C2C12 Myoblast कक्ष में मायोटोनिक अपविकास 1 मॉडलिंग

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Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम अनुकूलित C2C12 सेल रखरखाव, जीन अभिकर्मक / पारगमन, और myocyte भेदभाव सहित मायोटोनिक कुपोषण 1 myoblast मॉडल, स्थापित करने में प्रक्रियाओं प्रस्तुत करते हैं।

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Liang, R., Dong, W., Shen, X., Peng, X., Aceves, A. G., Liu, Y. Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells. J. Vis. Exp. (113), e54078, doi:10.3791/54078 (2016).

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Abstract

मायोटोनिक कुपोषण 1 (DM1) पेशी dystrophy का एक आम रूप है। हालांकि कई पशु मॉडल DM1 के लिए स्थापित किया गया है, myoblast सेल मॉडल क्योंकि वे सेलुलर और आणविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक कुशल सेलुलर विकल्प प्रदान करते हैं अभी भी महत्वपूर्ण हैं। C2C12 myoblast कोशिकाओं को व्यापक रूप से जीन अभिकर्मक, या वायरल पारगमन के लिए myogenesis, प्रतिरोध का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है हालांकि, C2C12 कोशिकाओं में अनुसंधान hinders। यहाँ, हम एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है कि दैनिक रखरखाव, अभिकर्मक और पारगमन प्रक्रियाओं C2C12 myoblasts और myocyte भेदभाव की प्रेरण में जीन को पेश करने में शामिल हैं का वर्णन है। सामूहिक रूप से, इन प्रक्रियाओं का सबसे अच्छा अभिकर्मक / पारगमन क्षमता है, साथ ही लगातार भेदभाव परिणामों को सक्षम। प्रोटोकॉल DM1 myoblast सेल मॉडल की स्थापना मायोटोनिक कुपोषण के अध्ययन के साथ-साथ अन्य मांसपेशियों की बीमारियों को लाभ होगा में वर्णित है।

Introduction

मायोटोनिक अपविकास (डीएम) एक autosomal प्रमुख रोग कई सिस्टम, सबसे विशेष रूप से हृदय और कंकाल की मांसपेशियों 1 को प्रभावित करता है। इस रोग, DM1 और DM2 के दो उपप्रकार होते हैं। DM1 ज्यादा आम है और DM2 2 की तुलना में अधिक गंभीर अभिव्यक्ति है। आनुवंशिक उत्परिवर्तन अंतर्निहित DM1 सीयूजी त्रिक 3 'untranslated क्षेत्र डीएम प्रोटीन काइनेज जीन (डीएमपीके) 3 के (UTR) में स्थित दोहराता की एक विस्तार है। अप्रभावित व्यक्तियों में सीयूजी नंबर दोहराने बदलता है 5 से 37. इसके विपरीत करने के लिए, यह और कभी कभी अप DM1 रोगियों 4 में हजारों लोगों के लिए 50 से अधिक बढ़ जाती है। नतीजतन, इस तरह के रूप में शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन, muscleblind की तरह 1 (MBNL1), CUGBP, और elav की तरह परिवार 1 (Celf1), misregulated हैं। विस्तार किया सीयूजी दोहराता पर ज़ब्ती के कारण, MBNL1 वैकल्पिक splicing 5 को विनियमित करने की क्षमता खो देता है। Celf1, दूसरे हाथ पर, ऊपर से नियंत्रित किया जाता है 6.7। Celf1 की overexpression मांसपेशियों की हानि के साथ जुड़ा हुआ हैऔर कमजोरी है, जो MBNL1 समारोह के नुकसान के लिए जिम्मेदार ठहराया नहीं कर रहे हैं। डीएमपीके 3'-UTR सीयूजी विस्तार, MBNL1 की हानि, और Celf1 की overexpression सहित DM1 संबंधी परिवर्तन, अनुकरण पशु मॉडल स्थापित किया गया है। हालांकि, myoblasts में DM1 मॉडलिंग विशेष रूप से DM1 से संबंधित सेलुलर और आणविक घटनाओं विदारक के लिए, एक कुशल विकल्प प्रदान करता है।

C2C12 myoblast सेल लाइन पहला घायल C3H माउस पेशी से पृथक किया गया है और व्यापक रूप myogenic भेदभाव 8,9 अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया। C2C12 कोशिकाओं के तेजी से भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त मीडिया में पैदा करना और आसानी से भेदभाव से गुजरना जब FBS समाप्त हो गया है। फिर भी, इस myoblast भेदभाव मॉडल का उपयोग कर दो चुनौतियों प्रस्तुत करता है: C2C12 कोशिकाओं अक्सर जीन अभिकर्मक / वायरल पारगमन के लिए प्रतिरोधी रहे हैं; और सेल हैंडलिंग और भेदभाव प्रक्रिया में मामूली बदलाव myotube गठन में चिह्नित परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

हमारी प्रयोगशाला नियमित तौर पर एसी के रूप में C2C12 myoblasts का उपयोग करता हैपक्ष मॉडल और प्रोटोकॉल है कि प्रभावी ढंग से C2C12 सेल लाइन 10 में प्लाज्मिड अभिकर्मक, रेट्रोवायरल पारगमन, और lentiviral पारगमन द्वारा जीन प्रदान विकसित की है। वीडियो में, हम परासंक्रमित / C2C12 कोशिकाओं transducing और DM1 myoblast मॉडल स्थापित करने में भेदभाव स्थिरता को बनाए रखने के लिए अनुकूलित प्रक्रियाओं का प्रदर्शन।

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Protocol

1. C2C12 सेल संस्कृति

  1. मध्यम विकास में एक 100 मिमी प्लेट में C2C12 माउस myoblasts बनाए रखें (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM)) 20% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 2 मिमी एल glutamine। 60% मिला हुआ - C2C12 passaged कोशिकाओं लगभग 50 बनने के लिए अनुमति दें।
  2. मध्यम विकास त्यागें और 3 मिलीग्राम कमरे के तापमान फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ C2C12 कोशिकाओं धो लें। पीबीएस निकालें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए 500 μl 0.25% trypsin EDTA जोड़ें। 5 मिनट - एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 3 के लिए इनक्यूबेटर में थाली रखें।
  3. 3 मिलीलीटर मध्यम विकास जोड़कर trypsin बेअसर। पिपेट 6 - 8 बार कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए। एक नया 100 मिमी प्लेट को निलंबित सेल के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेते हैं।

2. C2C12 सेल अभिकर्मक / पारगमन और चयन

  1. C2C12 प्लाज्मिड अभिकर्मक
    1. 24 घंटा से पहले अभिकर्मक, पी के लिएदेर से 7.0 x 10 5 C2C12 प्रत्येक अभिकर्मक के लिए एक छह अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से कोशिकाओं।
      नोट: यह 50 की ओर जाता है - अभिकर्मक के समय से 60% संगम।
    2. अभिकर्मक अभिकर्मक कमरे के तापमान का उपयोग करने से पहले आने की अनुमति दें।
    3. प्लास्मिड डीएनए (GFP CUG5 या GFP-CUG200) के 2 माइक्रोग्राम प्रति 200 μl पूर्व गर्म सीरम मुक्त मध्यम और भंवर संक्षेप में जोड़ें। मध्यम करने के लिए 6 μl अभिकर्मक अभिकर्मक जोड़ें और एक भंवर का उपयोग 30 सेकंड के लिए तुरंत मिश्रण। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं।
    4. 2.5 मिलीलीटर सीरम मुक्त विकास मीडिया को C2C12 कोशिकाओं के मीडिया बदलें। ऊष्मायन के बाद कोशिकाओं को अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें। एक 5% सीओ 2, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर प्लेटें लौटें।
    5. 4 घंटे के लिए या रात भर के लिए ऊपर अभिकर्मक मिश्रण / सीरम मुक्त विकास मीडिया में कोशिकाओं रखें। मीडिया अगले दिन वापस विकास मीडिया को बदलने के लिए या जब cytotoxicity स्पष्ट है।
      नोट: cytotoxicity सीई का सूक्ष्म निरीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया हैlls। सेल आकृति विज्ञान और सेल टुकड़ी में परिवर्तन का निरीक्षण करें। जब तक कोई प्रकट cytotoxicity के रूप में वहाँ, सीरम मुक्त विकास मीडिया में रात ऊष्मायन अभिकर्मक को बढ़ाता है।
    6. 1.2 जोड़कर कोशिकाओं अभिकर्मक के बाद 48 घंटा का चयन करें - ~ ​​10 दिनों के लिए 1.6 मिलीग्राम / एमएल G418 जब तक नियंत्रण संस्कृति (plasmids बिना ट्रांसफ़ेक्ट) जीवित कोशिकाओं के पास नहीं है। G418 के साथ पूरक विकास मीडिया के साथ हर दो दिन मीडिया बदलें।
    7. बाद के प्रयोगों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम विकास और 5% सीओ 2 में G418 प्रतिरोधी कोशिकाओं को बनाए रखें।
  2. Retrovirus तैयारी और C2C12 रेट्रोवायरल पारगमन
    1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 2 मिमी एल glutamine के साथ DMEM उच्च ग्लूकोज का सप्लीमेंट द्वारा HEK 293 संस्कृति के माध्यम से तैयार करें।
      1. लगभग 24 घंटा अभिकर्मक के लिए पहले, एक 100 मिमी प्लेट (अभिकर्मक पर 80% संगम) में 4.0 x 10 6 ecotropic HEK 293 आधारित पैकेजिंग कोशिकाओं थाली गontaining सेल संस्कृति के माध्यम से।
    2. अभिकर्मक अभिकर्मक कमरे के तापमान का उपयोग करने से पहले आने की अनुमति दें।
    3. 1 मिलीलीटर सीरम मुक्त मध्यम विकास में मिक्स 15 माइक्रोग्राम प्रति प्लास्मिड डीएनए (pMSCV-Puro या pMSCV-Celf1Flag-Puro)। भंवर संक्षिप्त। कदम 2.2.2 से 30 μl अभिकर्मक अभिकर्मक डीएनए / सीरम मुक्त मध्यम विकास ट्यूब में जोड़ें, और भंवर का उपयोग अच्छी तरह मिला लें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण सेते हैं।
    4. ecotropic HEK 293 आधारित पैकेजिंग कोशिकाओं को अभिकर्मक मिश्रण dropwise जोड़ें। धीरे प्लेटों चक्कर आने और उन्हें वापस लौटने के लिए 5% सीओ 2, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर। 24 घंटे के बाद, 10 मिलीलीटर पूर्व गर्म ताजा मध्यम विकास के लिए मीडिया बदल जाते हैं।
    5. सतह पर तैरनेवाला (युक्त रेट्रोवायरस) एक पिपेट का उपयोग अभिकर्मक के बाद 48 घंटा फसल और एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण। थाली करने के लिए नई गर्म मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें और यह इनक्यूबेटर में लौटने। 4 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर तैरनेवाला रखें।
      नोट: मीडिया के लिए टी धीरे जोड़ा जाता हैवह सेल monolayer बाधित करने के लिए नहीं के रूप में इतनी अच्छी तरह से की तरफ।
    6. अभिकर्मक के बाद सतह पर तैरनेवाला 60 घंटा के दूसरे बैच फसल और 2.2.5 से सतह पर तैरनेवाला के साथ यह पूल। 500 XG, 7 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र सेलुलर मलबे को हटाने के लिए।
    7. एक नया 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण। 2.2.9 या विभाज्य कदम है और भविष्य में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर तैरनेवाला स्टोर करने के लिए आगे बढ़ने से इस बिंदु पर C2C12 कोशिकाओं transduce को रेट्रोवायरस का प्रयोग करें।
    8. कमरे के तापमान पर 2.2.7 से रेट्रोवायरस गला लें, अगर एक जमे हुए शेयर यहाँ प्रयोग किया जाता है।
      नोट: कई फ्रीज पिघलना चक्र से बचें।
    9. संगम के 40% - पारगमन 30 के लिए लक्ष्य के एक ही दिन पर C2C12 कोशिकाओं थाली।
      1. मध्यम विकास त्यागें और 3 मिलीग्राम कमरे के तापमान पीबीएस के साथ C2C12 कोशिकाओं धो लें। पीबीएस निकालें, 500 μl 0.25% trypsin EDTA जोड़ने के लिए, और एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 3 के लिए इनक्यूबेटर में थाली सेते - 5 मिनट।
      2. 3 मिलीग्राम विकास मेड जोड़कर trypsin बेअसरIUM। पिपेट 6 - 8 बार कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए। एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना और एक 60 मिमी प्लेट के लिए 8.0 x 10 5 C2C12 कोशिकाओं जोड़ें।
    10. 0.5 मिलीलीटर रेट्रोवायरस 3 मिलीग्राम विकास मीडिया में कोशिकाओं में से एक 60 मिमी प्लेट को संक्रमित करने के लिए जोड़ें। इनक्यूबेटर थाली लौटें।
    11. संक्रमण के बाद 48 घंटा - 3 मिलीलीटर ताजा चयन एंटीबायोटिक (3 माइक्रोग्राम / एमएल puromycin 1) के साथ पूरक मीडिया के साथ बदलें। ~ 5 दिनों के लिए हर दिन एंटीबायोटिक के साथ 3 मिलीलीटर के माध्यम से बदलें तक untransduced C2C12 नियंत्रण संस्कृति बाहर मर जाता है।
  3. Lentivirus की तैयारी और C2C12 lentiviral पारगमन
    नोट: 2 कैबिनेट जैव सुरक्षा स्तर में सभी lentivirus से संबंधित प्रक्रियाओं का प्रदर्शन और जैविक सुरक्षा दिशा-निर्देशों का पालन करें। तरल अपशिष्ट वायरस युक्त निपटान से पहले विसंक्रमित किया जाना चाहिए।
    1. प्लेट 4.0 x 10 6 293T एक 100 मिमी प्लेट (~ अभिकर्मक के दिन पर 80% संगम) HEK 293 सेल संस्कृति माध्यम (DMEM उच्च ग्लूकोज के साथ में कोशिकाओं, 10% भ्रूण के साथ पूरकगोजातीय सीरम, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 2 मिमी एल glutamine) अभिकर्मक से पहले 24 घंटा।
    2. कमरे के तापमान को अभिकर्मक अभिकर्मक गर्म। lentiviral वैक्टर पैकेजिंग (4 माइक्रोग्राम pMD2.G और 6 माइक्रोग्राम psPAX2) एक साथ 8 माइक्रोग्राम lentiviral वेक्टर हस्तांतरण के साथ मिक्स (Celf1 shRNA या नियंत्रण shRNA तले) 1 मिलीलीटर सीरम मुक्त सेल संस्कृति माध्यम में। भंवर संक्षिप्त।
    3. डीएनए / DMEM ट्यूब के लिए 36 μl पूर्व गर्म अभिकर्मक अभिकर्मक जोड़ें और भंवर से अच्छी तरह मिला लें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण सेते हैं।
    4. इनक्यूबेटर से 293T कोशिकाओं को हटाने और थाली करने के लिए अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें। धीरे थाली चक्कर आने और इसे वापस 5% सीओ 2, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में लौटने। 24 घंटे के बाद, 10 मिलीलीटर ताजा संस्कृति के माध्यम से अभिकर्मक मिश्रण की जगह।
    5. अभिकर्मक के बाद सतह पर तैरनेवाला युक्त lentivirus 48 घंटा लीजिए और यह एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में हस्तांतरण। थाली करने के लिए 10 मिलीलीटर नई गर्म मीडिया जोड़ें और इसे वापसइनक्यूबेटर करने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर तैरनेवाला स्टोर।
    6. अभिकर्मक के बाद सतह पर तैरनेवाला 60 घंटा के दूसरे बैच लीजिए और 2.3.5 से सतह पर तैरनेवाला के साथ गठबंधन। 500 XG, 7 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र संक्षेप।
    7. एक ताजा 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण। ताजा वायरस का उपयोग करते हैं, तो चरण 2.3.9 आगे बढ़ें। भविष्य में उपयोग के लिए, दुकान 10 मिलीलीटर की aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस पर वायरस युक्त सतह पर तैरनेवाला।
    8. कमरे के तापमान पर 2.3.7 से वायरस गला लें उपयोग करने से पहले, यदि एक जमे हुए शेयर प्रयोग किया जाता है।
      नोट: कई फ्रीज पिघलना चक्र से बचें।
    9. प्लेट C2C12-CUG200 कोशिकाओं (धारा 2.1 में प्राप्त) पारगमन के एक ही दिन पर 2.2.9 में वर्णित है।
      नोट: 30 के लिए उद्देश्य - संगम का 40%।
    10. 0.5 मिलीलीटर वायरस C2C12-CUG200 की एक 60 मिमी प्लेट को संक्रमित और इनक्यूबेटर प्लेट वापस करने के लिए जोड़ें।
    11. पारगमन के बाद 72 घंटा - चयन एंटीबायोटिक (3 माइक्रोग्राम / एमएल puromycin 1) के साथ पूरक ताजा मीडिया के साथ संस्कृति के माध्यम से बदलें।चयन एंटीबायोटिक के साथ ताज़ा संस्कृति मीडिया हर रोज ~ 5 दिनों के लिए जब तक सभी untransduced C2C12-CUG200 नियंत्रण संस्कृति बाहर मर जाता है।
    12. GFP-CUG200 ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में Celf1 पछाड़ना सत्यापित करने के लिए पश्चिमी धब्बा का प्रयोग करें।

3. C2C12 सेल भेदभाव

  1. प्लेट भेदभाव की दीक्षा से पहले 2.5 मिलीलीटर विकास मीडिया 24 घंटे में 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं।
    नोट: चढ़ाना घनत्व इतना है कि पूर्ण संगम 24 घंटा में पहुँच जाता है समायोजित किया जा सकता है।
    1. पीबीएस के साथ मिला हुआ कोशिकाओं कुल्ला और कम सीरम भेदभाव माध्यम के 2.5 मिलीलीटर (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 2% घोड़े सीरम के साथ पूरक, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 मिमी एल glutamine, और 1 माइक्रोन इंसुलिन) जोड़ने । मध्यम हर दो दिन बदलें।
      नोट: शेयर इंसुलिन जमे हुए रखें और प्रत्येक मध्यम परिवर्तन पर मीडिया में जोड़ें।
  2. C2C12 भेदभाव के दौरान, क्वान के लिए नमूने एकत्रtitative आरटी पीसीआर (धारा 4 देखें) निम्नलिखित बिंदुओं पर समय: Day0, 1, 2, 4, और 6. प्रक्रिया दिन 6 बजे immunostaining के लिए संस्कृति - 8 (धारा 5 देखें)।

4. शाही सेना अलगाव और मात्रात्मक आरटी पीसीआर

  1. शाही सेना के अलगाव के लिए निर्माता प्रोटोकॉल का प्रयोग करें। अलगाव के बाद, 30 μl RNase मुक्त पानी में शाही सेना गोली resuspend और नीचे कई बार pipet और।
    नोट: नमूने मात्रात्मक आरटी पीसीआर के लिए आगे बढ़ सकते हैं या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  2. मात्रात्मक आरटी पीसीआर 10 के लिए एक आर टी qPCR किट का प्रयोग करें और निर्माता के अनुदेश का पालन करें। 1 टेबल के अनुसार प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें।
अंग मात्रा (μl) अंतिम एकाग्रता
2x प्रतिक्रिया बफर 10 1x
आगे प्राइमर 0.5 200 एनएम
रिवर्स प्राइमर 0.5 200 एनएम
जांच 0.5 200 एनएम
रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और RNase अवरोध करनेवाला 0.1 0.25 यू / मिलीलीटर
खाका 1 100 एनजी कुल शाही सेना
RNase मुक्त पानी 7.4 NA
कुल मिक्स 20

तालिका 1 मात्रात्मक आरटी पीसीआर मास्टर मिक्स तैयारी

  1. थर्मल प्रोफ़ाइल तालिका 2 का उपयोग कर एक 20 μl RT-qPCR प्रतिक्रिया चलाएँ।
रिवर्स प्रतिलेखन कदम 30 मिनट, 48 डिग्री सेल्सियस
डीएनए बहुलकएएसई सक्रियण / रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस निष्क्रियता 10 मिनट, 95 डिग्री सेल्सियस
40 चक्रों 15 सेकंड, 95 डिग्री सेल्सियस
1 मिनट, 60 डिग्री सेल्सियस

तालिका 2 मात्रात्मक आरटी पीसीआर थर्मल प्रोफ़ाइल

5. Immunostaining

  1. 2.5 में monolayer संस्कृति फिक्स हौसले से 10 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde / पीबीएस कमरे के तापमान पर तैयार मिलीलीटर।
  2. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 2.5 मिलीलीटर 0.1% ट्राइटन X-100 / पीबीएस में नमूने Permeabilize।
  3. एक humidified कक्ष के लिए नमूने स्थानांतरण। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए बफर (0.1% nonionic surfactant / पीबीएस, 10% सामान्य बकरी सीरम) अवरुद्ध 2.5 मिलीलीटर नमूने में ब्लॉक।
  4. अवरुद्ध बफर त्यागें और मायोसिन भारी चेन बफर (1: 100) अवरुद्ध में पतला के खिलाफ 800 μl प्राथमिक एंटीबॉडी लागू होते हैं। कमरे के तापमान पर एक humidified कक्ष में रात भर सेते हैं।
  5. प्लेट 3 टिम धोतों 2.5 मिलीलीटर धो बफर 2 दिन (0.1% polysorbate 20 / पीबीएस) के साथ (10 मिनट प्रत्येक)।
  6. धोने बफर निकालें और 800 μl माध्यमिक एंटीबॉडी (बकरी विरोधी माउस आईजीजी, 1: 500 पीबीएस में पतला) लागू होते हैं। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक humidified कक्ष में सेते हैं।
  7. 2.5 मिलीलीटर धो बफर के साथ दो बार (10 मिनट प्रत्येक) को धो लें।
  8. 5 मिनट के लिए 800 μl DAPI (1 माइक्रोग्राम / एमएल, आसुत विआयनीकृत एच 2 ओ में पतला) के साथ सेते हैं।
  9. 10 मिनट के लिए फिर से 2.5 मिलीलीटर धो बफर के साथ धोएं।
  10. 2.5 मिलीलीटर पीबीएस को धोने बफर बदलें और एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग छवियों पर कब्जा करने के लिए।

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Representative Results

C2C12 कोशिकाओं GFP-CUG5 या GFP-CUG200 साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। दवा प्रतिरोध चयन के बाद, स्थिर ताल स्थापित किए गए थे, GFP अभिव्यक्ति (चित्रा 1 ए) द्वारा देखे जा सकते है। विभेदित myoblasts में Myotube गठन भारी श्रृंखला immunostaining 10 (चित्रा 1 बी) मायोसिन द्वारा खोजा गया था। Myotube गठन की मात्रा का ठहराव दिखा दिया है कि संलयन सूचकांक 35.4 ± 4.1% से 2.6 ± 1.1% की कमी हुई थे और myotube क्षेत्रों GFP-CUG200 (चित्रा 1 सी) में असामान्य सीयूजी विस्तार से 2.7 ± 0.8% से 35.6 ± 2.2% से कम है। फ्यूजन सूचकांक और myotube क्षेत्र myotubes (≥ 2 नाभिक) नाभिक की कुल संख्या और कुल छवि क्षेत्र का प्रतिशत क्रमश: myotubes द्वारा कवर से विभाजित में नाभिक की कुल संख्या के माध्यम से गिना रहे थे। वास्तविक समय आरटी पीसीआर 10 मांसपेशी अलग से एक नंबर के लिए अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए आयोजित किया गयाMyod, MyoG, Mef2c और Celf1 सहित iation संबंधित जीन। CUG5 संस्कृतियों की तुलना में, CUG200 भेदभाव की शुरुआत में myoblasts proliferating में Celf1 mRNA की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई। पिछली रिपोर्टों के साथ अनुकूल, Celf1 अपरेगुलेशन myogenic कुपोषण 1 (चित्रा -1) में सीयूजी-विस्तार के साथ जुड़े थे। इसके अलावा, पश्चिमी सोख्ता 10 लगातार दिखाया Celf1 प्रोटीन के स्तर को ऊपर उठाया गया था (चित्रा 1E), और CUG200 भेदभाव (चित्रा -1) के दौरान Myod, MyoG और Mef2c की अभिव्यक्ति हिचकते हैं। इन परिणामों का सुझाव है कि सीयूजी विस्तार दोषों और बिगड़ा myoblast भेदभाव myotube की ओर जाता है।

Myoblast भेदभाव में Celf1 की भूमिका का अध्ययन करने के लिए, pMSCV- Celf1Flag रेट्रोवायरल वेक्टर C2C12 कोशिकाओं transduce करने के लिए निर्माण किया गया था। 10 puromycin प्रतिरोधी क्लोन भेदभाव के अध्ययन के लिए जमा थे। पश्चिमी धब्बा नतीजे बताते हैं कि झंडा-टाgged Celf1 pMSCV-Celf1Flag transduced संस्कृतियों में ही मौजूद था और Celf1 प्रोटीन की अभिव्यक्ति upregulated था (2A चित्रा)। जब नियंत्रण संस्कृतियों (चित्रा 2 बी), जो पता चलता है कि Celf1 की overexpression गंभीर रूप से myoblast भेदभाव को बाधित की तुलना में Celf1-overexpressing कोशिकाओं में myotubes के गठन दुर्लभ है।

Celf1 पछाड़ना सीयूजी विस्तार कोशिकाओं में भेदभाव की कमी को बचाता है, तो यह निर्धारित करने के लिए, Celf1 shRNA lentiviral वैक्टर द्वारा GFP-CUG200 कोशिकाओं को दिया गया था। डबल प्रतिरोधी क्लोन (G418 और puromycin) का चयन किया और भेदभाव के अध्ययन के लिए जमा थे। अंतर्जात Celf1 प्रोटीन के स्तर को स्पष्ट रूप से Celf1 shRNA (चित्रा 3 ए) की उपस्थिति में कम हो गया था। भेदभाव के 6 दिन बाद, myotube गठन बढ़ाने पर Celf1 shRNA का प्रभाव स्पष्ट हो गया था (चित्रा 3 बी)। फ्यूजन सूचकांक और myotube हैंके रूप में 16.1 ± 3.0% और 15.2 ± 1.2%, क्रमशः, 4.6 ± 0.8% और नियंत्रण संस्कृतियों (चित्रा -3 सी) में 5.1 ± 1.3% की तुलना में थे। इस बीच, वास्तविक समय आरटी पीसीआर परिणाम बताते हैं कि Myod, MyoG और Mef2c की अभिव्यक्ति काफी Celf1 shRNA कोशिकाओं (चित्रा 3 डी) Celf1 पछाड़ना बचाया myocyte भेदभाव की कमी के समर्थन में वृद्धि की गई थी।

आकृति 1
चित्रा 1. सीयूजी-विस्तार C2C12 प्रकोष्ठों में myocyte भेदभाव को रोकता है। (ए) C2C12 कोशिकाओं चयन के बाद GFP-CUG5 या GFP-CUG200 सर्वत्र व्यक्त किया। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन कर रहे हैं। यह आंकड़ा हमारे पिछले पेपर 10 से संशोधित किया गया है। (बी) myotubes GFP-CUG5 कोशिकाओं में गठित लेकिन GFP-CUG200 कोशिकाओं में कम थे। Myotubes भारी श्रृंखला (MF-20) immunostaining मायोसिन द्वारा कल्पना थे। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन कर रहे हैं। (सी) (डी) वास्तविक समय Celf1 के आरटी पीसीआर विश्लेषण, प्रतिलेखन myoblast भेदभाव के दौरान Myod, MyoG, और Mef2c अभिव्यक्ति कारकों। mRNA स्तर GAPDH सामान्यीकृत के बाद प्लॉट किए जाते थे। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। छात्र टी परीक्षण नियंत्रण करने के लिए परीक्षण तुलना करने के लिए किया गया था। n> 3, * पी ​​<0.05। (ई) GFP-CUG200 अभिकर्मक वृद्धि हुई Celf1 प्रोटीन अभिव्यक्ति। एसएस actin लोडिंग नियंत्रण के रूप में दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. Celf1 impairs Myoblast भेदभाव की overexpression। (ए) बहिर्जात Celf1Flag Expre का सबूतपश्चिमी धब्बा द्वारा C2C12 कोशिकाओं में ssion। (बी) Myotube गठन Celf1Flag-overexpressing C2C12 myoblasts में बिगड़ा हुआ था। Myotubes MF-20 immunostaining द्वारा कल्पना थे। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. Celf1 आंशिक रूप से बचाता सीयूजी-विस्तार प्रेरित Myoblast भेदभाव की कमी की पछाड़ना। (ए) पश्चिमी धब्बा द्वारा Celf1 पछाड़ना का सबूत। (बी) Celf1 shRNA प्रेरित myotube GFP-CUG200 myoblasts में गठन। Myotubes MF-20 immunostaining द्वारा कल्पना थे। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन। (सी) Celf1 shRNA-बचाया कोशिकाओं है कि संलयन सूचकांक और myotube क्षेत्रों में वृद्धि हुई थी हैं। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। (डी) वास्तविक समय Celf1 के आरटी पीसीआर विश्लेषण, प्रतिलेखन भेदभाव के दौरान Myod, MyoG, और Mef2c अभिव्यक्ति कारकों। mRNA स्तर GAPDH की है कि सामान्य बनाने के बाद साजिश रची गई थी। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। छात्र टी परीक्षण नियंत्रण करने के लिए परीक्षण तुलना करने के लिए किया गया था। n> 3, * पी ​​<0.05। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

C2C12 सेल लाइन myogenesis 11-14 अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है। इन कोशिकाओं को एक fibroblast की तरह देखो बनाए रखने, 20% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त मीडिया में तेजी से पैदा और आसानी से 2% घोड़े सीरम 15 युक्त मीडिया में अलग। तेजी से विकास और भेदभाव एक myogenesis सेल मॉडल में लाभप्रद विशेषताएं हैं। यहाँ, हम प्लाज्मिड, रेट्रोवायरल, और lentiviral वैक्टर का उपयोग C2C12 कोशिकाओं में सीडीएनए, 3'-UTR, और shRNA लागू करने के लिए प्रदर्शित करता है। अभिकर्मक / पारगमन और भेदभाव में निरंतरता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण अंक नीचे डाला जाता है।

दैनिक सेल रखरखाव में सेल घनत्व महत्वपूर्ण है। 70% संगम - इन कोशिकाओं को 50 से नीचे सुसंस्कृत होने की जरूरत है। कम जनसंख्या दुगनी समय के कारण, उच्च संगम (> 70%) C2C12 संस्कृति अनायास जब रात भर के लिए छोड़ दिया differentiates। अनायास विभेदित कोशिकाओं के अंश छोटा हो सकता है, उपस्थितिकी विभेदित कोशिकाओं बाद में भेदभाव प्रयोगों में विसंगतियों के लिए योगदान देगा। इसके अतिरिक्त, हौसले से thawed C2C12 कोशिकाओं है कि कम बीतने संख्या पसंद कर रहे हैं। भेदभाव के लिए, कोशिकाओं पूर्व निर्धारित संख्या को चढ़ाया जाता है ताकि वे 24 घंटे के बाद पूरा संगम तक पहुँचने। इंसुलिन छोटे aliquots में जमे हुए रखा जाता है और हर बार भेदभाव माध्यम बदल गया है जोड़ा जाता है। इन उपायों से भेदभाव परिणामों में सुधार।

सीरम मुक्त माध्यम C2C12 सेल अभिकर्मक को बढ़ाता है। कोशिकाओं अभिकर्मक मिश्रण / सीरम मुक्त मीडिया में रातोंरात incubated जा सकता है। हमारी प्रयोगशाला में, हम 20% अभिकर्मक दर, cytotoxicity के मामूली संकेत के साथ अप करने के लिए प्राप्त करने के। दवा की एकाग्रता C2C12 कक्ष का चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है उच्च, 1.2 करने के लिए 1.6 मिलीग्राम / एमएल G418 या 1 से 3 माइक्रोग्राम / एमएल puromycin, और चयन की अवधि के अधिकांश अन्य सेल लाइनों की तुलना में अब है। उच्च दवा एकाग्रता के तहत संभावित विषाक्तता और बढ़ाया ऊष्मायन अवधि, बहुत कुछ करने वाली बहुत की वजहभेदभाव की क्षमता में भिन्नता उत्पन्न हो सकती है। यह चयन योजना (एकाग्रता और अवधि) सेल उपस्थिति के आधार पर समायोजित करने के लिए और प्रयोग और नियंत्रण समूहों को एक साथ इलाज के लिए महत्वपूर्ण है।

हम सफलतापूर्वक C2C12 कोशिकाओं है कि पुन: पेश 3'-UTR DM1 में सीयूजी विस्तार में GFP-CUG200 शुरू की है। C2C12 कोशिकाओं और Celf1 shRNA में Celf1 परिचय GFP-CUG200 C2C12 कोशिकाओं में Celf1 अपरेगुलेशन और लक्षित कर Celf1 DM1 myoblast भेदभाव, क्रमशः में मदद करने के अन्वेषण से शुरू हो रहा सेलुलर और आणविक घटनाओं के मूल्यांकन की अनुमति दी है। सारांश में, C2C12 myoblast यहाँ प्रस्तुत मॉडल मायोटोनिक कुपोषण के रूप में अच्छी तरह से सामान्य मांसपेशी कोशिका जीव विज्ञान और myogenic भेदभाव की जांच फायदा होता है। इस मॉडल की सीमा यह है कि सेल लाइनों में निष्कर्ष पूरी तरह से जीवों के लिए विस्तार नहीं हो सकता है। वर्तमान मॉडल में निष्कर्ष अक्सर जानवरों से ताजा myoblasts को अलग-थलग करने और उनके differentia का अध्ययन करने के लिए उन्नत कर रहे हैंtion। अंततः हम जीवों में myoblast निष्कर्षों को पुष्ट।

इस अध्ययन की अनूठी ताकत C2C12 myoblasts, जो DM1 में अनुक्रमिक आनुवंशिक / रोग की घटनाओं मॉडलिंग में सक्षम बनाता है बहु स्तरीय जीन में गड़बड़ी है। इससे पहले, डीएमपीके सीयूजी विस्तार की शाही सेना विषाक्तता प्रभाव, myoblasts 11-14 में दर्ज किया गया था, जबकि Celf1 के रोग भूमिकाओं को अलग से माउस मॉडल 16,17 में अध्ययन किया गया। इन अनुक्रमिक आनुवंशिक / रोग की घटनाओं मॉडलिंग तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाली है, तो पशु मॉडल में किया जाता है। जैसा कि इस अध्ययन में प्रदर्शन किया, फ्लोरोसेंट और दवा प्रतिरोधी मार्कर के संयुक्त उपयोग मायोटोनिक कुपोषण में अतिरिक्त आणविक घटनाओं की मॉडलिंग की अनुमति देता है। मॉडल इस अध्ययन में स्थापित DM1 रोगजनन में विस्तृत तंत्र विदारक में उपयोगी होगा। उन्होंने यह भी है कि दवाओं DM1 रोगजनन के विभिन्न चरणों के लक्ष्य के लिए स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी होगी। रणनीतियों और इस की प्रक्रियाओंअध्ययन myoblasts में अन्य मांसपेशियों की बीमारी के मॉडल की स्थापना पर प्रकाश डाला सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose Life Technologies 11965-084 for culture medium
Fetal Bovine Serum - Premium Atlanta Biologicals S11150 for culture medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) Life Technologies 10378-016 for culture medium
Insulin from bovine pancreas Sigma Aldrich I6634-100MG for differentiation medium
equine serum Atlanta Biologicals S12150 for differentiation medium
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311  for transfection
G418 sulfate  Gold Biotechnology  G-418-10 for drug resistant selection
Puromycin dihydrochloride Sigma Aldrich sc-108071 for drug resistant selection
NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well Life Technologies NP0323BOX for western blot
NuPAGE Transfer Buffer (20x) Life Technologies NP00061 for western blot
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) Life Technologies NP0002 for western blot
Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m GE healthcare life science 10600015 for western blot
MF 20 Developmental Hybridoma Bank MF 20 primary Ab for immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate Thermo Fisher Scientific T-862 secondary Ab for immunostaining
One step qRT-PCR MasterMix AnaSpec 05-QPRT-032X for qRT-PCR
TriPure Isolation Reagent Roche 11667165001 for RNA isolation
CUG-BP1 Antibody (3B1) santa cruz sc-20003 primary Ab western blot
Actin Antibody santa cruz sc-1615 goat polyclonal IgG for loading control
293T Ecopack Clontech 631507 cells for retrovirus preparation
pMSCV-puro Clontech 634401 empty retroviral vector for retrovirus preparation
pMSCV-Celf1Flag-puro house-constructed not available retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation
psPAX2 gift from Didier Trono not available for lentivirus preparation
pMD2.G gift from Didier Trono not available for lentivirus preparation
GFP-CUG5 gift from M.S. Mahadevan not available details in reference 10 
GFP- CUG200 gift from M.S. Mahadevan not available details in reference 10 
Triton X-100 Sigma Aldrich X100 for immunostaining
paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 for immunostaining
TWEEN 20 Sigma Aldrich P9416 for immunostaining
DAPI Sigma Aldrich D9542 for immunostaining

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References

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