Ciblées ARN Séquençage Assay pour caractériser l'expression génique et génomique Transformations

Biology

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Martin, D. P., Miya, J., Reeser, J. W., Roychowdhury, S. Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations. J. Vis. Exp. (114), e54090, doi:10.3791/54090 (2016).

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Abstract

séquençage de l'ARN (RNA-seq) est une méthode polyvalente qui peut être utilisée pour détecter et caractériser l'expression des gènes, des mutations, des fusions de gènes, et ARNs non codants. Norme exige RNA-seq 30-100000000 séquençage lit et peut inclure plusieurs produits d'ARN tels que l'ARNm et ARN non codantes. Nous démontrons comment ciblée RNA-seq (capture) permet une étude ciblée sur les produits d'ARN sélectionnés à l'aide d'un séquenceur de bureau. RNA-seq capture peut caractériser les transcriptions annotées, faibles, ou exprimés de façon transitoire qui pourraient autrement être manquées en utilisant des méthodes traditionnelles RNA-seq. Nous décrivons ici l'extraction d'ARN à partir de lignées cellulaires, l'ARN ribosomique, l'épuisement de la synthèse d'ADNc, la préparation de bibliothèques de codes à barres, l'hybridation et la capture des produits de transcription cibles, et le séquençage multiplex sur un séquenceur de bureau. Nous présentons également le pipeline d'analyse informatique, qui comprend l'évaluation du contrôle de la qualité, l'alignement, la détection de la fusion, l'expression du gène de quantification et d'identification de simple nucdes variants de leotide. Ce dosage permet un séquençage de transcription ciblé pour caractériser l'expression des gènes, des fusions de gènes et des mutations.

Protocol

Remarque: Ce protocole décrit le traitement et l'analyse des quatre échantillons simultanés. Cette méthode est compatible avec l'ARN isolé à partir de cellules, tissus frais congelé et de tissus en paraffine fixés au formol (FFPE). Ce protocole commence avec 50 - 1000 ng (250 ng recommandé) à partir de l'entrée d'ARN pour chaque échantillon.

1. ARNr Épuisement et Fragmentation de procédure ARN

  1. ARNr Depletion
    1. Retirer éluer, premier, fragment mélange, ARNr élimination mélange, le tampon de liaison ARNr et tampon de resuspension de -20 ° C et décongélation à température ambiante. Retirer le tampon d'élution, ARNr perles d'enlèvement et de l'ARN / ADNc billes paramagnétiques spécifique de 4 ° C et porter à la température ambiante.
    2. Ajouter 0,25 pg d'ARN à tube PCR. Diluer l'ARN total avec de l'eau ultra-pure sans nucléase à un volume total final de 10 ul. Ajouter 5 pi de tampon de liaison ARNr à chaque tube, puis ajouter 5 pi d'ARNr élimination mélange et doucement pipette de haut en bas pour mélanger. Placer les tubes dans cycleur thermique à couvercle préalablement chauffé à 100 ° C et on programme cycleur thermique à 68 ° C pendant 5 minutes pour dénaturer l'ARN.
    3. Après l'ARN dénaturation, retirer les tubes de cycleur thermique et incuber à température ambiante pendant 1 min. Vortex ARNr tube de retrait des talons vigoureusement pour remettre en suspension les perles. Ajouter 35 ul de ARNr perles d'enlèvement à de nouveaux tubes et transférer la réaction ARN de dénaturation (20 pi) dans des tubes contenant de l'ARNr perles d'enlèvement.
    4. Régler la pipette à 45 pi et pipette rapidement monter et descendre 20x pour mélanger. Incuber les tubes à température ambiante pendant 1 min. Ensuite, placez les tubes en position magnétique à température ambiante pendant 1 min. Transférer le surnageant dans des tubes de PCR nouvellement étiquetés et placer ces tubes à nouveau en stand magnétique à température ambiante pendant 1 min. Cela garantit qu'aucune des billes sont transférées. Transférer le surnageant dans des tubes de PCR nouvellement étiquetés.
    5. L'ARN Vortex / ADNc spécifique des billes paramagnétiques et ajouter 99 ul de billes dans chaque tube. Doucement pipette ensemblevolume vers le haut et vers le bas 10x pour mélanger. Si à partir de l'ARN-dégradé, ajouter 193 ul de billes paramagnétiques spécifiques bien mélangé ARN / ADNc dans chaque tube. Incubation à température ambiante pendant 15 min. Ensuite, placez les tubes sur le support magnétique à température ambiante pendant 5 min. Retirer et jeter les surnageants.
    6. Ajouter 200 ul d'éthanol fraîchement préparée à 70% (EtOH). Garder les tubes sur support magnétique et de prendre soin de ne pas perturber les perles. Incuber à température ambiante pendant 30 secondes, puis retirez et jetez le surnageant. Les tubes permettent de reposer à température ambiante pendant 5 - 10 minutes pour sécher.
    7. Centrifugeuse décongelé chambre tampon d'élution de la température à 600 xg pendant 5 sec. Ajouter 11 ul de tampon d'élution à chaque tube et la pipette doucement monter et descendre 10 fois pour mélanger. Incuber les tubes à température ambiante pendant 2 min. Placer les tubes sur support magnétique à température ambiante pendant 5 min. Transférer 8,5 ul du surnageant dans des tubes de PCR nouvellement marqués.
  2. Fragmentation des ARNr Depleted ARN
    1. Ajouter 8,5 pi elute, 8,5 pi premier, et 8,5 pi de fragment mélange dans chaque tube. pipette doucement vers le haut et vers le bas 10x pour mélanger. Placer les tubes dans cycleur thermique avec le programme suivant: le couvercle préalablement chauffé à 100 ° C, 94 ° C pendant 8 minutes, puis 4 ° C attente.
      Remarque: cette étape est conçu pour générer une taille moyenne d'insert de 155 pb. Si la taille moyenne des fragments de l'échantillon d'ARN est inférieure à 200 pb, ignorez cette étape et passez à First Strand cDNA Synthesis.

2. Synthèse d'ADNc

  1. Synthétiser First Strand cDNA
    1. Retirer premier mélange de synthèse du brin de -20 ° C et décongeler à la température ambiante.
    2. Pré-programme du cycleur thermique avec les paramètres suivants: option de couvercle de préchauffage et réglé à 100 ° C, puis 25 ° C pendant 10 min, 42 ° C pendant 15 min, 70 ° C pendant 15 min et maintenir à 4 ° C . Enregistrer ce programme comme "Synthétiser 1 er Strand."
    3. Centrifugeuse le tube décongelé-première synthèse mélange brin à 600 & #215; g pendant 5 sec. Mélanger 1 pl de transcriptase inverse avec 9 ul de premier mélange de synthèse du brin.
    4. Ajouter 8 pi de synthèse du premier brin et la transcriptase inverse mélange dans chaque tube, pipette doucement monter et descendre 6x pour mélanger. Tubes à centrifuger pour 4 sec en utilisant une mini-table centrifugeuse à vitesse fixe à 6,0 xg pour amener le liquide vers le bas. Placer les tubes dans le thermocycleur et sélectionnez Synthétiser 1 er Strand. Lorsque le cycleur thermique atteint 4 ° C, retirer les tubes et procéder immédiatement à Synthétiser deuxième brin d'ADNc.
  2. Synthétiser deuxième brin d' ADNc
    1. cycleur thermique Préchauffer à 16 ° C avec couvercle pré-chauffé à 30 ° C. Thaw deuxième mélange maître brin et le tampon de remise en suspension sur de la glace. En avance, retirez la bouteille de billes paramagnétiques de 4 ° C et laisser reposer pendant au moins 30 min pour les amener à la température ambiante.
    2. Ajouter 5 ul de tampon de remise en suspension dans chaque tube de PCR. Centrifugeuse deuxième mélange maître brin à 600× g pendant 5 sec et ajouter 20 ul à chaque tube PCR. Placer les tubes dans cycleur thermique préchauffé à 16 ° C pendant 1 h. Lorsque l'incubation est terminée, retirez du cycleur thermique et permettent des tubes à venir à la température ambiante.
    3. Vortex les perles paramagnétiques jusqu'à ce qu'ils soient bien dispersés. Ajouter 90 ul de billes paramagnétiques bien mélangés dans chaque tube. pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x pour mélanger. Incuber les tubes à température ambiante pendant 15 min. Placer les tubes sur le support magnétique à température ambiante pendant 5 min.
    4. Retirer et jeter 135 pi de surnageant puis laisser les tubes sur le support magnétique pour effectuer lavage de EtOH. Ajouter 200 ul fraîchement préparées 80% d'EtOH dans chaque tube, sans perturber les billes, puis incuber à température ambiante pendant 30 sec. Retirer et jeter tout le surnageant de chacun. Répétez l'opération pour un total de deux lavages 80% EtOH.
    5. Laissez tubes reposer à température ambiante pendant 5 - 10 min à sécher sur le support magnétique. Centrifuger le temperatur ambiante décongelée resuspension tampon à 600 × g pendant 5 sec. Retirer les tubes PCR du support magnétique. Ajouter 17,5 tampon de resuspension ul à chaque tube PCR et pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x pour bien mélanger. Incuber les tubes pendant 2 minutes à la température ambiante.
    6. Placer les tubes sur le support magnétique à température ambiante pendant 5 min, puis transférer 15 surnageant pi (ADNc double brin) à 0,2 ml PCR tubes de bande.
      NOTE: Ceci est un point d'arrêt sûr que l'ADNc peut être stocké à -20 ° C pendant jusqu'à 7 jours.

3. Bibliothèque Préparation

  1. Adénylate 3 'Ends
    1. Retirer A-tailing mélange de -20 ° C et décongélation à température ambiante. Pré-programme du cycleur thermique avec les paramètres suivants: choisir l'option de couvercle de pré-chauffage et réglé à 100 ° C, puis fixé à 37 ° C pendant 30 min, 70 ° C pendant 5 min et maintenir à 4 ° C. Enregistrer ce programme comme "ATAIL70."
    2. Ajouter 2,5 ul de resuspensionun tampon pour chaque tube. Puis ajouter 12,5 pi de décongelé A-tailing mix. pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x pour bien mélanger. Placer les tubes dans le thermocycleur et sélectionnez ATAIL70. Lorsque la température du cycleur thermique est à 4 ° C, retirer les tubes PCR du thermocycleur et procéder immédiatement à ligaturer des adaptateurs.
  2. Adaptateurs ligaturer
    1. Retirer tubes adaptateurs d'ARN appropriés, arrêter un tampon de ligature et tampon de resuspension de -20 ° C et décongeler à la température ambiante. Ne pas retirer le tube ligature de mélange de -20 ° C jusqu'à ce que les instructions de le faire dans le protocole. Retirez la bouteille de billes paramagnétiques de 4 ° C et laisser reposer pendant au moins 30 minutes pour amener à la température ambiante.
    2. Préchauffer le cycleur thermique à 30 ° C et choisissez l'option de couvercle de pré-chauffage et réglé à 100 ° C. Centrifugeuse les ARN adaptateur Tubes décongelés à 600 × g pendant 5 sec. Immédiatement avant utilisation, retirer le tube ligature de mélange de -20 ° Cstockage.
    3. Ajouter 2,5 ul de tampon de remise en suspension dans chaque tube à échantillon. Ajouter 2,5 pi de mélange de ligature. Retour le tube ligature de mélange à -20 ° C stockage immédiatement après utilisation. Ajouter 2,5 ul de l'index d'adaptateur d'ARN décongelé à chaque tube d'échantillon. pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x pour bien mélanger.
    4. Tubes à centrifuger pour 4 sec en utilisant une mini-table centrifugeuse à vitesse fixe à 6,0 x g. Placer les tubes dans le cycleur thermique préchauffé. Fermer le couvercle et incuber à 30 ° C pendant 10 min.
    5. Retirer les tubes de cycleur thermique et ajouter 5 pl de tampon de ligature d'arrêt à chaque tube pour inactiver la ligature. pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x pour bien mélanger.
    6. Répétez lavage comme décrit dans 2.2.3 - 2.2.4, en utilisant 42 ul de billes mixtes paramagnétiques, et à rejeter 79,5 surnageant ul. Avec les tubes sur le support magnétique, laisser les échantillons d'air sec à la température ambiante pendant 5 - 10 min.
    7. Retirez les bandes de tubes PCR de laLe support magnétique et ajouter un tampon de remise en suspension 52,5 ul à chaque tube. pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x pour bien mélanger. Incuber les tubes à température ambiante pendant 2 min. Placer les tubes sur le support magnétique à température ambiante pendant 5 min ou jusqu'à ce que le liquide est clair. Transfert 50 pi de surnageant de chaque tube à nouveau 0,2 ml PCR tubes de bande. Prenez soin de ne pas perturber les perles.
    8. Répétez lavage comme décrit dans 2.2.3 - 2.2.4, en utilisant 50 pi de perles mixtes paramagnétiques, et en rejetant 95 surnageant ul. Avec les tubes sur le support magnétique, laisser les échantillons sécher à l'air à température ambiante pendant 5 à 10 min.
    9. Enlever les tubes de la bande PCR à partir du support magnétique et ajouter un tampon de remise en suspension 22,5 ul à chaque tube. pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x pour bien mélanger.
    10. Incuber les tubes à température ambiante pendant 2 min. Placer les tubes sur le support magnétique à température ambiante pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que le liquide est clair. Transfert 20 ul surnageant de chaque tube à unenouvelle PCR tube de 0,2 ml de la bande. Prenez soin de ne pas perturber les perles. Ceci est un point d'arrêt sûr et l'ADNc peut être stocké à -20 ° C pendant jusqu'à 7 jours.

4. Bibliothèque Amplification

  1. Enrichir fragments d' ADN
    1. Retirez le mélange maître PCR, PCR primaire cocktail et tampon de resuspension de -20 ° C stockage et décongélation à température ambiante. Retirez la bouteille de billes paramagnétiques de 4 ° C de stockage et laisser reposer pendant au moins 30 minutes pour amener à la température ambiante.
    2. Pré-programme du cycleur thermique avec les paramètres suivants: choisir l'option de couvercle de pré-chauffage et réglé à 100 ° C, puis réglez dénaturation initiale à 98 ° C pendant 30 secondes, 15 cycles de dénaturation à 98 ° C pendant 10 sec, recuit à 60 ° C pendant 30 secondes, et extension à 72 ° C pendant 30 secondes, une étape d'élongation finale à 72 ° C pendant 5 min et le maintenir à 4 ° C. Enregistrer ce programme comme «PCR».
    3. Centrifuger le maître PCR décongelémélanger et des amorces de PCR tubes à 600 g pendant 5 sec. Ajouter 5 ul d'amorces de PCR décongelés à chaque tube d'échantillon. Ajouter 25 ul de décongelé mélange maître PCR dans chaque tube d'échantillon. pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x pour bien mélanger.
    4. Placer les tubes en forme de bande PCR coiffés dans le cycleur thermique préprogrammé. Fermer le couvercle et exécuter le programme PCR. Lorsque la PCR est terminée, retirez les tubes de cycleur thermique et garder sur la glace.
    5. Répétez lavage comme décrit dans 2.2.3 - 2.2.4, en utilisant 50 pi de perles mixtes paramagnétiques, et en rejetant 95 surnageant ul. Avec les tubes sur le support magnétique, laisser les échantillons d'air sec à la température ambiante pendant 5 - 10 min.
    6. Enlever les tubes du support magnétique et ajouter un tampon de remise en suspension 32,5 ul de chaque tube d'échantillon. pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x pour bien mélanger. Incubation à température ambiante pendant 2 min. Placer les tubes de PCR sur le support magnétique à température ambiante pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que le liquide est clair. Ensuite, transférer 30 pi supernatant à 0,2 ml tubes PCR frais.
    7. Effectuer la quantification de l' ADNc en utilisant un fluoromètre 7 et déterminer la qualité d'ADNc en utilisant un système d'électrophorèse capillaire 8.
      NOTE: Ceci est un point d'arrêt sûr et l'ADNc peut être stocké à -20 ° C pendant jusqu'à 7 jours. Remarque: Cette bibliothèque est considérée comme une bibliothèque RNA-seq.
      Les étapes ultérieures conduisent à une bibliothèque de capture.

5. Hybridation, Capture et séquençage

  1. hybridation multiplexée
    1. Retirer les sondes sur mesure hydratés, Cot-1 DNA, oligos blocage universel et oligos bloquants spécifiques de l'adaptateur de -20 ° C et de dégel sur la glace.
    2. Dans une liaison de 1,5 tube à faible ml, mélanger 500 ng d'ADN (125 ng par échantillon lorsque le multiplexage 4 échantillons), 5 pi Cot-1 DNA (1 pg / pl), 1UL oligos de blocage universel, 0,5 pi p7 (6 nucléotide) adaptateur spécifique bloquant oligos (ce montant peut être nécessaire d'ajuster en fonction de conditi multiplexons) et 0,5 ul p7 (8 nucléotide) adaptateur oligos bloquants spécifiques (ce montant peut être nécessaire d'ajuster en fonction des conditions multiplex).
    3. Placer le tube d'échantillon dans un concentrateur sous vide avec capuchon ouvert dans le sens opposé de rotation. Extrait sec à 45 ° C pendant 20 minutes ou jusqu'à évaporation complète du liquide.
    4. Resuspendre contenu séché avec 8,5 ul 2x tampon d'hybridation, 3,4 pi composante d'hybridation A et de l'eau libre 1.1 nucléase ul. Autoriser 10 min pour la remise en suspension et vortex toutes les 2,5 minutes. Transfert de matériau remis en suspension dans un tube PCR de 0,2 ml et on incube à 95 ° C pendant 10 min sur un thermocycleur.
    5. Retirer le tube d'échantillon d'hybridation à partir cycleur thermique et ajoute 2 pl de sondes personnalisées remises en suspension à une concentration de 1,5 pmole / ul. En variante, ajouter 4 pi de sondes personnalisées remises en suspension à une concentration de 0,75 pmole / ul. Incuber réaction d'hybridation pendant la nuit (16-24 h) à 65 ° C.
      NOTE: Sondes achetés auprès de divers fournisseurs peuvent être utilisés et les instructions du fabricant doivent être suivies. La durée de l'étape d'hybridation peut également varier.
  2. Bead Préparation et capture
    1. Enlever une bouteille de billes paramagnétiques de streptavidine couplée de 4 ° C et on équilibre à la température ambiante pendant 30 min. Diluer 10x Wash Tampons (I, II, III, et stringentes) et Perle 2.5x Wash Buffer pour créer des solutions de travail 1x.
    2. Aliquoter 140 pi de tampon de lavage 1x I dans un nouveau tube de 1,5 ml. toute la chaleur quantité de tampon stricte 1x et aliquote de tampon de lavage 1x I à 65 ° C dans un bloc de chaleur pendant au moins 2 h.
    3. Aliquote de 100 ul de billes paramagnétiques de streptavidine couplée par la capture dans un tube de 1,5 ml. Placer sur aimant et éliminer le surnageant. Ajouter 200 pi de tampon de lavage des billes par 100 ul de perles de vortex et pendant 10 sec. Placer sur l'aimant pendant 2 - 5 min ou jusqu'à ce que le surnageant soit clair. Une fois que le surnageant est clair, jetez-le et rela tourbe, une fois de plus pour un total de deux lavages.
    4. Après élimination du tampon de lavage des billes, ajouter du tampon de lavage des billes de volume égal que le volume initial de départ (soit 100 ul pour une capture). Resuspendre et transfert à un tube de 0,2 ml PCR. Placer le tube dans le rack magnétique pendant 2 - 5 min ou jusqu'à ce que le surnageant soit clair. surnageant Jeter.
    5. Avec à la fois l'échantillon d'hybridation et de perles dans le cycleur thermique à 65 ° C, transférer le mélange d'hybridation pour le tube de talon et la pipette de haut en bas 10x pour mélanger. Incuber à 65 ° C pendant 45 min, vortex et centrifuger l'échantillon pendant 4 secondes avec une vitesse fixe (6,0 xg) de table mini-centrifugeuse.
  3. Bead Wash
    1. Retirer le tube de capture de cycleur thermique et ajouter le tampon de lavage 1x 100 pi préchauffé I du tube et vortex pendant 10 secondes pour mélanger. Transférer le mélange à un faible 1,5 bind nouveau tube de ml. Placer le tube dans un rack de séparation magnétique et prévoir 2 - 5 min pour la séparation ou jusqu'à ce que le surnageant soit clair. résurnageant iscard.
    2. Ajouter 200 pi de tampon préchauffé de lavage stringent 1x et la pipette de haut en bas 10 fois pour mélanger. Incuber à 65 ° C pendant 5 min. Placer le tube dans le rack de séparation magnétique et permettre à 2 - 3 min pour la séparation ou jusqu'à ce que le surnageant soit clair. surnageant Jeter. Répéter le lavage stringent une fois de plus pour un total de deux lavages.
    3. Ajouter 200 chambres ul 1x température de lavage tampon I et vortex pendant 2 min pour mélanger. Placer le tube dans le rack de séparation magnétique et permettant 2-5 min pour la séparation ou jusqu'à ce que le surnageant soit clair. surnageant Jeter.
    4. Ajouter 200 pi 1x température ambiante tampon de lavage II et vortex pendant 1 min pour mélanger. Placer le tube dans le rack de séparation magnétique et permettant 2-5 min pour la séparation ou jusqu'à ce que le surnageant soit clair. surnageant Jeter.
    5. Ajouter 200 pi 1x température ambiante tampon de lavage III et vortex pendant 30 secondes pour mélanger. Placer le tube dans le rack de séparation magnétique permettant 2-5 min pour la séparation ou jusqu'à ce que le surnageantest clair. surnageant Jeter.
    6. Retirer le tube du rack de séparation magnétique et ajouter de l'eau sans nucléase 20 pi pour remettre en suspension les perles. Mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas 10 fois.
  4. Amplification PCR Capture Poster
    1. Retirer des billes paramagnétiques de 4 ° C et on équilibre à la température ambiante pendant 30 min.
    2. Retirez le démarrage à chaud PCR Ready Mix (2x) et PCR Primer Mix de -20 ° C et décongélation à température ambiante puis placer sur la glace. Préparer la bibliothèque amplification Mix Master en combinant 27,5 pi de démarrage à chaud 2x PCR Ready Mix avec 2,75 ul de PCR Primer 1 et 2,75 pi d'amorce de PCR 2 (ces volumes sont pour 1 bibliothèque d'hybridation plus 10% en excès).
    3. Configuration de la réaction dans le tube PCR en ajoutant 20 ul de billes ainsi que l'ADN capturé avec 30 pi d'amplification bibliothèque master mix pour un volume total de 50 ul. Cap tubes correctement et vortex pour mélanger. Tubes à centrifuger pour 4 sec en utilisant un onglet mini vitesse fixele-centrifugeuse à 6,0 x g.
      1. Mettre en place le programme de PCR suivant: choisissez l'option de couvercle de pré-chauffage et réglé à 100 ° C, puis réglez dénaturation initiale à 98 ° C pendant 45 secondes, 10 - 12 cycles de dénaturation à 98 ° C pendant 15 sec, recuit à 65 ° C pendant 30 secondes et extension à 72 ° C pendant 60 secondes, un cycle d'extension finale à 72 ° C pendant 60 secondes et maintenir à 4 ° C.
    4. Retirer l'échantillon de thermocycleur et ajouter 75 ul billes paramagnétiques. Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 15 min.
    5. Placer les tubes sur l'aimant à la température ambiante pendant 2 - 3 min, puis retirer le surnageant. Lavez perles sur l'aimant en ajoutant 200 pi de 80% d'éthanol, l'incubation pendant 30 secondes, puis enlever le surnageant. Répétez l'opération pour un total de deux 80% lavages.
    6. Incuber à température ambiante pendant 5 - 10 minutes pour permettre aux billes de sécher. Ne pas trop sec à la fissuration. Remettre les billes dans 22 pl de Tris-EDTA pH 8,0 (1x TE Solution) et permettre 3 min pour l'élution. Placez l'échantillon sur l'aimant pour 3 - 5 ème minen transfert 20 ul de produit élué à un bas-bind 1,5 nouveau tube de ml, assurant aucune perles sont reportées.
    7. Effectuer la quantification des ADNc capturés à l' aide de fluorimètre 7 et déterminer la qualité d'ADNc capturé en utilisant un système d'électrophorèse capillaire 8.
  5. Séquenceur Desktop Loading Procédure 9
    1. Diluer la banque d'ADNc capturé à une concentration finale de 4 nm en utilisant 10 mM de Tris-Cl pH 8,5 avec 0,1% de Tween 20. Dégel NaOH 10 N et le tampon d'hybridation sur de la glace. Environ 30 min avant utilisation, bureau séquenceur réactif v2 kit boîte 1 dans de l'eau RT dégel. Ne pas remplir au- dessus MAX FILL LINE 10. S'il vous plaît noter que ceci est une procédure spécifique de la plate-forme de séquençage et peut varier selon les instructions du fabricant.
    2. Préparer 1 ml de NaOH 0,2 N en combinant 20 ul 10 N NaOH avec de l'eau libre 980 nucléase ul dans un tube à centrifuger (toujours se préparer frais). Diluer la bibliothèque PhiX (contrôle bibliothèque) à 4 nM parla combinaison de 2 ul de 10 contrôle de la bibliothèque nM 3 ul de 10 mM de Tris-Cl pH 8,5 avec 0,1% de Tween 20.
    3. Dénaturer bibliothèque finale et le contrôle de la bibliothèque en combinant 5 pi de bibliothèque 4 nM avec 5 pi de NaOH 0,2 N et vortex brièvement pour mélanger. Tubes à centrifuger pour 4 sec en utilisant une mini-table centrifugeuse à vitesse fixe à 6,0 x g. Incubation à température ambiante pendant 5 min pour dénaturer les bibliothèques.
    4. Ajouter 990 ul de tampon d'hybridation pré-refroidi dans les tubes contenant 10 ul de bibliothèques dénaturées. Cela se traduit par une bibliothèque de 20 pM. Marquer la bibliothèque de 20 pM dénaturé avec la date et peut être stocké pendant jusqu'à 3 semaines à -20 ° C.
    5. Mélanger 375 ul de contrôle bibliothèque de 20 pM avec 225 pi de tampon d'hybridation pré-refroidi et le contrôle de la bibliothèque diluée pour donner un contrôle bibliothèque 12,5 pM. Inversez plusieurs fois pour mélanger la solution.
    6. Combinez 594 pi de bibliothèque finale dénaturée avec 6 pi de 12h05 contrôle de bibliothèque dénaturée et vortex pour mélanger. Réglez le samp combinéle bibliothèque et le contrôle de la bibliothèque de côté sur la glace jusqu'à ce que les échantillons sont prêts à charger dans la cartouche de réactif bureau du séquenceur.

Analyse 6. Données

  1. Évaluation de la qualité de la séquence
    1. Calculer la qualité des données de séquences brutes (fichiers fastq) en utilisant la séquence d' évaluation de la qualité 11.
      REMARQUE: Cette étape permet d'évaluer les données avant qu'il ne soit plus soumis à une analyse en aval. Le logiciel fonctionne avec des paramètres en construit et produit un ensemble de paramètres pour chaque fichier fastq.
  2. Alignement
    1. Aligner séquence lit (fichiers fastq) au hg19 du génome de référence humain et transcriptome utilisant Tophat2 12 (version 2.0.10) tout en fournissant les transcriptions connues sous le nom d' un fichier de GTF. La sortie est sous la forme d'un format binaire d'alignement appelé le fichier BAM.
    2. Effectuer soumettre les étapes de traitement , y compris le tri et l' indexation en utilisant samtools 13 (version 0.1.19) Sur le fichier BAM. Effectuer double marquage, réordonner SAM, insérez calcul de la taille et l' ajout ou le remplacement des groupes de lecture à l' aide des outils Picard 14 (version 1.84).
  3. RNA-seq évaluation de la qualité
    1. Calculer une série de mesures de contrôle de qualité pour les données en utilisant RNA-seq RNA-seq évaluation de la qualité. L'entrée de ce logiciel est un fichier BAM 15 de l'alignement Tophat2. La sortie est un fichier HTML qui répertorie le nombre de lecture totale, doublons, cartographiées lire le pourcentage et le pourcentage ARNr, etc., entre autres.
  4. Calling Variant
    1. Utilisez STAR (version 2.4.0) 16 pour l' alignement, puis appeler seul nucléotide variantes utilisant de GATK (Version) étapes de 3,3 à 0 post-traitement HaplotypeCaller 17 .Follow GATK BAM et les critères de filtrage pour marquer et supprimer des faux positifs de la sortie.
  5. L'expression du gène
    1. Calculer l'expression des gènes usilogiciel Cufflinks ng (version 2.1.1) de Tuxedo Suite 18.
      NOTE: L'entrée est un fichier BAM de l'outil d'alignement Tophat2. La sortie est produite au niveau isoforme, le gène et la transcription, où l'expression est calculée comme FPKM (Fragments par Kilobase par million mappé Lit).
  6. Fusion Calling
    1. Appel de fusions chaque échantillon en utilisant ChimeraScan 19 (version 0.4.5), Tophat Fusion 20 coutume et TRUP 21. Annoter les fusions pour les domaines en utilisant Oncofuse 22 (version 1.0.9b2).

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Representative Results

A soulignant schématique des étapes clés dans RNA-seq capture est représenté sur la figure 1. Quatre lignes de cellules cancéreuses avec des mutations connues ont été utilisés pour démontrer l'efficacité de la technique RNA-seq Capture (K562 avec ABL1 fusion, LC2 avec RET fusion, EOL1 avec PDGFRalpha fusion et RT- 4 avec FGFR3 fusion). Les quatre échantillons ont été regroupés et séquencés avec 2x 100 pb lit sur un séquenceur de bureau, ce qui génère des fichiers FASTQ. fichiers FASTQ ont été effectués au moyen d'un pipeline d'analyse de RNA-seq, qui comprend cinq composantes principales: 1) l'évaluation du contrôle de la qualité, 2) l'alignement sur transcriptome humain, 3) quantification de l'expression des gènes, 4) la fusion appel, et 5) variante appel. Le fichier d'alignement (BAM) est utilisé pour appeler des variants nucléotidiques simples et calculer l'expression des gènes. Des fusions sont appelées à l'aide des appelants de fusion, tels que TopHat Fusion (effectuant leur propre alignement) et la sortie est annotée using logiciel de détection de fusion.

La comparaison de l' expression génique et la capture de la RNA-seq démontre l' enrichissement des produits de transcription cibles de 10 à 1000 fois en utilisant la méthode de capture (Figure 2A). En outre, la figure 2B montre une augmentation du lit pour cent de la cartographie des régions de transcription cibles en utilisant la capture par rapport à RNA-seq. Évaluation des mesures de contrôle de la qualité est représentée sur la figure 3. Capturez et RNA-seq effectuent également en termes d'alignement sur ​​le transcriptome (3A, 94% contre 93%) et la taille moyenne d'insertion (3B, 174 pb contre 162 pb). En utilisant la méthode de capture, un pourcentage plus élevé des régions exoniques sont séquences (3C, 77% contre 60%), et inversement , un pourcentage plus faible des régions introniques sont séquences (3D, 4% contre 20%). Le nombre total de lecture par échantillon sont représentés en 3E (3F, 4% contre 15%).

Sortie de détection de fusion indiqué dans le tableau 1 est généré par la fusion de support normalisé lit. Capturer RNA-seq a réussi à détecter des fusions pour les quatre lignées cellulaires. Comparaison des variants nucléotidiques simples appelés dans les régions de capture et de chevauchement RNA-seq est affiché dans la figure 4. Ceci démontre une concordance élevé de variantes entre capture et RNA-seq dans la région cible.

Figure 1
Figure 1. Schéma de capture RNA-seq étapes. Dans cette démonstration expérimentale, l' ARN est d' abord depleted de l'ARN ribosomique, suivie d'une fragmentation chimique et la synthèse d'ADN complémentaire (ADNc) en utilisant la transcriptase inverse. Ensuite, l'ADNc est polyadénylé et ligaturé aux deux extrémités d'adaptateurs spécifiques à la plate-forme pour générer une bibliothèque. Seules les banques d'ADNc avec des adaptateurs appropriés sont ensuite amplifiés par PCR. Les bibliothèques sont ensuite hybridées à des sondes d'oligonucléotides personnalisées et capturées en utilisant des billes magnétiques. Cette petite quantité de bibliothèque capturée doit être amplifié une seconde fois pour avoir assez pour le séquençage de la prochaine génération. Plusieurs bibliothèques peuvent ensuite être séquencés en parallèle. Les données de séquençage est analysé pour des événements d'ARN d'intérêt tels que des fusions de gènes, l' expression ou des mutations. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Comparaison des gènes ciblés dans la capture par rapport RNA-seq. A, la comparaison de l' expression génique entre capture et RNA-seq dans quatre lignées cellulaires de cancer K562, LC2, EOL1 et RT-4 mesurés par lit par kilobase par million mappé lit (FPKM) (échelle logarithmique). Gènes d'intérêt ciblés sont enrichis (bleu) par rapport à des gènes non ciblés (gris). B, Pourcentage de lectures cartographie à la région ciblée est augmentée dans Capture par rapport aux bibliothèques RNA-seq dans quatre lignées cellulaires de cancer. S'il vous plaît , cliquez ici pour afficher une version plus grande cette figure.

Figure 3
Figure 3. Séquençage Metrics de capture par rapport au RNA-seq lignées cellulaires Quatre cancer représentant. A, Pourcentage de lit cartographie au transcriptome, C, Pourcentage de lectures dans les régions d' exons. D, Pourcentage de lectures dans les régions introniques. E, le séquençage Nombre de lectures. F, Pourcentage de lectures cartographie à l' ARN ribosomal. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une une plus grande version de ce chiffre.

Ligne cellulaire La fusion type Library Nombre de lectures On Target Lit Fusion Normalisé Soutenir Lit (NFSR)
TophatFusion ChimeraScan TRUP
K562 BCR-ABL RNA-seq 150300482 279438 0 438 0
Capture 9341148 7566087 598 343 0
LC2 CCDC6-RET RNA-seq 128861790 307566 0 97 0
Capture 12320692 10314284 71 44 6
EOL1 FIP1L1-PDGFRA RNA-seq 135321406 225222 0 0 170
Capture 9317418 7680818 143 0 7
RT4 FGFR3 -TACC3 RNA-seq 161350024 208741 0 131 469
Capture 8305950 6563574 358 88 34

Tableau 1. Détection de fusion pour la capture de contre RNA-seq K562, LC2, EOL1 et RT-4. Ce tableau présente quatre lignées de cellules cancéreuses et trois algorithmes de détection de fusion différents, TopHat2, et ChimeraScan TRUP utilisés dans cette démonstration. Ce tableau démontre la capacité de détecter des fusions avec la capture en utilisant moins de 10 millions au total se lit par rapport à plus de 60 millions de lectures utilisées pour RNA-seq. Fusion supportant lectures ont été calculées en divisant la fusion de support lit par lit kinase, multiplié par un million.

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Figure 4. SNV appelant à la capture par rapport RNA-seq. Ces Les diagrammes de Venn montrent le nombre de variantes Single Nucleotide (SNVs) qui ont été détectés par Capture et RNA-seq pour chacune des quatre lignées cellulaires (K562, LC2, EOL1 et RT-4). Ceci illustre haute concordance des SNVs entre capture et RNA-seq au sein ciblé région:. K562 (81,3%), LC2 (78,3%), EOL1 (89,5%) et RT-4 (73,9 de%) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande cette figure.

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Discussion

RNA-seq Capture est une stratégie intermédiaire entre RNA-seq et microarray approches pour l'évaluation d'une partie sélectionnée du transcriptome. Les avantages de la capture comprennent le coût, le délai d'exécution rapide réduits sur un séquenceur de bureau, à haut débit, et la détection des altérations génomiques. Le procédé peut être adapté pour caractériser ARN non-codants 23, détecter seul nucléotide variantes 4-6, examiner épissage de l' ARN, et d'identifier les fusions de gènes ou réarrangements structuraux 24. En outre, cette approche peut être appliquée à des échantillons cliniques ou transformés qui ont subi une fixation au formol et inclus dans des blocs de paraffine 24,25.

Il y a plusieurs avantages importants de la RNA-seq capture par comparaison à puces à ADN, PCR en temps réel quantitative, le séquençage de Sanger et le séquençage de l'ADN. Microarray est limitée par un bruit de fond en raison de l'hybridation croisée et la liaison non spécifique des sondes. La quantification de gènes avec lexpression ow est limitée en raison du bruit de fond, tandis que les mesures de gènes fortement exprimés sont affectés par la saturation du signal 1. Par rapport à la capture RNA-seq, la PCR en temps réel se révèle difficile à reproduire. En outre, pour la détection permet RNA-seq de nouveaux relevés de notes, nécessite moins de matériel d'entrée de départ et peut détecter un épissage alternatif 26 .En contraste avec le séquençage Sanger, RNA-seq permet le débit et l' analyse de faible miRNA exprimé plus élevé. séquençage Sanger a prouvé être un outil précieux pour la vérification des fusions avec des jonctions exon-exon connues et des mutations d'ADN somatiques, mais l'identification de nouvelles fusions est entravée par les exigences d'un point d'arrêt candidat a priori. Le séquençage d'ADN ne sont pas des coûts efficace, nécessite un plus grand espace de stockage pour les données, et est incapable de détecter des modifications post-transcriptionnel.

Il y a plusieurs étapes critiques impliqués dans la capture RNA-seq. Tout d'abord, pour améliorer le rendement des produits de la bibliothèque de laARN / ADNc billes paramagnétiques spécifiques et des billes paramagnétiques pendant les lavages, soyez prudent de ne pas trop sécher les perles, ce qui conduira à une perte de rendement. En outre, ne pas sous-sécher les perles, d'assurer toute l'éthanol est retiré de tubes d'échantillon, que l'éthanol peut réduire le rendement d'ADNc. Deuxièmement, l'hybridation de banques d' ADNc avec des sondes complémentaires dépend de la température constante, nous recommandons le réchauffement Wash Buffer I et Stringent tampon à 65 ° C pendant au moins deux heures à l' avance. En outre, après l' hybridation , il est essentiel de maintenir 65 ° C pendant les étapes de liaison et de lavage. Les sondes utilisées ici ont été conçus pour des exons de gènes d'intérêt pour le développement de médicaments, y compris les kinases, les gènes impliqués dans des réarrangements communs tels que les facteurs de transcription, et les gènes de la maison en gardant. En outre, le contenu du gène est personnalisable et la taille des panneaux de capture peut varier. En outre, comme de nouvelles informations sur les régions génomiques se pose, des sondes supplémentaires peuvent être conçus et ajoutés à tpanneau de capture qu'il existant.

L'évaluation des mesures d'alignement, en particulier le taux sur la cible, fournit des informations sur la façon dont la région ciblée a été enrichie. Un taux faible sur la cible peut être due à une hybridation et la capture a échoué, grâce à quoi la région cible désirée n'a pas été capturé et enrichi. Dans ce cas, une ré-hybridation et la capture de l'ensemble de la bibliothèque doivent être effectuées. Un taux sur cible bas peut également être due à un échec de déplétion ARNr, qui peut être confirmée en calculant le pourcentage de rRNA dans les échantillons. pourcentage élevé de l'ARNr dans l'échantillon, il faudra re-préparation de l'échantillon en commençant par épuisement ARNr. En outre, si la concentration bibliothèque tombe en dessous des exigences pour l'hybridation et la capture, il serait souhaitable d'optimiser la quantité d'entrée de départ pour le type d'échantillon et de la qualité (gamme: 50-1000 ng).

Bien qu'il existe plusieurs avantages pour les applications de RNA-seq ciblées, il y a aussi des limites àconsidérer. Les échantillons ayant une mauvaise qualité de l'ARN basé sur RIN ou le degré de fragmentation ne peuvent pas donner des bibliothèques de qualité pour le séquençage. Plusieurs groupes ont démontré le succès avec des échantillons formaline de paraffine fixes, mais il y a des échantillons qui ne passeront pas pour le séquençage 24,25,27. En outre, étant donné que la capture se concentre sur RNA-seq transcrits connus, il perd les avantages de RNA-seq impartiale pour roman ou transcriptions annotées. En outre, pour la détection de SNP, les méthodes RNA-seq ne peut détecter des mutations dans les transcrits exprimés.

opportunités futures de capture comprennent la recherche RNA-seq et les applications cliniques. La découverte récente de milliers de longue ARN non codant et leur rôle dans la biologie nécessitera la caractérisation ciblée. Dans la clinique, RNA-seq capture peut se prolonger au-delà des tests de recherche et de traduire en essais cliniques pour caractériser les maladies humaines telles que le cancer, les maladies infectieuses, et les tests non-invasive. En conjonction avec le séquençage génomique approChes, RNA-seq Capture peut être intégré pour étudier et caractériser le génome exprimé.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thermomixer R Eppendorf 21516-166
Centrifuge 5417R Eppendorf 5417R
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004
Molecular Biology Grade Ethanol Sigma Aldrich E7023-6X500ML
Thermoblock 24 x 1.5 ml Eppendorf 21516-166
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles) Illumina MS-102-2002
MiSeq Desktop Sequencer Illumina
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA Illumina RS-122-2301
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p5 IDT 127040822
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(6nt) IDT 127040823
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(8nt) IDT 127040824
Agencourt® AMPure® XP - PCR Purification beads  Beckman-Coulter A63880
Dynabeads® M-270 Streptavidin Life Technologies 65305
COT Human DNA, Fluorometric Grade, 1 mg Roche Applied Science 05480647001
Qubit® Assay Tubes  Life Technologies Q32856
Qubit® dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
SeqCap® EZ Hybridization and Wash Kits  (24 or 96 reactions) Roche NimbleGen  05634261001 or 05634253001 
Qubit® 2.0 Fluorometer  Life Technologies Q32866
10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution) IDT
Tween20 BioXtra Sigma P7949-500ML
Nuclease Free Water Life Technologies AM9937
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96–Well Fast Rection Module Biorad 185-1196
SeqCap EZ Hybridization and Wash Kits Roche Applied Science 05634253001
SuperScript II Reverse Transcription 200 U/μl Life Technologies 18064-014
D1000 ScreenTape Agilent Technol. Inc. 5067-5582
Agencourt RNAClean XP - 40 ml Beckman Coulter Inc A63987
RNA ScreenTape Agilent Technol. Inc. 5067-5576
RNA ScreenTape Ladder Agilent Technol. Inc. 5067-5578
RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent Technol. Inc. 5067-5577
Sodium Hydroxide Sigma 72068-100ML
DynaBeads MyOne Streptavidin T1 Life Technologies 65602
DYNAMAG -96 SIDE EACH Life Technologies 12331D
Chloroform Sigma C2432-1L
KAPA HotStart ReadyMix KAPA Biosystems KK2602
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Scientific
My Block Mini Dry Bath Benchmark BSH200
D1000 Reagents Agilent Technol. Inc. 5067- 5583
Vacufuge Plus Eppendorf 022829861 

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References

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