استهدفت RNA تسلسل الفحص لتحديد خصائص التعبير الجيني والجينوم التعديلات

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Martin, D. P., Miya, J., Reeser, J. W., Roychowdhury, S. Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations. J. Vis. Exp. (114), e54090, doi:10.3791/54090 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

RNA تسلسل (RNAseq) هو أسلوب متعدد الاستعمالات التي يمكن أن تستخدم لكشف وتميز التعبير الجيني، والطفرات، اندماج الجينات، والرنا غير المرمزة noncoding الموجودة. يتطلب معيار RNAseq 30-100٬000٬000 التسلسل يقرأ ويمكن أن تشمل المنتجات RNA متعددة مثل مرنا والرنا غير المرمزة noncoding الموجودة. نحن لشرح كيفية RNAseq استهدافا (التقاط) يسمح دراسة مركزة على المنتجات RNA المحدد باستخدام المنظم سطح المكتب. القبض على RNAseq يمكن توصيف النصوص غير المشروحة، منخفضة، أو التعبير عابر التي قد لا تكتشف بطريقة أخرى باستخدام أساليب RNAseq التقليدية. نحن هنا وصف استخراج الحمض النووي الريبي من خطوط الخلايا، واستنزاف الحمض النووي الريبي الريباسي، والتوليف [كدنا]، وإعداد مكتبات barcoded والتهجين والتقاط النصوص المستهدفة وتسلسل تعدد الإرسال على المنظم سطح المكتب. نحن أيضا الخطوط العريضة للخط أنابيب التحليل الحسابي، والذي يتضمن تقييم ومراقبة الجودة، والمحاذاة، والكشف عن الانصهار، وتحديد الجينات وتحديد مجلس التوحيد الوطنى واحدالمتغيرات leotide. هذا الاختبار يسمح لتسلسل النص المستهدف لتوصيف التعبير الجيني، اندماج الجينات، والطفرات.

Protocol

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول تجهيز وقت واحد وتحليل أربع عينات. هذا الأسلوب هو متوافق مع الحمض النووي الريبي معزولة عن الخلايا والأنسجة المجمدة الطازجة والأنسجة الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE). يبدأ هذا البروتوكول مع 50 - 1000 نانوغرام (250 نانوغرام موصى به) بدء إدخال الحمض النووي الريبي لكل عينة.

1. الريباسي استنفاد والتفتت الداخلي RNA

  1. الريباسي استنفاد
    1. إزالة أزل، رئيس الوزراء، مزيج جزء، مزيج إزالة الريباسي، العازلة ملزمة الريباسي وعازلة إعادة تعليق من -20 درجة مئوية، وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. إزالة شطف العازلة، الخرز إزالة الريباسي وRNA / [كدنا الخرز ممغطس محددة من 4 درجات مئوية وتقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. إضافة 0.25 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لأنبوب PCR. تخفيف الحمض النووي الريبي مجموع مع nuclease خالية من المياه نقي للغاية إلى الحجم النهائي ما مجموعه 10 ميكرولتر. إضافة 5 ميكرولتر من العازلة ملزمة الريباسي إلى كل أنبوب ثم إضافة 5 ميكرولتر من مزيج إزالة الريباسي وبلطف pipettالبريد صعودا وهبوطا إلى المزيج. أنابيب مكان في cycler الحرارية مع غطاء قبل تسخينها إلى 100 درجة مئوية، وبرنامج cycler الحرارية إلى 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتفسد الحمض النووي الريبي.
    3. بعد تمسخ RNA، وإزالة الأنابيب من cycler الحرارية واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. دوامة الريباسي أنبوب إزالة حبة بقوة ل resuspend الخرز. إضافة 35 ميكرولتر من الخرز إزالة الريباسي إلى أنابيب جديدة ونقل رد فعل RNA تمسخ (20 ميكرولتر) لأنابيب تحتوي حبات إزالة الريباسي.
    4. ضبط ماصة 45 ميكرولتر وماصة بسرعة صعودا وهبوطا 20x وخلط. احتضان الأنابيب عند RT لمدة 1 دقيقة. ثم ضع الأنابيب في الوقوف المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. نقل طاف لأنابيب PCR المسمى حديثا ووضع هذه الأنابيب مرة أخرى في موقف المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. وهذا يضمن عدم نقل أي الخرز. نقل طاف لأنابيب PCR المسمى حديثا.
    5. دوامة RNA / [كدنا الخرز ممغطس محددة وإضافة 99 ميكرولتر من الخرز إلى كل أنبوب. بلطف كامل ماصةحجم صعودا وهبوطا 10X إلى المزيج. إذا بدءا من تدهور الحمض النووي الريبي، إضافة 193 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي تمتزج جيدا / [كدنا الخرز ممغطس محددة لكل أنبوب. في احتضان RT لمدة 15 دقيقة. ثم وضع أنابيب على الوقوف المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. إزالة والتخلص من supernatants.
    6. إضافة 200 ميكرولتر من الطازجة الإيثانول 70٪ (ETOH). إبقاء الأنابيب على الوقوف المغناطيسي والحرص على عدم تعكير صفو الخرز. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية، ثم إزالة وتجاهل طاف. السماح للأنابيب على الوقوف في درجة حرارة الغرفة ل5-10 دقيقة حتى يجف.
    7. إذابة الطرد المركزي غرفة عازلة الحرارة شطف في 600 × ز لمدة 5 ثوان. إضافة 11 ميكرولتر من شطف العازلة لكل أنبوب وماصة بلطف صعودا ونزولا 10X إلى المزيج. احتضان الأنابيب عند RT لمدة 2 دقيقة. وضع أنابيب على الوقوف المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. نقل 8.5 ميكرولتر من طاف لأنابيب PCR المسمى حديثا.
  2. تجزئة الريباسي المنضب RNA
    1. إضافة 8.5 ميكرولتر ايليوت، 8.5 ميكرولتر رئيس الوزراء، و 8.5 مزيج جزء ميكرولتر إلى كل أنبوب. ماصة بلطف صعودا ونزولا 10X إلى المزيج. أنابيب مكان في cycler الحرارية مع البرنامج التالي: غطاء ما قبل تسخينها إلى 100 درجة مئوية و 94 درجة مئوية لمدة 8 دقائق، ثم 4 درجات مئوية الانتظار.
      ملاحظة: تم تصميم هذه الخطوة لتوليد متوسط ​​حجم إدراج 155 شركة بريتيش بتروليوم. إذا كان متوسط ​​حجم جزء من عينة الحمض النووي الريبي هو أقل من 200 سنة مضت، تخطي هذه الخطوة، والشروع في ستراند الأولى كدنا] التجميعي.

2. كدنا] التجميعي

  1. تجميع ستراند الأولى كدنا]
    1. إزالة أول مزيج التوليف حبلا من -20 درجة مئوية، وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة.
    2. قبل برنامج cycler الحرارية مع الإعدادات التالية: الخيار الغطاء قبل الحرارة وتعيين إلى 100 درجة مئوية، ثم 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، و 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وعقد في 4 درجات مئوية . حفظ هذا البرنامج بأنه "توليف 1 شارع ستراند".
    3. أجهزة الطرد المركزي أنبوب إذابة والعشرين مزيج التوليف حبلا في 600 & #215؛ ز لمدة 5 ثوان. مزيج 1 ميكرولتر عكس الناسخ مع 9 ميكرولتر من أول مزيج التوليف حبلا.
    4. إضافة 8 ميكرولتر من التوليف حبلا الأول وعكس مزيج الناسخ لكل أنبوب، ماصة بلطف صعودا وهبوطا 6X إلى المزيج. أنابيب الطرد المركزي لمدة 4 ثانية باستخدام سرعة ثابتة الطاولة مصغرة الطرد المركزي في 6.0 x ج لجلب السائل إلى أسفل. وضع الأنابيب في cycler الحرارية وتحديد توليف 1 شارع ستراند. عندما يصل cycler الحرارية 4 درجات مئوية، وإزالة الأنابيب والشروع فورا في توليف الثانية ستراند كدنا].
  2. توليف الثانية ستراند [كدنا
    1. قبل الحرارة cycler الحرارية إلى 16 درجة مئوية مع غطاء قبل تسخينها إلى 30 درجة مئوية. ذوبان الثاني مزيج حبلا الماجستير وعازلة اعادة تعليق على الجليد. مقدما، وإزالة زجاجة من الخرز ممغطس من 4 درجات مئوية، واسمحوا الوقوف لمدة 30 دقيقة على الأقل لتقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. إضافة 5 ميكرولتر من العازلة إعادة تعليق لكل أنبوب PCR. الثاني مزيج الرئيسي حبلا أجهزة الطرد المركزي في 600× ز لمدة 5 ثوانى وإضافة 20 ميكرولتر إلى كل أنبوب PCR. أنابيب مكان في cycler الحرارية قبل ساخنة في 16 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. عند اكتمال الحضانة، وإزالة من cycler الحرارية والسماح أنابيب أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة.
    3. دوامة الخرز ممغطس حتى ينتشر بشكل جيد. إضافة 90 ميكرولتر من الخرز ممغطس مختلطة جيدا إلى كل أنبوب. ماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X إلى المزيج. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أنابيب مكان على الوقوف المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    4. إزالة والتخلص 135 ميكرولتر من طاف ثم ترك أنابيب على الوقوف المغناطيسي لإجراء غسيل ETOH. إضافة 200 ميكرولتر الطازجة 80٪ ETOH إلى كل أنبوب من دون إزعاج الخرز، ثم يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية. إزالة وتجاهل كل من طاف من كل. كرر ما مجموعه اثنين من 80٪ يغسل ETOH.
    5. السماح أنابيب تقف في درجة حرارة الغرفة ل5-10 دقائق حتى يجف على الوقوف المغناطيسي. أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة إذابةالعازلة إعادة تعليق ه في 600 × ز لمدة 5 ثوان. إزالة أنابيب PCR من الوقوف المغناطيسي. إضافة 17.5 العازلة إعادة تعليق ميكرولتر إلى كل أنبوب PCR وماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X لتخلط جيدا. احتضان الأنابيب لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    6. أنابيب مكان على الوقوف المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، ثم نقل 15 ميكرولتر طاف (مزدوجة تقطعت بهم السبل [كدنا) إلى 0.2 مل أنابيب الشريط PCR.
      ملاحظة: هذا هو نقطة توقف آمنة كما يمكن تخزين [كدنا] في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام.

3. إعداد مكتبة

  1. ينتهي محلقة 3 "
    1. إزالة المخلفات A-مزيج من -20 درجة مئوية، وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. قبل برنامج cycler الحرارية مع الإعدادات التالية: اختيار الخيار الغطاء قبل الحرارة وتعيين إلى 100 درجة مئوية، ثم وضعت في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، و 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وعقد في 4 درجات مئوية. حفظ هذا البرنامج بأنه "ATAIL70."
    2. إضافة 2.5 ميكرولتر من إعادة تعليقالعازلة إلى كل أنبوب. ثم إضافة 12.5 ميكرولتر من مزيج إذابة-المخلفات A. ماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X لتخلط جيدا. وضع أنابيب في cycler الحرارية وتحديد ATAIL70. عندما تكون درجة الحرارة cycler الحرارية هي في 4 درجات مئوية، وإزالة أنابيب PCR من cycler الحرارية والشروع فورا في ligate المحولات.
  2. محولات Ligate
    1. إزالة أنابيب محول RNA المناسبة، ووقف عازلة ربط وعازلة إعادة تعليق من -20 درجة مئوية، وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. لا تقم بإزالة أنبوب مزيج ربط من -20 درجة مئوية حتى تعليمات للقيام بذلك في البروتوكول. إزالة زجاجة من الخرز ممغطس من 4 درجات مئوية، واسمحوا الوقوف لمدة 30 دقيقة على الأقل لتحقيق درجة حرارة الغرفة.
    2. قبل تسخين cycler الحرارية إلى 30 درجة مئوية، واختيار الخيار الغطاء قبل الحرارة وتعيين إلى 100 درجة مئوية. أنابيب الطرد المركزي محول RNA إذابة في 600 × ز لمدة 5 ثوان. مباشرة قبل الاستعمال، وإزالة أنبوب مزيج ربط من -20 ° Cتخزين.
    3. إضافة 2.5 ميكرولتر من العازلة إعادة تعليق لكل أنبوب العينة. إضافة 2.5 ميكرولتر من مزيج ربط. إعادة أنبوب مزيج ربط إلى -20 درجة مئوية التخزين فورا بعد الاستعمال. إضافة 2.5 ميكرولتر من مؤشر محول RNA إذابة لكل أنبوب العينة. ماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X لتخلط جيدا.
    4. أنابيب الطرد المركزي لمدة 4 ثانية باستخدام سرعة ثابتة مصغرة الطاولة أجهزة الطرد المركزي في 6.0 ز س. أنابيب مكان في cycler الحرارية قبل ساخنة. إغلاق الغطاء واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    5. إزالة الأنابيب من cycler الحرارية وإضافة 5 ميكرولتر من العازلة ربط المحطة إلى كل أنبوب لإبطال نشاط ربط. ماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X لتخلط جيدا.
    6. غسل كرر كما هو موضح في 2.2.3 - 2.2.4، وذلك باستخدام 42 ميكرولتر من الخرز ممغطس المختلطة، ونبذ 79.5 طاف ميكرولتر. مع أنابيب على الوقوف المغناطيسي، والسماح للعينات الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة ل5-10 دقيقة.
    7. إزالة أنابيب الشريط PCR منالوقوف المغناطيسي وإضافة العازلة إعادة تعليق 52.5 ميكرولتر إلى كل أنبوب. ماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X لتخلط جيدا. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. وضع أنابيب على الوقوف المغناطيسي في RT لمدة 5 دقائق أو حتى السائل واضح. نقل 50 ميكرولتر من طاف من كل أنبوب إلى الجديدة 0.2 مل أنابيب الشريط PCR. الحرص على عدم تعكير صفو الخرز.
    8. غسل كرر كما هو موضح في 2.2.3 - 2.2.4، وذلك باستخدام 50 ميكرولتر من الخرز ممغطس المختلطة، ونبذ 95 طاف ميكرولتر. مع أنابيب على الوقوف المغناطيسي، والسماح للعينات الهواء الجاف على RT لمدة 5-10 دقائق.
    9. إزالة أنابيب الشريط PCR من الوقوف المغناطيسي وإضافة العازلة إعادة تعليق 22.5 ميكرولتر إلى كل أنبوب. ماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X لتخلط جيدا.
    10. احتضان الأنابيب في RT لمدة 2 دقيقة. وضع أنابيب على الوقوف المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق أو حتى السائل واضح. نقل 20 ميكرولتر طاف من كل أنبوب لجديد 0.2 مل أنبوب الشريط PCR. الحرص على عدم تعكير صفو الخرز. وهذا هو نقطة توقف آمنة وكدنا] يمكن تخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام.

4. مكتبة التضخيم

  1. نمي شظايا الحمض النووي
    1. إزالة مزيج PCR الماجستير، PCR التمهيدي كوكتيل وعازلة إعادة تعليق من -20 ° C تخزين وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. إزالة زجاجة من الخرز ممغطس من 4 درجات مئوية التخزين واسمحوا الوقوف لمدة 30 دقيقة على الأقل لتحقيق درجة حرارة الغرفة.
    2. قبل برنامج cycler الحرارية مع الإعدادات التالية: اختيار الخيار الغطاء قبل الحرارة وتعيين إلى 100 درجة مئوية، ثم تعيين تمسخ الأولي في 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 15 دورات تمسخ في 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، والصلب في 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، والإرشاد عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، ودورة واحدة تمديد النهائية في 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وعقد في 4 درجات مئوية. حفظ هذا البرنامج بأنه "PCR".
    3. الطرد المركزي PCR سيد إذابةمزيج الاشعال PCR أنابيب في 600 × ز لمدة 5 ثوان. إضافة 5 ميكرولتر من التمهيدي PCR إذابة لكل أنبوب العينة. إضافة 25 ميكرولتر من مزيج الرئيسي PCR إذابة لكل أنبوب العينة. ماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X لتخلط جيدا.
    4. ضع توج PCR أنابيب الشريط في cycler الحرارية مبرمجة مسبقا. إغلاق الغطاء وبرنامج PCR تشغيل. عند اكتمال PCR، وإزالة الأنابيب من cycler الحرارية والحفاظ على الجليد.
    5. غسل كرر كما هو موضح في 2.2.3 - 2.2.4، وذلك باستخدام 50 ميكرولتر من الخرز ممغطس المختلطة، ونبذ 95 طاف ميكرولتر. مع أنابيب على الوقوف المغناطيسي، والسماح للعينات الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة ل5-10 دقيقة.
    6. إزالة الأنابيب من الوقوف المغناطيسي وإضافة العازلة إعادة تعليق 32.5 ميكرولتر إلى كل أنبوب العينة. ماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X لتخلط جيدا. في احتضان RT لمدة 2 دقيقة. وضع أنابيب PCR على الوقوف المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق أو حتى السائل واضح. ثم نقل 30 ميكرولتر سوpernatant إلى الطازجة 0.2 مل أنابيب PCR.
    7. أداء الكمي لكدنا] باستخدام مقياس التألق 7 و تحديد نوعية كدنا] باستخدام نظام الكهربائي الشعرية 8.
      ملاحظة: هذا هو نقطة توقف آمنة وكدنا] يمكن تخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام. ملاحظة: تعتبر هذه المكتبة مكتبة RNAseq.
      خطوات لاحقة تؤدي إلى مكتبة التقاط.

5. التهجين، لقطة وتسلسلها

  1. التهجين المضاعفة
    1. إزالة تحقيقات رطب العرف وكوت-1 الحمض النووي، oligos حجب العالمية، ومحول oligos منع محددة من -20 درجة مئوية، وذوبان الجليد على الجليد.
    2. في منخفض ربط أنبوب 1.5 مل، والجمع بين 500 نانوغرام الحمض النووي (125 نانوغرام لكل عينة عندما مضاعفة 4 عينات)، 5 ميكرولتر كوت-1 الحمض النووي (1 ميكروغرام / ميكرولتر)، 1UL oligos حجب العالمية، P7 ​​0.5 ميكرولتر (6 النوكليوتيدات) محول محدد حجب oligos (قد تحتاج هذا المبلغ إلى تعديل تبعا conditi تعدد الإرسالإضافات) وP7 0.5 ميكرولتر (8 النوكليوتيدات) محول oligos حجب محددة (قد تحتاج إلى تعديل تبعا للظروف متعددة) هذا المبلغ.
    3. وضع أنبوب عينة في المكثف فراغ مع غطاء مفتوحة تواجه الاتجاه المعاكس لدوران. محتويات الجافة في 45 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة أو حتى التبخر الكامل للسائل.
    4. و resuspend محتوى المجففة مع 8.5 ميكرولتر 2X العازلة التهجين، 3.4 ميكرولتر عنصر التهجين وو 1.1 نوكلياز ميكرولتر المياه مجانا. سماح 10 دقيقة لإعادة تعليق ودوامة كل 2.5 دقيقة. نقل معلق والمواد إلى 0.2 مل أنبوب PCR واحتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على cycler الحرارية.
    5. إزالة التهجين أنبوب عينة من cycler الحرارية وإضافة 2 ميكرولتر من تحقيقات مخصصة معلق عند تركيز 1.5 بمول / ميكرولتر. بدلا من ذلك، إضافة 4 ميكرولتر من تحقيقات مخصصة معلق بتركيز 0.75 بمول / ميكرولتر. احتضان رد فعل التهجين بين عشية وضحاها (16-24 ساعة) عند 65 درجة مئوية.
      ملاحظة: مسبارالصورة التي تم شراؤها من مختلف الباعة يمكن استخدامها ويجب اتباع تعليمات الشركة الصانعة. مدة خطوة التهجين قد تختلف أيضا.
  2. إعداد حبة والتقاط
    1. إزالة زجاجة من الخرز ممغطس يقترن streptavidin من 4 درجات مئوية، وتتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. تمييع 10X غسل المخازن (الأول والثاني والثالث، وصرامة) و2.5x و الخرزة الاحتياطي اغسل لإيجاد حلول عمل 1X.
    2. قسامة 140 ميكرولتر من غسل العازلة 1X أنا في لأنبوب 1.5 مل الطازجة. كمية الحرارة كامل من 1X عازلة صرامة وقسامة من غسل العازلة 1X أنا عند 65 درجة مئوية في كتلة الحرارة لمدة لا تقل عن 2 ساعة.
    3. قسامة 100 ميكرولتر من الخرز ممغطس يقترن streptavidin في القبض في أنبوب 1.5 مل. وضع على المغناطيس وتجاهل طاف. إضافة 200 ميكرولتر غسل العازلة حبة لكل 100 حبات ميكرولتر ودوامة لمدة 10 ثانية. وضع على جذب لل2-5 دقائق أو حتى طاف هو واضح. مرة واحدة طاف هو واضح، تخلص منه وإعادةالجفت مرة أخرى ليصبح المجموع اثنان يغسل.
    4. بعد إزالة غسل العازلة حبة، إضافة يساوي حجم غسل العازلة كما حبة حجم الانطلاق الأولي (أي 100 ميكرولتر لالتقاط واحد). و resuspend ونقل إلى 0.2 مل أنبوب PCR. وضع أنبوب في الرف المغناطيسي ل2-5 دقائق أو حتى طاف هو واضح. طاف تجاهل.
    5. مع كل من العينة التهجين والخرز في cycler الحرارية عند 65 درجة مئوية، ونقل مزيج التهجين إلى أنبوب حبة وماصة صعودا وهبوطا 10X إلى المزيج. احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، دوامة وتدور باستمرار عينة لمدة 4 ثانية باستخدام سرعة ثابتة (6.0 x ج) فوق المنضدة الطرد المركزي صغيرة.
  3. حبة غسل
    1. إزالة أنبوب من القبض على cycler الحرارية وإضافة 100 ميكرولتر قبل ساخنة 1X الاحتياطي اغسل الأول للأنبوب ودوامة لمدة 10 ثانية إلى المزيج. نقل الخليط إلى أدنى مستوى ربط أنبوب 1.5 مل الطازجة. وضع أنبوب في رفوف الفصل المغناطيسي والسماح 2-5 دقيقة لفصل أو حتى طاف هو واضح. دطاف iscard.
    2. إضافة 200 ميكرولتر مسخن غسل العازلة صرامة 1X وماصة صعودا وهبوطا 10 مرات لخلط. احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. وضع أنبوب في رف الفصل المغناطيسي والسماح 2-3 دقيقة لفصل أو حتى طاف هو واضح. طاف تجاهل. تكرار غسل صرامة مرة أخرى ليصبح المجموع اثنان يغسل.
    3. إضافة 200 غرفة ميكرولتر 1X درجة حرارة غسل عازلة الأول ودوامة لمدة 2 دقيقة لخلط. وضع أنبوب في رف الفصل المغناطيسي والسماح 2-5 دقيقة لفصل أو حتى طاف هو واضح. طاف تجاهل.
    4. إضافة 200 ميكرولتر 1X درجة حرارة الغرفة العازلة غسل الثاني ودوامة لمدة 1 دقيقة لخلط. وضع أنبوب في رف الفصل المغناطيسي والسماح 2-5 دقيقة لفصل أو حتى طاف هو واضح. طاف تجاهل.
    5. إضافة 200 ميكرولتر 1X درجة حرارة الغرفة العازلة غسل الثالث ودوامة لمدة 30 ثانية إلى المزيج. وضع أنبوب في رف الفصل المغناطيسي السماح 2-5 دقيقة لفصل أو حتى طافواضح. طاف تجاهل.
    6. إزالة أنبوب من رف الفصل المغناطيسي وإضافة 20 ميكرولتر nuclease خالية من المياه ل resuspend الخرز. مزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا 10 مرات.
  4. لقطة بعد PCR التضخيم
    1. إزالة الخرز ممغطس من 4 درجات مئوية، وتتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    2. إزالة بداية ساخنة PCR للخرسانة الجاهزة (2X) وPCR التمهيدي مزيج من -20 درجة مئوية، وذوبان الجليد في RT ثم وضع على الجليد. إعداد مكتبة التضخيم ميكس ماستر من خلال الجمع بين 27.5 ميكرولتر من 2X بداية ساخنة PCR للخرسانة الجاهزة مع 2.75 ميكرولتر من PCR التمهيدي 1 و 2.75 ميكرولتر من PCR التمهيدي 2 (هذه الكميات هي لمكتبة التهجين 1 بالإضافة إلى 10٪ زيادة).
    3. إعداد رد الفعل في أنبوب PCR وذلك بإضافة 20 ميكرولتر من الخرز بالاضافة الى الحمض النووي التي تم التقاطها باستخدام 30 ميكرولتر من مزيج الرئيسي التضخيم مكتبة لحجم ما مجموعه 50 ميكرولتر. أنبوب الغطاء بشكل صحيح ودوامة لخلط. أنابيب الطرد المركزي لمدة 4 ثانية باستخدام علامة التبويب مصغرة سرعة ثابتةلو أعلى الطرد المركزي في 6.0 ز س.
      1. إعداد برنامج PCR التالية: اختيار الخيار الغطاء قبل الحرارة وتعيين إلى 100 درجة مئوية، ثم تعيين تمسخ الأولي في 98 درجة مئوية لمدة 45 ثانية، 10 - 12 دورات من تمسخ في 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، والصلب في 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية والإرشاد عند 72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية، ودورة واحدة النهائية تمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية، وعقد في 4 درجات مئوية.
    4. إزالة عينة من thermocycler وإضافة 75 ميكرولتر الخرز ممغطس. تخلط جيدا واحتضان في RT لمدة 15 دقيقة.
    5. وضع أنابيب على المغناطيس في درجة حرارة الغرفة ل2-3 دقيقة ثم إزالة طاف. تغسل حبات على المغناطيس وذلك بإضافة 200 ميكرولتر 80٪ إيثانول، احتضان لمدة 30 ثانية ثم إزالة طاف. كرر ما مجموعه اثنين من 80٪ يغسل.
    6. في احتضان RT ل5-10 دقائق للسماح حبات لتجف. لا تجف لأكثر من التشقق. حبات Resuspend في 22 ميكرولتر من تريس، EDTA ودرجة الحموضة 8.0 (1X TE الحل) والسماح 3 دقائق لشطف. ضع العينة على المغناطيس لمدة 3 - 5 دقائق عشرأون نقل 20 ميكرولتر من الناتج مزال ل-ربط منخفضة 1.5 مل أنبوب جديد، وضمان عدم الخرز وترحيلها.
    7. أداء الكمي لكدنا] استولت باستخدام التألق 7 و تحديد نوعية القبض على كدنا] باستخدام نظام الكهربائي الشعرية 8.
  5. التسلسل سطح المكتب تحميل الإجراءات 9
    1. تمييع القبض مكتبة [كدنا إلى تركيز النهائي من 4 نانومتر باستخدام 10 ملي تريس، الكلور ودرجة الحموضة 8.5 مع 0.1٪ توين 20. الذوبان 10 N هيدروكسيد الصوديوم وعازلة تهجين على الجليد. ما يقرب من 30 دقيقة قبل الاستخدام، المنظم سطح المكتب V2 كاشف عدة مربع 1 في الماء RT ذوبان الجليد. لا تملأ فوق MAX FILL خط 10. يرجى ملاحظة هذا هو منبر تسلسل إجراءات محددة ويمكن أن تختلف وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. إعداد 1ml من 0.2 هيدروكسيد الصوديوم N من خلال الجمع بين 20 ميكرولتر 10 N هيدروكسيد الصوديوم مع 980 نوكلياز ميكرولتر المياه مجانا في أنبوب microcentrifuge (إعداد دائما الطازجة). تمييع مكتبة PhiX (مراقبة المكتبات) إلى 4 نانومتر من قبلالجمع بين 2 ميكرولتر من 10 المراقبة مكتبة نانومتر مع 3 ميكرولتر 10MM تريس الكلورين ودرجة الحموضة 8.5 مع 0.1٪ توين 20.
    3. تفسد مكتبة النهائية والتحكم مكتبة من خلال الجمع بين 5 ميكرولتر من مكتبة 4nM مع 5 ميكرولتر من 0.2 N هيدروكسيد الصوديوم ودوامة لفترة وجيزة إلى المزيج. أنابيب الطرد المركزي لمدة 4 ثانية باستخدام سرعة ثابتة مصغرة فوق المنضدة الطرد المركزي في 6.0 ز س. في احتضان RT لمدة 5 دقائق لتفسد المكتبات.
    4. إضافة 990 ميكرولتر من العازلة التهجين قبل المبردة للأنابيب تحتوي على 10 ميكرولتر من المكتبات التشويه والتحريف. وهذا يؤدي إلى مكتبة 20 مساء. مارك التشويه والتحريف مكتبة 20 مساء مع التاريخ، ويمكن تخزينها لمدة تصل إلى 3 أسابيع عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    5. مزيج 375 ميكرولتر من السيطرة المكتبة 20 مساء مع 225 ميكرولتر من العازلة التهجين قبل المبردة وتضعف سيطرة مكتبة أن يؤدي إلى سيطرة مكتبة 12:05. عكس عدة مرات لخلط الحل.
    6. الجمع بين 594 ميكرولتر من مكتبة النهائية التشويه والتحريف مع 6 ميكرولتر من 12:05 السيطرة مكتبة التشويه والتحريف ودوامة لخلط. تعيين عصيدة جنبا إلى جنبمكتبة جنيه والسيطرة مكتبة جانبا على الجليد حتى عينات جاهزة للتحميل في خرطوشة كاشف المنظم سطح المكتب.

تحليل 6. البيانات

  1. تقييم تسلسل الجودة
    1. حساب نوعية البيانات تسلسل الخام (ملفات fastq) باستخدام تسلسل تقييم الجودة 11.
      ملاحظة: هذه الخطوة تساعد على تقييم البيانات قبل أن يتم تعرضوا للتحليل المصب. البرنامج يعمل مع المعلمات في الصنع وتنتج مجموعة من المقاييس لكل ملف fastq.
  2. المحاذاة
    1. محاذاة تسلسل يقرأ (ملفات fastq) إلى hg19 الجينوم إشارة البشرية وTranscriptome على استخدام Tophat2 12 (الإصدار 2.0.10) في الوقت الذي توفر النصوص المعروفة باسم ملف GTF. الإخراج هو في شكل تنسيق محاذاة ثنائي يسمى ملف BAM.
    2. تنفيذ معالجة الخطوات آخر بما في ذلك فرز وفهرسة باستخدام Samtools 13 (الإصدار 0.1.19) على ملف BAM. أداء مكررة علامات وإعادة ترتيب SAM، إدراج حساب حجم وإضافة أو استبدال مجموعة قراءة باستخدام أدوات بيكار 14 (الإصدار 1.84).
  3. تقييم جودة RNAseq
    1. حساب سلسلة من المقاييس ومراقبة الجودة للبيانات RNAseq باستخدام تقييم جودة RNAseq. والإسهام في هذا البرنامج هو ملف BAM 15 من محاذاة Tophat2. الإخراج هو ملف HTML الذي يسرد العدد الكلي للقراءة، مكررة، تعيين قراءة نسبة ونسبة الريباسي، وما إلى ذلك، من بين أمور أخرى.
  4. الدعوة البديل
    1. استخدام STAR (نسخة 2.4.0) 16 للمحاذاة ومن ثم استدعاء النووية المنفردة المتغيرات باستخدام GATK ل(النسخة 3،3-0) HaplotypeCaller 17 .Follow GATK BAM خطوات مرحلة ما بعد المعالجة ومعايير الترشيح للعلم وإزالة ايجابيات كاذبة من الإخراج.
  5. التعبير الجيني
    1. حساب التعبير الجيني باليودبرنامج نانوغرام أزرار أكمام (الإصدار 2.1.1) من سهرة جناح 18.
      ملاحظة: إدخال ملف BAM من أداة المحاذاة Tophat2. يتم إنتاج الانتاج على مستوى الإسوي، الجينات ونسخة، حيث يتم احتساب التعبير FPKM (شظايا في كيلو قاعدة لكل مليون المعينة يقرأ).
  6. الانصهار الدعوة
    1. استدعاء اندماج من كل عينة باستخدام ChimeraScan 19 (الإصدار 0.4.5)، Tophat فيوجن 20 العرف وTRUP 21. علق اندماج للنطاقات باستخدام Oncofuse 22 (الإصدار 1.0.9b2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد الخطوات الرئيسية التخطيطي تسليط الضوء في التقاط RNAseq في الشكل 1. واستخدمت أربعة خطوط الخلايا السرطانية مع الطفرات المعروفة لإثبات فعالية تقنية RNAseq القبض على (K562 مع ABL1 الانصهار، LC2 مع الانصهار RET، EOL1 مع PDGFRalpha الانصهار وRT- 4 مع FGFR3 الانصهار). وكان يتم تجميع العينات الأربع معا، والتسلسل مع 2X يقرأ 100 نقطة أساس على المنظم سطح المكتب، والذي يولد ملفات FASTQ. تم تشغيل ملفات FASTQ من خلال خط أنابيب تحليل RNAseq، التي تضم خمسة عناصر رئيسية هي: 1) تقييم ومراقبة الجودة، 2) التخطيط لTranscriptome على الإنسان، 3) الكمي التعبير الجيني، 4) الدعوة الانصهار، و5) الدعوة البديل. يتم استخدام ملف المحاذاة (BAM) لاستدعاء المتغيرات النووية المنفردة وحساب التعبير الجيني. ودعا اندماج باستخدام المتصلين الانصهار، مثل فيوجن TopHat (أداء المحاذاة الخاصة) وحواشي إخراج النقيبز برنامج الكشف عن الانصهار.

مقارنة في التعبير الجيني من RNAseq والتقاط توضح إثراء النصوص المستهدفة بنسبة 10 إلى 1000 أضعاف باستخدام طريقة القبض على (الشكل 2A). بالإضافة إلى ذلك، ويبين الشكل 2B زيادة في المئة من يقرأ رسم الخرائط للمناطق المستهدفة نسخة باستخدام التقاط مقارنة RNAseq. ويمثل تقييم تدابير مراقبة الجودة في الشكل (3). التقاط وRNAseq أداء على قدم المساواة من حيث محاذاة إلى Transcriptome على (3A، 94٪ مقابل 93٪) ويعني إدراج حجم (3B، 174 نقطة أساس مقابل 162 نقطة أساس). باستخدام طريقة التقاط، والتسلسل نسبة أعلى من المناطق exonic (3C، 77٪ مقابل 60٪)، وعلى العكس من نسبة أقل من المناطق intronic والتسلسل (3D،مقابل 20٪). وصفت العدد الكلى للقراءة لكل عينة في 3E (3F، 4٪ مقابل 15٪).

يتم إنشاء الناتج كشف الانصهار هو مبين في الجدول رقم 1 مع الانصهار تطبيع دعم يقرأ. التقاط كان RNAseq نجاحها في الكشف عن اندماج لجميع خطوط الخلايا الأربعة. يتم عرض المقارنة بين المتغيرات النوكليوتيدات واحدة تسمى في تداخل مناطق التقاط وRNAseq في الشكل (4). وهذا يدل على التوافق عالية من المتغيرات بين لقطة وRNAseq داخل المنطقة المستهدفة.

شكل 1
الشكل 1. رسم تخطيطي للRNAseq القبض على خطوات. في هذه المظاهرة التجريبية، RNA هو deple الأولتيد من الحمض النووي الريبي الريباسي، تليها تجزئة المواد الكيميائية وتركيب الحمض النووي التكميلي (كدنا]) باستخدام الناسخ العكسي. المقبل، ومذيل بعديد الأدينيلات [كدنا] وligated على طرفي محولات الخاصة بالنظام الأساسي لإنشاء مكتبة. ثم يتم تضخيمها فقط مكتبات كدنا] مع محولات المناسبة التي كتبها PCR. ثم يتم تهجين المكتبات لتحقيقات قليل النوكليوتيد مخصصة وتصويرها باستخدام حبات مغناطيسية. هذه كمية صغيرة من مكتبة استولت يجب تضخيمه للمرة الثانية لديها ما يكفي لتسلسل الجيل القادم. ويمكن بعد ذلك مكتبات متعددة تكون متسلسلة بشكل متواز. ويتم تحليل البيانات تسلسل للأحداث RNA من الفائدة مثل اندماج الجينات والتعبير أو الطفرات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. Comparison من الجينات المستهدفة في التقاط مقابل RNAseq ألف، مقارنة التعبير الجيني بين لقطة وRNAseq في أربعة خطوط الخلايا السرطانية K562، LC2، EOL1 وRT-4 تقاس يقرأ في كيلو قاعدة لكل مليون معين يقرأ (FPKM) (دخول على نطاق و). يتم إثراء الجينات المستهدفة من الفائدة (الأزرق) مقارنة الجينات غير المستهدفة (الرمادي) باء، النسبة المئوية من يقرأ الخرائط إلى المنطقة المستهدفة وزيادة في التقاط مقابل المكتبات RNAseq في أربعة خطوط الخلايا السرطانية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تسلسل القياسات من التقاط مقابل RNAseq في خطوط خلية الممثل أربعة السرطان. النسبة المئوية من يقرأ الخرائط إلى Transcriptome على، C، النسبة المئوية من يقرأ في المناطق exonic دال، النسبة المئوية من يقرأ في المناطق intronic هاء، مجموع التسلسل يقرأ. نسبة يقرأ الخرائط إلى الحمض النووي الريبي الريباسي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الخط الخلوي انصهار مكتبة النوع عدد القراءات على الهدف يقرأ فيوجن تطبيع دعم يقرأ (NFSR)
TophatFusion ChimeraScan TRفوق
K562 BCR-ABL RNAseq 150300482 279438 0 438 0
أسر 9341148 7566087 598 343 0
LC2 CCDC6-RET RNAseq 128861790 307566 0 97 0
أسر 12320692 10314284 71 44 6
EOL1 FIP1L1-PDGFRA RNAseq 135321406 225222 0 0 170
أسر 9317418 7680818 143 0 7
RT4 FGFR3 -TACC3 RNAseq 161350024 208741 0 131 469
أسر 8305950 6563574 358 88 34

الجدول 1. كشف فيوجن لالتقاط مقابل RNAseq من K562، LC2، EOL1 وRT-4. يعرض هذا الجدول أربعة خطوط الخلايا السرطانية وثلاثة مختلفة خوارزميات الكشف عن الانصهار، TopHat2، ChimeraScan، وTRUP المستخدمة في هذه التظاهرة. يوضح هذا الجدول القدرة على الكشف عن اندماج مع التقاط باستخدام أقل من 10 مليون مجموع يقرأ بالمقارنة مع أكثر من 60 مليون يقرأ تستخدم لRNAseq. حسبت الانصهار المعقلية يقرأ بقسمة الانصهار دعم يقرأ من يقرأ كيناز، مضروبا في المليون.

</ HTML"الشكل 4" SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 54090 / 54090fig4.jpg" />
الشكل 4. ستارت يدعو لالتقاط مقابل RNAseq. هذه المخططات فين تبين عدد واحدة النكليوتيد المتغيرات (SNVs) التي تم الكشف عنها من قبل التقاط وRNAseq لكل من أربعة خطوط الخلايا (K562، LC2، EOL1 وRT-4). ويوضح هذا التوافق عالية من SNVs بين لقطة وRNAseq داخل المنطقة المستهدفة: K562 (81.3٪)، LC2 (78.3٪)، EOL1 (89.5٪) وRT-4 (73.9٪) من فضلك انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RNAseq التقاط هو استراتيجية متوسطة بين RNAseq وميكروأري نهج لتقييم والجزء المحدد من Transcriptome على. وتشمل مزايا القبض على التكلفة والوقت تحول سريع تخفيض على المنظم سطح المكتب، إنتاجية عالية، والكشف عن التعديلات الجينوم. ويمكن تكييف طريقة لوصف الرنا غير الترميز 23، كشف النووية المنفردة المتغيرات 4-6 وفحص الحمض النووي الريبي الربط، وتحديد اندماج الجينات أو إعادة ترتيب الهيكلية 24. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذا النهج في العينات السريرية أو المصنعة التي خضعت لتثبيت مع الفورمالين وجزءا لا يتجزأ من كتل البارافين 24،25.

هناك عدة فوائد كبيرة من القبض على RNAseq بالمقارنة مع ميكروأري، في الوقت الحقيقي الكمي PCR، سانجر تسلسل وتسلسل الحمض النووي. ميكروأري محدودة بسبب خلفية عالية بسبب عبر التهجين وغير محددة ملزمة للتحقيقات. الكمي من الجينات مع ليقتصر التعبير آه نظرا للضجيج في الخلفية، في حين تتأثر قياسات الجينات أعرب كبير من قبل إشارة التشبع 1. مقارنة التقاط RNAseq، في الوقت الحقيقي PCR يثبت من الصعب على الإنجاب. بالإضافة إلى ذلك، RNAseq يسمح للكشف عن النصوص الجديدة، ويتطلب أقل من المواد انطلاق المدخلات ويمكن الكشف عن بديل الربط 26 .في المقابل لسانجر تسلسل، RNAseq يسمح لأعلى إنتاجية وتحليل المنخفض ميرنا التعبير عنها. وقد أثبتت سانجر تسلسل ليكون أداة قيمة للتحقق من اندماج مع المعروفة تقاطعات اكسون-اكسون وطفرات الحمض النووي جسدية، ولكن تحديد اندماج جديدة يعوقها متطلبات توقف مرشح مسبقة. تسلسل الحمض النووي ليست فعالة من حيث التكلفة، يتطلب مساحة تخزين أكبر للبيانات، وغير قادر على الكشف عن التعديلات بعد النسخي.

هناك العديد من الخطوات الحاسمة المشاركة في التقاط RNAseq. أولا، لتحسين العائد من المنتجات مكتبة منRNA / [كدنا الخرز ممغطس محددة والخرز ممغطس خلال يغسل، وتوخي الحذر بعدم خلال تجفيف الخرز، الأمر الذي سيؤدي إلى فقدان الإنتاجية. أيضا، لا تحت الجافة الخرز، تأكد من إزالة كافة الإيثانول من أنابيب العينات، والإيثانول يمكن أن تقلل من العائد كدنا]. الثانية، والتهجين للمكتبات [كدنا مع تحقيقات تكميلية يعتمد على درجة حرارة ثابتة، ونحن نوصي الاحترار الاحتياطي اغسل أنا وصارمة العازلة إلى 65 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل مقدما. وعلاوة على ذلك، بعد التهجين لا بد من الحفاظ على 65 درجة مئوية خلال الخطوات الملزمة ويغسل. وقد صممت تحقيقات المستخدمة هنا لالإكسونات من الجينات المهمة للتنمية المخدرات بما في ذلك تحركات، الجينات المسؤولة عن إعادة ترتيب الشائعة مثل عوامل النسخ، والجينات منزل حفظ. وعلاوة على ذلك، المحتوى الجيني للتخصيص، ويمكن أن الأحجام لوحة القبض تختلف. كذلك، معلومات جديدة عن مناطق الجينوم تنشأ، تحقيقات إضافية يمكن أن تصمم وأضاف لرانه وحة القبض على القائمة.

يوفر تقييم مقاييس التوافق، وتحديدا سعر الفائدة على المستهدفة، معلومات على الكيفية التي أثرت على المنطقة المستهدفة. قد يكون راجعا إلى التهجين والتقاط فشلت، حيث لم استولت على منطقة الهدف المنشود وإثراء معدل منخفض على الهدف. في هذه الحالة، يجب إجراء إعادة التهجين والقبض على مجموعة المكتبة. قد يكون انخفاض معدل على الهدف أيضا بسبب عدم استنزاف الريباسي، والتي يمكن التأكد من حساب النسبة المئوية للالريباسي في العينات. ونسبة الريباسي عالية ضمن العينة يتطلب إعادة إعداد للعينة التي تبدأ مع نضوب الريباسي. بالإضافة إلى ذلك، إذا انخفض تركيز مكتبة أدناه متطلبات التهجين والقبض، فإنه سيكون من المستحسن لتحسين كمية من بدء إدخال لنوع العينة والجودة (المدى: 50-1،000 نانوغرام).

في حين أن هناك العديد من المزايا لتطبيقات RNAseq المستهدفة، وهناك أيضا قيود علىيعتبر. عينات مع نوعية رديئة RNA تقوم على رين أو درجة تجزئة قد لا تسفر عن المكتبات الجودة للتسلسل. وقد أظهرت العديد من المجموعات النجاح مع عينات جزءا لا يتجزأ من البارافين الثابتة الفورمالين، ولكن هناك عينات التي لن تمر لتسلسل 24،25،27. وعلاوة على ذلك، منذ RNAseq التقاط يركز على النصوص المعروفة، فإنه يفقد فوائد RNAseq منحازة للرواية أو النصوص غير المشروحة. وبالإضافة إلى ذلك، للكشف عن الحزب الوطني الاسكتلندي، يمكن أن أساليب RNAseq فقط الكشف عن الطفرات في النصوص التعبير عنها.

وتشمل الفرص المستقبلية لالتقاط RNAseq البحوث والتطبيقات السريرية. والاكتشاف الأخير الآلاف من الحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل ودورها في علم الأحياء تتطلب توصيف تركيزا. في العيادة، قد تمتد RNAseq التقاط ما بعد اختبار البحوث وتترجم إلى فحوصات سريرية لتحديد خصائص الأمراض التي تصيب البشر مثل السرطان، والأمراض المعدية، والاختبار غير الغازية. بالتزامن مع approa التسلسل الجينيالشطرنج، RNAseq التقاط يمكن أن تكون متكاملة لدراسة وتوصيف الجينوم التعبير عنها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thermomixer R Eppendorf 21516-166
Centrifuge 5417R Eppendorf 5417R
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004
Molecular Biology Grade Ethanol Sigma Aldrich E7023-6X500ML
Thermoblock 24 x 1.5 ml Eppendorf 21516-166
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles) Illumina MS-102-2002
MiSeq Desktop Sequencer Illumina
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA Illumina RS-122-2301
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p5 IDT 127040822
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(6nt) IDT 127040823
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(8nt) IDT 127040824
Agencourt® AMPure® XP - PCR Purification beads  Beckman-Coulter A63880
Dynabeads® M-270 Streptavidin Life Technologies 65305
COT Human DNA, Fluorometric Grade, 1 mg Roche Applied Science 05480647001
Qubit® Assay Tubes  Life Technologies Q32856
Qubit® dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
SeqCap® EZ Hybridization and Wash Kits  (24 or 96 reactions) Roche NimbleGen  05634261001 or 05634253001 
Qubit® 2.0 Fluorometer  Life Technologies Q32866
10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution) IDT
Tween20 BioXtra Sigma P7949-500ML
Nuclease Free Water Life Technologies AM9937
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96–Well Fast Rection Module Biorad 185-1196
SeqCap EZ Hybridization and Wash Kits Roche Applied Science 05634253001
SuperScript II Reverse Transcription 200 U/μl Life Technologies 18064-014
D1000 ScreenTape Agilent Technol. Inc. 5067-5582
Agencourt RNAClean XP - 40 ml Beckman Coulter Inc A63987
RNA ScreenTape Agilent Technol. Inc. 5067-5576
RNA ScreenTape Ladder Agilent Technol. Inc. 5067-5578
RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent Technol. Inc. 5067-5577
Sodium Hydroxide Sigma 72068-100ML
DynaBeads MyOne Streptavidin T1 Life Technologies 65602
DYNAMAG -96 SIDE EACH Life Technologies 12331D
Chloroform Sigma C2432-1L
KAPA HotStart ReadyMix KAPA Biosystems KK2602
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Scientific
My Block Mini Dry Bath Benchmark BSH200
D1000 Reagents Agilent Technol. Inc. 5067- 5583
Vacufuge Plus Eppendorf 022829861 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Mercer, T. R., et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014).
  3. Maher, C. A., et al. Chimeric transcript discovery by paired-end transcriptome sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12353-12358 (2009).
  4. Piskol, R., Ramaswami, G., Li, J. B. Reliable identification of genomic variants from RNA-seq data. Am J Hum Genet. 93, 641-651 (2013).
  5. Quinn, E. M., et al. Development of strategies for SNP detection in RNA-seq data: application to lymphoblastoid cell lines and evaluation using 1000 Genomes data. PLoS One. 8, e58815 (2013).
  6. Tang, X., et al. The eSNV-detect: a computational system to identify expressed single nucleotide variants from transcriptome sequencing data. Nucleic Acids Res. 42, e172 (2014).
  7. Invitrogen. Qubit dsDNA HS Assay Kit Manual. Available from: http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf (2010).
  8. Agilent. Agilent D1000 ScreenTape System Quick Guide. Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf (2013).
  9. Illumina. Preparing Libraries for Sequencing on the MiSeq®. Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf (2013).
  10. Illumina. MiSeq® Reagent Kit v2 Reagen Preparation Guide. Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html (2012).
  11. Andrews, S. FastQC. Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  12. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14, R36 (2013).
  13. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  14. Broad Institute. Picard. Available from: http://picard.sourceforge.net/ (2014).
  15. DeLuca, D. S., et al. RNA-SeQC: RNA-seq metrics for quality control and process optimization. Bioinformatics. 28, 1530-1532 (2012).
  16. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
  17. Van der Auwera, G. A., et al. From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline. Curr Protoc Bioinformatics. 11, 11.10.1-11.10.33 (2013).
  18. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
  19. Iyer, M. K., Chinnaiyan, A. M., Maher, C. A. ChimeraScan: a tool for identifying chimeric transcription in sequencing data. Bioinformatics. 27, 2903-2904 (2011).
  20. Kim, D., Salzberg, S. L. TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts. Genome Biol. 12, R72 (2011).
  21. Fernandez-Cuesta, L., et al. Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data. Genome Biol. 16, 7 (2015).
  22. Shugay, M., Ortiz de Mendibil,, Vizmanos, I., L, J., Novo, F. J. Oncofuse: a computational framework for the prediction of the oncogenic potential of gene fusions. Bioinformatics. 29, 2539-2546 (2013).
  23. Clark, M. B., et al. Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing. Nat Methods. 12, 339-342 (2015).
  24. Cieslik, M., et al. The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing. Genome Res. (2015).
  25. Cabanski, C. R., et al. cDNA hybrid capture improves transcriptome analysis on low-input and archived samples. J Mol Diagn. 16, 440-451 (2014).
  26. Costa, C., Gimenez-Capitan, A., Karachaliou, N., Rosell, R. Comprehensive molecular screening: from the RT-PCR to the RNA-seq. Transl Lung Cancer Res. 2, 87-91 (2013).
  27. Zhao, W., et al. Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling. BMC Genomics. 15, 419 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics