندما HSPGs وفيرة، ثم عقد مقارنة بين النشاط تشكيل أنبوب في المصفوفة خارج الخلية وGFR المصفوفة خارج الخلية هي المهم في استكشاف إمكانية تثبيط تكوين الأوعية الدموية عن طريق السيطرة على HSPGs.

المقايسات الأخرى التي تستخدم عادة لتحديد آثار المركبات على الأوعية الدموية هي في طرق الحي. الأمثلة البارزة على ذلك هي فرخ غشاء مشيمائي (CAM) فحص 6 باستخدام بيض الدجاج، وفي الجسم الحي Matrigel سد الأوعية الدموية فحص 7 باستخدام الفئران. بينما في الجسم الحي طرق قياس الأوعية الدموية في تيأبعاد hree وتكون أكثر تمثيلا للجسم البشري مقارنة في المختبر أنبوب تشكيل الفحص، فإنها تعاني من عيب تتطلب مزيدا من الوقت وهم إلى حد كبير أكثر صعوبة لأداء. كلا مقايسة كأم وفحص المكونات خارج الخلية تأخذ على الأقل في الأسبوع من 8 إلى القيام به، بينما في المقارنة، وفحص تشكيل أنبوب يمكن القيام به في يوم واحد، وأنها لا تتطلب استخدام الحيوانات.

من المهم أن نلاحظ أن الخلايا البطانية المستخدمة في هذا التقرير هي الوريد السري الخلايا البطانية الإنسان (HUVEC). هذه الخلايا تلعب دورا رئيسيا في تنبت الأوعية الدموية ونمو الأوعية الدموية، ومشابهة لالخلايا البطانية في السرطان ليتم استخدامها لتقييم النشاط المضادة للتكوين الأوعية الدموية في كل من في التجارب المختبرية والتجارب المجراة 9 بما فيه الكفاية. ويمكن أيضا خلايا أخرى مثل الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الابتدائية استخدامها.

ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن بالاضافة الى وجود أقلمستويات HSPGs، المصفوفة خارج الخلية GFR أيضا قد قللت من مستويات العديد من مكونات بالمقارنة مع المصفوفة خارج الخلية العادية. وهذا يشمل، ولكن ليس على سبيل الحصر: EGF، IGF-1، PDGF، وعامل النمو التحويلي بيتا. تلك التجارب أداء دراسة أهمية هذه المركبات فيما يتعلق الأوعية الدموية قد تكون مهتمة في استخدام GFR المصفوفة خارج الخلية.

Protocol

1. خلية ثقافة

  1. البذور 3x10 5 خلايا HUVEC في 10 مل من متوسط ​​النمو الكامل 10 في 75 سم قارورة.
  2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 إلى التقاء 70-80٪.

2. الأنبوب الصغير تشكيل الفحص

  1. ذوبان الجليد إما النمو انخفاض عامل (GFR) المصفوفة خارج الخلية أو المصفوفة خارج الخلية العادية بين عشية وضحاها على الجليد في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: للحصول على الإيجاز "المصفوفة خارج الخلية" سيتم من الآن فصاعدا أن تستخدم لمرجع كل من GFR والمصفوفة خارج الخلية العادية. عملية لإعدادهم متطابقة.
  2. حافظ على لوحات ثقافة 96-جيدا على الجليد، وإضافة 50 ميكرولتر من المصفوفة خارج الخلية المبردة لكل بئر باستخدام نصائح تبريد مسبقا. إعداد ثلاث نسخ من 5 الآبار التي تحتوي فقط المصفوفة خارج الخلية العادية. إعداد ثلاث نسخ أخرى من 5 الآبار التي تحتوي الوحيد GFR المصفوفة خارج الخلية.
  3. احتضان لوحة 96-جيدا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. غسل HUVECsمرة واحدة مع حل الفوسفات مخزنة دون الكالسيوم والمغنيسيوم (PBS)، وإضافة 1 مل 0.05٪ التربسين-EDTA. احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 1-5 دقيقة، والتحقق من الخلايا كل دقيقة حتى تعتقل معظم الخلايا يصل. إزاحة الخلايا عن طريق التنصت على القارورة مرة واحدة.
    1. إضافة 5 مل المتوسطة القاعدية (أي البطانية المتوسطة نمو الخلايا من دون أي شيء (على سبيل المثال، وملاحق) المضافة) مع 1٪ مصل بقري جنيني (FBS). جمع الخلايا في قارورة من قبل pipetting ونقل إلى أنبوب 15 مل. الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق والتخلص من طاف.
    2. إعادة تعليق مع 2 مل المتوسطة القاعدية، عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات، وضبط تركيز الخلية إلى 2-3 × 10 5 خلية / مل.
  5. إعداد 100 ميكرولتر من تركيزات 10X التالية CXCR2 المانع SB225002 في المتوسط ​​القاعدية: 11 ميكرومتر، 5.6 ميكرومتر، 1.1 ميكرومتر، 0.56 ميكرومتر و 0 ميكرومتر (مراقبة).
  6. ماصة 300 ميكرولتر من تعليق HUVEC في كل 5 ميكرأنابيب ocentrifuge. إضافة 33 ميكرولتر من تركيزات مثبط (11 ميكرومتر، 5.6 ميكرومتر، 1.1 ميكرومتر، 0.56 ميكرومتر و 0 ميكرومتر) في أنبوب واحد كل تحتوي على HUVECs، ودوامة.
  7. ماصة 50 ميكرولتر من كل من الايقاف الخلية (1-1.5 × 10 4 خلايا) إلى الآبار الفردية من المصفوفة خارج الخلية. لوحة كل تعليق في ثلاث نسخ واحتضان لمدة 4-16 ساعة على 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
  8. بعد 4-16 ساعة، واتخاذ 4 صور من الأنابيب شكلت لكل بئر باستخدام مجهر الكاميرا المقلوب 11 (التكبير الأصلي × 100).

3. الأنبوب الصغير تعطيل الفحص

  1. إعداد المصفوفة خارج الخلية واللوحات وفقا لنفس المواصفات وتشكيل أنبوب الفحص (الخطوات 2،1-2،3).
  2. إعداد HUVEC تعليق كما هو موضح في خطوات 2.4- 2.4.2 لتشكيل أنبوب الفحص وقسامة في لوحة 96 كذلك يحتوي المصفوفة خارج الخلية في 50 ميكرولتر لكل بئر.
    ملاحظة: لوحة لما يكفي من الآبار الصورةس أن هناك 3 آبار في العلاج من تعاطي المخدرات.
  3. تنمو الخلايا على المصفوفة خارج الخلية لمدة 4 ساعة على 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. التقاط صور قبل الشروع في العلاج من تعاطي المخدرات.
  4. إعداد تركيزات 2X من المانع SB225002 CXCR2 كما هو موضح في الخطوة 2.5 من فحص أنبوب تشكيل، وإضافة 50 ميكرولتر من كل تركيز لكل بئر من 96 لوحة جيدا تحتوي على HUVECs. لوحة كل التركيز في ثلاث نسخ.
  5. احتضان لوحة لمدة 2-12 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. خذ 4 صور من الأنابيب التي تشكلت في كل بئر باستخدام الكاميرا المجهر المقلوب (التكبير الأصلي × 100) 11.

4. بيانات تحديد مقدار

  1. تقييم تشكيل أنبوب المأسورة في الصور عن طريق قياس طول أنبوب الكلي للأنابيب في أربعة حقول المجهرية عشوائية باستخدام برنامج الكاميرا المجهر.
  2. فتح الصورة في برنامج الكاميرا المجهر، وانقر على 'الشروح والقياسات9 ؛. ضمن قسم "طول"، حدد أداة "خط بسيط". انقر على الصورة، ثم رسم خط على طول الأنبوب، ثم انقر فوق الحق.
    ملاحظة: سوف يقوم البرنامج تلقائيا بحساب طول الخط في بكسل ووضع البيانات في الملف.
  3. كرر الإجراء لجميع خطوط الأنابيب في الصورة عن طريق اختيار أداة "خط بسيط". انقر على الصورة، ثم رسم خط على طول الأنبوب، ثم انقر فوق الحق.
    ملاحظة: سوف يقوم البرنامج بتسجيل طول كل خط وعرض البيانات على الشاشة.
  4. بعد قياس كل أنبوب في الصورة، انقر على "تصدير"، ثم اختار "طول لجدول".
    ملاحظة: سيتم تصدير البيانات طول إلى جدول بيانات.
  5. إضافة كافة أطوال أنبوب من جدول البيانات للحصول على طول أنبوب الكلي. حساب وتسجيل متوسط ​​طول الأنابيب.
    ملاحظة: ينصح أربعة مكررات مع المتوسط ​​والانحراف المعياري تحديدها.

5. خلايا التعافي من خارج الخلية مصفوفة الثقافة

  1. ثقافة وإجراء فحص تشكيل أنبوب (انظر القسم 2) على نطاق واسع كما 96 لوحة جيدا لن تسفر كافية عدد خلايا. 12 لوحات جيدة، استخدم 500 ميكرولتر من المصفوفة خارج الخلية و 500 ميكرولتر من تعليق الخلية HUVEC (1.5x10 5 الخلايا).
  2. احتضان الخلايا لمدة 4-16 ساعة من أجل تشكيل الأنابيب. ثم، نضح مستنبت الخلية. شطف الخلايا مع 1 مل من البرد برنامج تلفزيوني 1X دون الكالسيوم والمغنيسيوم.
  3. إضافة 1 مل من الجليد الباردة PBS 2.5 عازلة ملي EDTA على الثقافة والحفاظ على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  4. إزاحة الخلايا وخارج الخلية خليط مصفوفة من الطبق باستخدام 1000 ميكرولتر ماصة مع قطع بلاغ، ومن ثم نقل إلى بارد أنبوب 15 مل، ويغسل جيدا مع 4 مل من الجليد الباردة PBS 2.5 ملي EDTA ووضعها في أنبوب .
  5. وضع أنابيب على الجليد لمدة 1-4 ساعة وعكس الأنبوب عدة مرات حتى كل من خارج الخليةتم حل المصفوفة.
  6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1620 x ج في 0 درجة مئوية
  7. اعادة تعليق الكريات الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1 مل البارد إلى أنبوب 1.ml على الجليد.
  8. الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 3000 x ج في 0 درجة مئوية، ثم التخلص من طاف.
  9. تخزين الخلايا في -80 درجة مئوية.

Representative Results

كبير صحي تشكيل الأنبوب، البطانية ويمكن بسهولة أن يتناقض إلى تشكيل أنبوب تحول دون في صور المجهر. يبدو تشكيل أنبوب صحي باعتباره الويب المنظم للهياكل تشبه الشعرية (الشكل 1). في المقابل، تشكيل أنبوب تحول دون يتجلى خلايا منتشرة في (الشكل 2). وكميا أنبوب البيانات تشكيل الفحص عن طريق قياس طول أنبوب الكلي للأنابيب الشعرية (الجدول 1). وبالاضافة الى مجموع طول الأنبوب، فإن متوسط ​​طول الأنبوب، العدد الكلي للأنابيب، أو عدد من النقاط فرع يمكن قياسها. تشكيل أنبوب منظم غلة أكبر طول صافي أنبوب من نمو أنبوب تحول دون متناثرة. في الشكل (3)، يسمح منحنى الاستجابة للجرعة حساب IC 50 تحت ظروف تجريبية من HUVECs على GFR المصفوفة خارج الخلية ومثبط CXCR2 SB225002.

> شكل 1
الشكل 1. غشائي تشكيل تي أوبي على المصفوفة خارج الخلية والنمو انخفاض عامل (GFR) المصفوفة خارج الخلية. صورتان تظهر تشكيل أنبوب الناجح على المصفوفة خارج الخلية (أ) و GFR المصفوفة خارج الخلية (B). شبكة مترابطة من أنابيب يظهر بوضوح أن نمو أنابيب يتمتع بصحة جيدة في هذه HUVECs. شريط النطاق = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. تثبيط تشكيل أنبوب على خارج الخلية والنمو انخفاض عامل (GFR) المصفوفة خارج الخلية من قبل SB225002 CXCR2 المانع (5.6 ميكرومتر). صورتان تظهر أنبوبالتشكيلة التي أعيقت من قبل SB225002 CXCR2 المانع (5.6 ميكرومتر) في المصفوفة خارج الخلية (أ) و GFR المصفوفة خارج الخلية (B). أن الخلايا كانت كتل متفرقة من خلايا HUVEC ينظر في هذا المعرض صورة غير قادرة على تشكيل الأنابيب اللازمة للاتصال مع بعضها البعض. شريط النطاق = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. الجرعة منحنى استجابة على النمو انخفاض عامل (GFR) المصفوفة خارج الخلية. ويوضح المحور X طول الأنبوب ويظهر Y-محور تركيز مثبط CXCR2. ويوضح منحنى الاستجابة للجرعة أن الاستجابة HUVEC إلى المانع CXCR2 على GFR المصفوفة خارج الخلية هي الجرعة التي تعتمد. وIC 50 (المانع القصوى نصفتم حساب تركيز ص) باستخدام برنامج 13 ويمكن مقارنة مع منحنى الاستجابة للجرعة لالمصفوفة خارج الخلية، على سبيل المثال. IC 50 هو تركيز مثبط أن يقلل من استجابة إلى 50٪. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري.

عامل نمو مخفض (GFR) المصفوفة خارج الخلية ومثبط (4 مكررات لكل منهما) إجمالي طول الأنبوب متوسط ​​(بكسل) (1 بكسل = 0.34 ميكرون) الانحراف المعياري P القيمة
GFR السيطرة المصفوفة خارج الخلية 2447 168،174
GFR خارج الخلية SB225002 مصفوفة + 0.56 ميكرومتر 1422.5 185.4218 0.000395
GFR خارج الخلية SB225002 مصفوفة + 1.1 ميكرومتر 1004 126.1784 2.14 × 10 -5
GFR خارج الخلية SB225002 مصفوفة + 5.6 ميكرومتر 519.25 129.6368 4.19 × 10 -6
GFR خارج الخلية SB225002 مصفوفة + 11 ميكرومتر 393.75 212.6857 1.21 × 10 -5

الجدول 1. تحديد مقدار مجموع أطوال أنبوب على النمو وانخفاض عامل (GFR) المصفوفة خارج الخلية تحت ظروف مختلفة. جزء من جدول باستخدام مجموع أطوال أنبوب سجلت في عينات نمت على GFR المصفوفة خارج الخلية مع تركيزات مختلفة من المانع CXCR2. وتشير البيانات إلى أن المانع CXCR2 لا تمنع تشكيل الأنبوب. وشملت هي القيم المرتبطة مثل المتوسط ​​أربعة مكررات، الانحراف المعياري، وقيمة P. تقاس بالبكسل لاظهارالبيانات التي يتم تصديرها. IC 50 يمكن أن تحسب باستخدام البرامج الإحصائية 13. (1 بكسل = 0.34 ميكرون)

Discussion

عند إجراء هذا الاختبار، فمن الضروري للحفاظ على المصفوفة خارج الخلية على الجليد أو على 4 درجات مئوية في جميع الأوقات ما لم ينص على خلاف ذلك. إذا سمح المصفوفة خارج الخلية لتدفئة فوق 4 درجات مئوية، وسوف بلمرة، وسوف تكون مدمرة للفحص. ومن المهم أيضا للتأكد من أن كل ما يأتي في اتصال (على سبيل المثال، نصائح الماصة، لوحة) مع المصفوفة خارج الخلية هي للسبب المذكور تبريد مسبقا. عدد الخلايا المزروعة في كل بئر أمر بالغ الأهمية، وعدد قليل جدا من الخلايا لا تعطي الويب المتوقع في العينة الضابطة، وعدد كبير جدا من الخلايا تشكل مجموعات الخلايا الكبيرة أو أحادي الطبقة وسوف الفحص لا تكون صالحة. عامل آخر مهم في نجاح هذا الاختبار هو عدد الخلايا مرور HUVECs. يجب أن يكون عدد مرور دائما أقل من عشرة، وإلا قد لا يحدث تشكيل أنبوب قوية. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي للمرء التأكد من أن مستنبت الخلية المستخدمة لم تنته، أو أن الخلايا لا تكون قابلة للحياة. Alternatively، يمكن للمرء أن قسامة على المديين المتوسط ​​ومكوناته وتخزينها في -20 درجة مئوية إلى الحفاظ على لفترة من الزمن بعد تاريخ انتهاء الصلاحية. بطبيعة الحال، فإنه لا يزال الأفضل استخدام المتوسط ​​قبل تاريخ انتهاء الصلاحية

مثل جميع الإجراءات، وهناك بعض العيوب لإجراء البطانية أنبوب خلية تشكيل الفحص. مشكلة واحدة كبرى هي أن، لأن هناك أنواع مختلفة من الخلايا البطانية والمصفوفات الدعم، ونتائج الفحص يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا تبعا الذي يستخدم نوع من الخلايا والمصفوفة. الخلايا البطانية المستخدمة (HUVECs، HAECs أو HMVECs) هي الخلايا الأولية، أنها مكلفة للحصول على ويكون التغير مقارنة مع الخلايا خلد. الخلايا الأولية لها ممرات محدودة للاستخدام، وبالتالي ليست مناسبة للتجارب الأوعية الدموية على المدى الطويل 14. للحصول على بيانات يمكن الاعتماد عليها، ينبغي للمرء دائما استخدام نفس أنواع للفحص. كما هو الحال مع البعض في فحوصات المختبر، وينبغي أن تكون نتائج الفحص تشكيل أنبوب يخدعترسخ في الجسم الحي، لأن النتائج من ظروف خاضعة للرقابة والاصطناعية من زراعة الأنسجة ثنائية الأبعاد قد لا يكون دائما تنعكس في عوضا عن الأكياس المعقدة للكائنات الحية. ومن المهم أيضا أن نأخذ في الاعتبار أن هذا النوع من الفحص يمكن أن تستخدم إلا لإثبات تشكيل أنبوب الخلايا البطانية، وينبغي ألا تستخدم لاختبار أخرى، غير البطانية، أنبوب تشكيل الخلايا.

هذا الاختبار هو طريقة بسيطة إلى حد ما وسريعة لتحديد إمكانية عائية من مركب. وهو يشكل أيضا منبرا لمزيد من التجارب، وحده، فإنه لا تعطي معلومات بشأن آلية معينة من خلالها مجمع يؤثر في الواقع عملية تشكيل السفينة. ومع ذلك، فإن استخدام مصفوفات خارج الخلية المتنوعة مثالا على كيفية مواصلة خلق إطار للأسئلة البحث التي لا تستخدم عادة. هناك أساليب لدراسة الآليات البيولوجية والكيميائية المحددة للمجمع بما في ذلك مثبطات محددة تستهدف مكوناتمسار الأوعية الدموية. قد تكون مقاربة أخرى لاستخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا البطانية واستخدام RT-PCR (في الوقت الحقيقي PCR) 12 لتحليل التغيرات في التعبير الجيني الذي قد يتسبب في سلوك النمو المسجلة في الفحص. وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذه الطريقة transfected HUVECs لخلق المقايسات تدق إلى أسفل إلى اتخاذ خطوات محددة لمسار الأوعية الدموية. وهناك إمكانية لتطبيق هذا النهج لدراسة مسار lymphangiogenesis. عن طريق تغيير مكونات المصفوفة خارج الخلية، والتفاعل من المصفوفة وعملية الخلوية دعم الأوعية الدموية في السرطان يمكن توضيحها بدرجة أكبر. استخراج الحمض النووي الريبي والبروتينات من الخلايا البطانية في ظل هذه الظروف محددة توفر البيانات الكمية الإضافية المقابلة لتصوير البيانات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 ) Fisher NC9525043 HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin. Aliquot the medium and its components and store them at -20 °C, warm in 37 °C before use.
MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10 ml; LDEV-Free Fisher CB-40230 Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use.
MATRIGEL MATRIX 10ML; 10 ml; LDEV-Free Fisher CB-40234 extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use.
SB225002 Fisher 559405 CXCR2 inhibitor, keep in -20 °C, warm in room temperature before use.
Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)  ScienCell Research Laboratories  8000 culture it according reference  10.
Trypsin 0.05%-EDTA phenol red Invitrogen 25300-054 keep in 4 °C, warm in 37 °C before use.
Nikon ECLIPSE Ti Nikon Inverted Research Microscope. 
NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit Nikon Inverted Research Microscope software
Graph-pad Prism 5 GraphPad Software, Inc. scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, B., Nawandar, D. M., Nannuru, K. C., Varney, M. L., Singh, R. K. Targeting CXCR2 enhances chemotherapeutic response, inhibits mammary tumor growth, angiogenesis, and lung metastasis. Mol Cancer Ther. 12, (5), 799-808 (2013).
  2. Birbrair, A., et al. Type-2 pericytes participate in normal and tumoral angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 307, (1), 25-38 (2014).
  3. Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438, (7070), 967-974 (2005).
  4. Speyer, C. L., Hachem, A. H., Assi, A. A., Johnson, J. S., DeVries, J. A., Gorski, D. H. Metabotropic glutamate receptor-1 as a novel target for the antiangiogenic treatment of breast cancer. PLoS One. 9, (3), 88830 (2014).
  5. Gu, X., et al. Human Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease siRNA Inhibits the Angiogenesis Induced by X-Ray Irradiation in Lung Cancer Cells. International Journal of Medical Sciences. 10, (7), 870-882 (2013).
  6. Manjunathan, R., Ragunathan, M. Chicken chorioallantoic membrane as a reliable model to evaluate osteosarcoma-an experimental approach using SaOS2 cell line. Biol Proced Online. 17, 10 (2015).
  7. Nidhyanandan, S., Boreddy, T. S., Chandrasekhar, K. B., Reddy, N. D., Kulkarni, N. M., Narayanan, S. Phosphodiesterase inhibitor, pentoxifylline enhances anticancer activity of histone deacetylase inhibitor, MS-275 in human breast cancer in vitro and in vivo. Eur J Pharmacol. 764, 508-519 (2015).
  8. Li, Y., et al. Copper improves the anti-angiogenic activity of disulfiram through the EGFR/src/VEGF pathway in gliomas. Cancer Lett. Aug. (2015).
  9. Park, H. J., Zhang, Y., Georgescu, S. P., Johnson, K. L., Kong, D., Galper, J. B. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Rev. 2, (2), 93-102 (2006).
  10. Clonetics Endothelial Cell System Technical Information & Instructions. Lonza Walkersville, Inc. Available from: http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf (2015).
  11. The Essence of Cutting-edge Microscopy Research. Nikon Corporation. Available from: http://www.nikoninstruments.com/images/stories/PDFs/Eclipse_Ti_Brochure.pdf (2008).
  12. de Wit, C., Fautz, C., Xu, Y. Real-time quantitative PCR for retrovirus-like particle quantification in CHO cell culture. Biologicals. 28, (3), 137-148 (2000).
  13. 50% of what? How exactly are IC50 and EC50 defined. Graphpad Software. Available from: http://www.graphpad.com/support/faqid/1356/ (2015).
  14. Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells for derived from umbililcal veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, (11), 2745-2756 (1973).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics