La secuenciación de ARN dirigidos Ensayo para caracterizar la expresión génica y la genómica alteraciones

Biology

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Martin, D. P., Miya, J., Reeser, J. W., Roychowdhury, S. Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations. J. Vis. Exp. (114), e54090, doi:10.3791/54090 (2016).

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Abstract

la secuenciación de ARN (RNAseq) es un método versátil que puede ser utilizado para detectar y caracterizar la expresión génica, las mutaciones, las fusiones de genes, y noncoding RNAs. Estándar RNAseq requiere 30 - 100 millones de secuenciación lee y puede incluir varios productos de ARN como ARNm y ARN no codificantes. Demostramos cómo orientar las RNAseq (captura) permite un estudio centrado en productos de ARN seleccionados utilizando un secuenciador de escritorio. captura RNAseq puede caracterizar transcripciones anotadas, bajas, o expresado de forma transitoria que de otra manera no pueden ser detectados usando métodos tradicionales RNAseq. Aquí se describe la extracción de ARN a partir de líneas celulares, el agotamiento de ARN ribosomal, síntesis de ADNc, la preparación de bibliotecas de código de barras, la hibridación y la captura de las transcripciones específicas y la secuencia multiplex en un secuenciador de escritorio. También describimos la tubería análisis computacional, lo que incluye la evaluación del control de calidad, la alineación, la detección de la fusión, la cuantificación de la expresión génica y la identificación de un solo nucleotide variantes. Este ensayo permite la secuenciación de transcripción específico para caracterizar la expresión génica, fusiones de genes, y las mutaciones.

Protocol

Nota: Este protocolo describe el procesamiento y el análisis de cuatro muestras simultánea. Este método es compatible con ARN aislado de células, tejido fresco congelado y tejido incluido en parafina fijado con formalina (FFPE). Este protocolo inicia con 50 - 1000 ng (250 ng recomendado) de iniciar la entrada de ARN para cada muestra.

1. El agotamiento de ARNr y la fragmentación de ARN Procedimiento

  1. El agotamiento rRNA
    1. Retire eluyen, prima, mezcla de fragmentos, ARNr mezcla de extracción, tampón de unión rRNA y tampón de resuspensión de -20 ° C y descongelar a temperatura ambiente. Eliminar el tampón de elución, perlas de eliminación de rRNA y perlas paramagnéticas específica de ARN / ADNc a partir del 4 ° C y llevar a temperatura ambiente.
    2. Añadir 0,25 g de ARN al tubo PCR. Diluir el ARN total con agua ultra-pura libre de nucleasa a un volumen final total de 10 l. Añadir 5 l de tampón de unión ARNr a cada tubo a continuación, añadir 5 l de ARNr mezcla suavemente y eliminación pipeteee arriba y hacia abajo para mezclar. Colocar los tubos en el termociclador con tapa previamente calentado a 100 ° C y el programa ciclador térmico a 68 ° C durante 5 min para desnaturalizar el ARN.
    3. Después de RNA desnaturalización, retirar tubos de termociclador y se incuba a temperatura ambiente durante 1 min. Vortex rRNA de tubo de bolas eliminación vigorosamente para resuspender las perlas. Añadir 35 l de perlas de eliminación rRNA a nuevos tubos y transferir la reacción de desnaturalización de ARN (20 l) a tubos que contienen los granos de eliminación rRNA.
    4. Ajustar la pipeta de 45 l y la pipeta de forma rápida arriba y hacia abajo 20 veces para mezclar. Incubar los tubos a TA durante 1 min. A continuación, coloque los tubos en soporte magnético a temperatura ambiente durante 1 min. Transferir el sobrenadante a tubos de PCR recién etiquetados y colocar estos tubos de nuevo en soporte magnético a temperatura ambiente durante 1 min. Esto asegura que no hay perlas se transfieren. Transferir el sobrenadante a tubos de PCR recién etiquetados.
    5. Vortex RNA / perlas paramagnéticas específico de ADNc y añadir 99 l de perlas a cada tubo. Suavemente toda la pipetavolumen arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Si a partir de degradado-RNA, añadir 193 l de perlas paramagnéticas específicas de ARN / ADNc bien mezclada a cada tubo. Incubar a TA durante 15 min. A continuación, coloque los tubos en el soporte magnético a temperatura ambiente durante 5 min. Retirar y desechar el sobrenadante.
    6. Añadir 200 l de recién preparada de etanol 70% (EtOH). Mantenga los tubos de soporte magnético y tener cuidado para no molestar a los granos. Se incuba a temperatura ambiente durante 30 segundos, a continuación, retirar y desechar el sobrenadante. Permitir que los tubos en reposo a temperatura ambiente durante 5 - 10 min para secar.
    7. Centrifugadora descongeló sala de tampón de elución temperatura a 600 × g durante 5 seg. Añadir 11 l de tampón de elución a cada tubo y suavemente la pipeta hacia arriba y abajo 10 veces para mezclar. Incubar los tubos a TA durante 2 min. Colocar los tubos en soporte magnético a temperatura ambiente durante 5 min. Transferir 8,5 l del sobrenadante a tubos de PCR recién etiquetados.
  2. La fragmentación de los ARNr ARN Empobrecido
    1. Añadir 8,5 l ELUTE, 8,5 l primer y 8,5 l de mezcla fragmento a cada tubo. pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Colocar los tubos en el termociclador con el siguiente programa: tapa precalentado a 100 ° C, 94 ° C durante 8 minutos, luego 4 ° C bodega.
      NOTA: Este paso está diseñado para generar un tamaño de inserción promedio de 155 pb. Si el tamaño promedio fragmento de muestra de ARN es inferior a 200 pb, omita este paso y continúe con la primera cadena de cDNA de síntesis.

2. Síntesis de ADNc

  1. Sintetizar la primera cadena de ADNc
    1. Quitar primero la mezcla de síntesis de la cadena de -20 ° C y descongelar a temperatura ambiente.
    2. Pre-programar el termociclador con la siguiente configuración: opción de tapa de precalentamiento y se puso a 100 ° C, luego 25 ° C durante 10 min, 42 ° C durante 15 min, 70 ° C durante 15 minutos y mantener a 4 ° C . Guardar este programa como "Sintetizar hebra."
    3. Centrifugar el tubo descongelado primera hebra mezcla de síntesis a 600 y #215; g durante 5 seg. Mezclar 1 l de transcriptasa inversa con 9 l de mezcla de la primera síntesis de la cadena.
    4. Añadir 8 l de síntesis de la primera hebra y revertir la transcriptasa mezcla a cada tubo, con cuidado la pipeta hacia arriba y abajo para mezclar 6x. tubos de centrífuga de 4 segundos usando una centrífuga de mesa Mini velocidad fija en el 6,0 × g para llevar el líquido a la parte inferior. Colocar los tubos en el termociclador y seleccione Sintetizar hebra. Cuando el termociclador alcanza los 4 ° C, retirar los tubos y proceder inmediatamente a Sintetizar Segunda cadena de ADNc.
  2. En segundo lugar sintetizar ADNc Strand
    1. Pre-caliente el termociclador a 16 ° C con tapa previamente calentado a 30 ° C. Descongelar la segunda mezcla maestra hebra y el tampón de resuspensión en hielo. De antemano, retire la botella de perlas paramagnéticas de 4 ° C y se deja reposar durante al menos 30 minutos para llevarlos a temperatura ambiente.
    2. Añadir 5 l de tampón de resuspensión a cada tubo de PCR. Centrifugadora segunda mezcla maestra Strand en 600× g durante 5 segundos y añadir 20 l de cada tubo de PCR. Colocar los tubos en el termociclador precalentado a 16 ° C durante 1 hora. Cuando se ha completado la incubación, retirar del termociclador y permiten que los tubos lleguen a temperatura ambiente.
    3. Vortex las perlas paramagnéticas hasta que estén bien dispersos. Añadir 90 l de perlas paramagnéticas bien mezclados a cada tubo. pipeta suavemente todo el volumen arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 15 min. Colocar los tubos en el soporte magnético a temperatura ambiente durante 5 min.
    4. Retire y deseche 135 l de sobrenadante a continuación, salir de tubos en el soporte magnético para realizar lavado de EtOH. Añadir 200 l recién preparada 80% EtOH a cada tubo sin perturbar las perlas, a continuación, se incuba a temperatura ambiente durante 30 seg. Retirar y desechar todo el sobrenadante de cada uno. Repita para un total de dos lavados de EtOH 80%.
    5. Permiten tubos reposar a temperatura ambiente durante 5 - 10 min se sequen en el soporte magnético. Centrifugar la temperatur ambiente descongeladotampón de resuspensión de correo a 600 × g durante 5 seg. Retire los tubos de PCR de soporte magnético. Añadir 17,5 l de tampón de resuspensión a cada tubo de PCR y la pipeta suavemente todo el volumen arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar bien. Incubar los tubos durante 2 minutos a temperatura ambiente.
    6. Colocar los tubos en el soporte magnético a temperatura ambiente durante 5 min, luego se transfieren 15 sobrenadante l (ADNc bicatenario) a tubos de 0,2 ml de la tira de PCR.
      NOTA: Este es un punto de parada segura como ADNc se puede almacenar a -20 ° C por hasta 7 días.

3. Preparación Biblioteca

  1. Termina ciclasa 3 '
    1. Retire A-tizón mezcla entre -20 ° C y descongelar a temperatura ambiente. Pre-programar el termociclador con la siguiente configuración: elija la opción de tapa de precalentamiento y se puso a 100 ° C, a continuación, establezca a 37 ° C durante 30 min, 70 ° C durante 5 min y mantener a 4 ° C. Guardar este programa como "ATAIL70."
    2. Añadir 2,5 l de la resuspensióntampón a cada tubo. A continuación, añadir 12,5 l de mezcla descongelado A-tizón. pipeta suavemente todo el volumen arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar a fondo. Colocar los tubos en el termociclador y seleccione ATAIL70. Cuando la temperatura es termociclador a 4 ° C, retirar los tubos de PCR del termociclador y proceder inmediatamente a ligar adaptadores.
  2. Se ligan los adaptadores
    1. Retire los tubos del adaptador de ARN apropiadas, deje de tampón de ligación y tampón de resuspensión de -20 ° C y descongele a temperatura ambiente. No retire el tubo de mezcla de ligación de -20 ° C hasta que se le indique en el protocolo. Retire la botella de perlas paramagnéticas de 4 ° C y dejar reposar durante al menos 30 minutos para llevar a temperatura ambiente.
    2. Precalentar el termociclador a 30 ° C y elegir la opción de tapa de precalentamiento y se puso a 100 ° C. Centrifugar los tubos del adaptador de ARN descongelaron a 600 × g durante 5 seg. Inmediatamente antes de su uso, retire el tubo de mezcla de ligación de -20 ° Calmacenamiento.
    3. Añadir 2,5 l de tampón de resuspensión a cada tubo de muestra. Añadir 2,5 l de mezcla de ligación. Vuelva a colocar el tubo de mezcla de ligación a -20 ° C de almacenamiento inmediatamente después de su uso. Añadir 2,5 l de índice adaptador de ARN descongelado a cada tubo de muestra. pipeta suavemente todo el volumen arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar a fondo.
    4. tubos de centrífuga de 4 segundos utilizando un mini centrífuga de mesa de velocidad fija en 6,0 x g. Colocar los tubos en el termociclador precalentado. Cierre la tapa y se incuba a 30 ° C durante 10 minutos.
    5. Eliminar tubos de termociclador y añadir 5 l de tampón de ligación de parada a cada tubo para inactivar la ligación. pipeta suavemente todo el volumen arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar a fondo.
    6. Repetir el lavado como se describe en 2.2.3 - 2.2.4, utilizando 42 l de perlas paramagnéticas mixtos, y descartando el sobrenadante 79,5 l. Con los tubos en el soporte magnético, dejar que las muestras de aire seco a temperatura ambiente durante 5 - 10 minutos a.
    7. Retire las tiras de tubos PCR de lasoporte magnético y añadir tampón de resuspensión 52,5 l a cada tubo. pipeta suavemente todo el volumen arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar a fondo. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 2 min. Colocar los tubos en el soporte magnético a temperatura ambiente durante 5 minutos o hasta que el líquido es claro. Transferencia de 50 l de sobrenadante de cada tubo a nuevos tubos de 0,2 ml de la tira de PCR. Tenga cuidado de no alterar las perlas.
    8. Repetir el lavado como se describe en 2.2.3 - 2.2.4, utilizando 50 l de perlas paramagnéticas mixtos, y descartando el sobrenadante 95 l. Con los tubos en el soporte magnético, dejar que las muestras se sequen al aire a temperatura ambiente durante 5 - 10 minutos a.
    9. Retire las tiras de tubos de PCR del soporte magnético y añadir tampón de resuspensión 22,5 l a cada tubo. pipeta suavemente todo el volumen arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar a fondo.
    10. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 2 min. Colocar los tubos en el soporte magnético a temperatura ambiente durante 5 min o hasta que el líquido es claro. Transferencia de 20 l sobrenadante de cada tubo a unanuevo tubo de 0,2 ml tira de PCR. Tenga cuidado de no alterar las perlas. Este es un punto de parada segura y cDNA puede ser almacenado a -20 ° C por hasta 7 días.

4. Biblioteca de amplificación

  1. Enriquecer fragmentos de ADN
    1. Retire la mezcla maestra de PCR, PCR cóctel de imprimación y tampón de resuspensión de almacenamiento -20 ° C y descongelar a temperatura ambiente. Retire la botella de perlas paramagnéticas de almacenamiento de 4 ° C y dejar reposar durante al menos 30 minutos para llevar a temperatura ambiente.
    2. Pre-programar el termociclador con la siguiente configuración: elija la opción de tapa de precalentamiento y se puso a 100 ° C, a continuación, establecer una desnaturalización inicial a 98 ° C durante 30 segundos, 15 ciclos de desnaturalización a 98 ° C durante 10 segundos, hibridación a 60 ° C durante 30 seg, y extensión a 72 ° C durante 30 segundos, un ciclo de extensión final a 72 ° C durante 5 min y mantener a 4 ° C. Guardar este programa como "PCR".
    3. Se centrifuga el maestro PCR descongeladomezclar y cebadores de PCR tubos a 600 xg durante 5 seg. Añadir 5 l de cebadores de PCR descongelados a cada tubo de muestra. Añadir 25 l de descongelado mezcla maestra de PCR a cada tubo de muestra. pipeta suavemente todo el volumen arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar a fondo.
    4. Colocar las tiras de tubos PCR tapados en el termociclador previamente programada. Cierre la tapa y ejecutar el programa de PCR. Cuando se ha completado la PCR, retirar los tubos del termociclador y mantener en hielo.
    5. Repetir el lavado como se describe en 2.2.3 - 2.2.4, utilizando 50 l de perlas paramagnéticas mixtos, y descartando el sobrenadante 95 l. Con los tubos en el soporte magnético, dejar que las muestras de aire seco a temperatura ambiente durante 5 - 10 minutos a.
    6. Retire los tubos del soporte magnético y añadir tampón de resuspensión 32,5 l a cada tubo de muestra. pipeta suavemente todo el volumen arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar a fondo. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min. Colocar los tubos de PCR en el soporte magnético a temperatura ambiente durante 5 min o hasta que el líquido es claro. A continuación, traslado de 30 l Dopernatant a nuevos tubos de 0,2 ml de PCR.
    7. Realizar cuantificación de cDNA utilizando un fluorómetro 7 y determinar la calidad de ADNc utilizando un sistema de electroforesis capilar 8.
      NOTA: Este es un punto de parada segura y cDNA puede ser almacenado a -20 ° C por hasta 7 días. Nota: Esta biblioteca se considera una biblioteca RNAseq.
      Los pasos subsiguientes conducen a una biblioteca de captura.

5. La hibridación, captura y secuenciación

  1. La hibridación multiplexado
    1. Retire las sondas hidratados encargo, ADN Cot-1, los oligonucleótidos de bloqueo universales, y el adaptador de oligonucleótidos bloqueantes específicos de -20 ° C y descongelar en hielo.
    2. En un tubo ml baja se unen 1.5, se combinan 500 ng de ADN (125 ng por muestra cuando la multiplexación 4 muestras), 5 l ADN Cot-1 (1 mg / l), 1UL oligos de bloqueo universales, p7 0,5 l (6 nucleótidos) adaptador específico el bloqueo de oligos (puede ser necesario ajustar dependiendo de conditi múltiplex esta cantidadons) y p7 0,5 l (8 nucleótidos) adaptador de oligonucleótidos bloqueantes específicos (pueden necesitar ser ajustados dependiendo de las condiciones multiplex) esta cantidad.
    3. Colocar el tubo de muestra en un concentrador de vacío con tapa abierta frente a la dirección opuesta a la rotación. contenido de secado a 45 ° C durante 20 min o hasta la completa evaporación del líquido.
    4. Resuspender el contenido seca con 8,5 l de 2x tampón de hibridación, la hibridación 3.4 l componente A y agua libre de nucleasa 1.1 l. Permita 10 minutos para la resuspensión y agitar cada 2,5 minutos. Transferencia de material resuspendido a un tubo de PCR de 0,2 ml y se incuba a 95 ° C durante 10 min en un ciclador térmico.
    5. Retire el tubo de muestra de hibridación de termociclador y añadir 2 l de sondas personalizadas resuspendidas a una concentración de 1,5 pmol / l. Alternativamente, añadir 4 l de sondas personalizadas resuspendidas a una concentración de 0,75 pmol / l. Incubar reacción de hibridación durante la noche (16-24 h) a 65 ° C.
      NOTA: Sondas comprados a varios vendedores se pueden utilizar y las instrucciones del fabricante deben ser seguidas. La duración de la etapa de hibridación también puede variar.
  2. Preparación del grano y captura
    1. Eliminar botella de perlas paramagnéticas de estreptavidina acoplada a partir de 4 ° C y se equilibre a temperatura ambiente durante 30 min. Diluir Los tampones de lavado 10X (I, II, III y estrictas) y 2,5 veces la gota de tampón de lavado para crear soluciones de trabajo 1x.
    2. Alícuota de 140 l de tampón de lavado 1x I en a un nuevo tubo de 1,5 ml. toda Heat cantidad de tampón 1x estrictas y alícuota de tampón de lavado 1x I a 65 ° C en un bloque de calor durante al menos 2 hr.
    3. Alícuota de 100 l de perlas paramagnéticas de estreptavidina acoplada por captura en un tubo de 1,5 ml. Colocar en imán y desechar el sobrenadante. Añadir 200 l de tampón de lavado del grano por cada 100 l perlas y agitar durante 10 seg. Colocar en el imán durante 2 - 5 min o hasta que el sobrenadante es claro. Una vez sobrenadante es claro, descartarlo y volverturba una vez más para un total de dos lavados.
    4. Tras la eliminación del tampón de lavado gota, añade la igualdad de tampón de lavado del grano volumen como el volumen inicial de partida (es decir, 100 l de una adquisición). Resuspender y la transferencia a un tubo de PCR de 0,2 ml. Coloque el tubo en la gradilla magnética durante 2 - 5 min o hasta que el sobrenadante es claro. sobrenadante de descarte.
    5. Con tanto en la muestra de hibridación y perlas en el ciclador térmico a 65 ° C, transferir la mezcla de hibridación a la de tubo de bolas y la pipeta arriba y abajo 10 veces para mezclar. Se incuba a 65 ° C durante 45 minutos, mezclar y centrifugar la muestra durante 4 segundos usando una velocidad fija (6,0 x g) de sobremesa minicentrifugadora.
  3. Bead Wash
    1. Retire el tubo de captura de termociclador y añadir 100 l precalentado 1x tampón de lavado I al tubo y agitar durante 10 segundos para mezclar. Transfiera la mezcla a un tubo nuevo mínimo de 1,5 ml se unen. Colocar el tubo en una gradilla de separación magnética y permita 2-5 min para la separación o hasta que el sobrenadante es claro. reiscard sobrenadante.
    2. Añadir 200 l precalentado tampón de lavado 1x estrictas y la pipeta hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Incubar a 65 ° C durante 5 min. Colocar el tubo en la gradilla de separación magnética y permita 2-3 min para la separación o hasta que el sobrenadante es claro. sobrenadante de descarte. Repetir el lavado astringente, una vez más para un total de dos lavados.
    3. Añadir 200 l 1x temperatura ambiente tampón de lavado I y agitar durante 2 minutos para mezclar. Colocar el tubo en la gradilla de separación magnética y permitiendo 2-5 min para la separación o hasta que el sobrenadante es claro. sobrenadante de descarte.
    4. Añadir 200 l 1x temperatura ambiente tampón de lavado II y agitar durante 1 minuto para mezclar. Colocar el tubo en la gradilla de separación magnética y permitiendo 2-5 min para la separación o hasta que el sobrenadante es claro. sobrenadante de descarte.
    5. Añadir 200 l 1x temperatura ambiente tampón de lavado III y agitar durante 30 segundos para mezclar. Colocar el tubo en la gradilla de separación magnética que permite 2-5 min para la separación o hasta que el sobrenadantees claro. sobrenadante de descarte.
    6. Retire el tubo del bastidor separación magnética y añadir 20 l de agua libre de nucleasa para volver a suspender las perlas. Mezcle bien con la pipeta hacia arriba y hacia abajo 10 veces.
  4. Captura posterior amplificación por PCR
    1. Eliminar perlas paramagnéticas de 4 ° C y se equilibre a temperatura ambiente durante 30 min.
    2. Retire el arranque en caliente PCR Ready Mix (2x) y PCR Primer Mix de -20 ° C y descongelar a temperatura ambiente y luego se coloca en hielo. Preparar la mezcla maestra de amplificación de la biblioteca mediante la combinación de 27,5 l de arranque en caliente 2x PCR Ready Mix con 2,75 l de PCR Primer 1 y 2,75 l de cebador de PCR 2 (estos volúmenes son para 1 biblioteca de hibridación más un 10% de exceso).
    3. Configuración de la reacción en el tubo de PCR mediante la adición de 20 l de perlas de más ADN capturado con 30 l de la amplificación de la biblioteca mezcla maestra para un volumen total de 50 l. Tape el tubo y agitar bien para mezclar. tubos de centrífuga de 4 segundos utilizando un mini pestaña velocidad fijale-centrífuga de 6,0 x g.
      1. Estableció el siguiente programa de PCR: elegir la opción tapa de precalentamiento y ajustado a 100 ° C, a continuación, establecer una desnaturalización inicial a 98 ° C durante 45 s, 10 - 12 ciclos de desnaturalización a 98 ° C durante 15 segundos, hibridación a 65 ° C durante 30 segundos y extensión a 72 ° C durante 60 segundos, un ciclo de extensión final a 72 ° C durante 60 segundos y mantener a 4 ° C.
    4. Retirar la muestra del termociclador y añadir 75 l perlas paramagnéticas. Mezclar bien e incubar a TA durante 15 min.
    5. Colocar los tubos en el imán a temperatura ambiente durante 2 - 3 minutos y luego retirar el sobrenadante. Lavar los granos en el imán añadiendo 200 l 80% de etanol, incubando durante 30 segundos y luego retirar el sobrenadante. Repita para un total de dos lavados de 80%.
    6. Incubar a temperatura ambiente durante 5 - 10 min para permitir que los granos se sequen. No se exceda en seco al agrietamiento. Volver a suspender las perlas en 22 l de Tris-EDTA pH 8,0 (solución TE 1x) y se deja 3 minutos para la elución. Coloque la muestra en el imán durante 3 - 5 min THen la transferencia de 20 l de producto eluido a un nuevo tubo de baja unen 1,5 ml, lo que garantiza que no hay cuentas son transferidas.
    7. Realizar cuantificación de cDNA capturados utilizando fluorómetro 7 y determinar la calidad de ADNc capturado utilizando un sistema de electroforesis capilar 8.
  5. Secuenciador de escritorio Cargando Procedimiento 9
    1. Diluir biblioteca de ADNc capturado a una concentración final de 4 nM utilizando 10 mM Tris-Cl pH 8,5 con 0,1% de Tween 20. Descongelar NaOH 10 N y tampón de hibridación en hielo. Aproximadamente 30 minutos antes de su uso, descongelar secuenciador de escritorio reactivo v2 caja del kit 1 en agua RT. No llene por encima de la línea de llenado MAX 10. Tenga en cuenta que este es un procedimiento específico plataforma de secuenciación y puede variar según las instrucciones del fabricante.
    2. Preparar 1 ml de NaOH 0,2 N mediante la combinación de 20 l de NaOH 10 N con agua libre de nucleasa 980 l en un tubo de microcentrífuga (prepare siempre fresco). Diluir la biblioteca PhiX (control de la biblioteca) a 4 nmla combinación de 2 l de 10 control de la biblioteca nM con 3 l de 10 mM Tris-Cl pH 8,5 con 0,1% de Tween 20.
    3. Desnaturalizar la biblioteca final y control de la biblioteca mediante la combinación de 5 l de la biblioteca 4 nM con 5 l de NaOH 0,2 N y agitar brevemente para mezclar. tubos de centrífuga de 4 segundos usando una centrífuga de mesa de mini-top velocidad fija en 6,0 x g. Incubar a RT durante 5 min para desnaturalizar las bibliotecas.
    4. Añadir 990 l de tampón de hibridación pre-refrigerada a los tubos que contienen 10 l de bibliotecas desnaturalizadas. Esto da como resultado una biblioteca de 20 pM. Marque la desnaturalizada biblioteca de 20 horas, con la fecha y se puede almacenar hasta por 3 semanas a -20 ° C.
    5. Mezclar 375 l de control de la biblioteca 20 pM con 225 l de tampón de hibridación pre-enfriada y control de la biblioteca se diluyó para dar lugar a un control de la biblioteca 24:05. Invierta varias veces para mezclar la solución.
    6. Combinar 594 l de la biblioteca definitiva desnaturalizado con 6 l de 24:05 desnaturalizada control de la biblioteca y agitar para mezclar. Ajuste el samp combinadoLe biblioteca y control de la biblioteca a un lado en hielo hasta que las muestras están listas para cargar en el cartucho de reactivos secuenciador de escritorio.

Análisis 6. Datos

  1. Evaluación de la Calidad de Secuencia
    1. Calcular la calidad de los datos de secuencia en bruto (archivos) utilizando FASTQ evaluación de la calidad de secuencia 11.
      NOTA: Este paso ayuda a evaluar los datos antes de que se somete además a un análisis de aguas abajo. El software funciona con los parámetros in-construidas y produce un conjunto de métricas para cada archivo FASTQ.
  2. Alineación
    1. Alinear la secuencia lee (archivos) a la FASTQ hg19 referencia del genoma humano y el transcriptoma utilizando Tophat2 12 (versión 2.0.10) mientras que proporciona transcripciones conocidas como archivo GTF. La salida está en la forma de un formato de alineación binario llamado el archivo de BAM.
    2. Realice los pasos de procesamiento posteriores, incluidos la clasificación y la indexación usando Samtools 13 (versión 0.1.19) En el archivo de BAM. Realizar duplicado marcado, la reordenación de SAM, inserte el cálculo del tamaño y la adición o sustitución grupos de lectura utilizando herramientas Picard 14 (versión 1.84).
  3. Evaluación de la Calidad RNAseq
    1. Calcular una serie de métricas de control de calidad para los datos de evaluación de la calidad RNAseq utilizando RNAseq. La entrada a este software es un archivo de BAM 15 de la alineación Tophat2. La salida es un archivo HTML que las listas de recuento de lecturas totales, duplicados, hicieron mapas de porcentaje y porcentaje ARNr, etc. leer, entre otros.
  4. Llamadas variante
    1. Utilice STAR (versión 2.4.0) 16 para la alineación y luego llamar a un solo nucleótido variantes de uso de GATK (Versión 3,3-0) HaplotypeCaller 17 .Siga GATK BAM pasos de post-procesamiento y criterios de filtrado para la bandera y eliminar los falsos positivos de la salida.
  5. La expresion genica
    1. Calcular la expresión génica USIsoftware ng Gemelos (versión 2.1.1) de la suite smoking 18.
      NOTA: La entrada es un archivo de BAM herramienta de alineación Tophat2. La salida se produce a nivel de la isoforma, transcripción de genes y, cuando la expresión se calcula como FPKM (fragmentos por Kilobase por millón asignada lecturas).
  6. Llamadas de fusión
    1. Llame a las fusiones de cada muestra utilizando ChimeraScan 19 (versión 0.4.5), Tophat Fusion 20 costumbre y TRUP 21. Anotar las fusiones de dominios usando Oncofuse 22 (versión 1.0.9b2).

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Representative Results

A destacando esquemática pasos clave en Capture RNAseq se muestra en la Figura 1. Cuatro líneas celulares de cáncer con mutaciones conocidas se utilizaron para demostrar la eficacia de la técnica de RNAseq Capture (K562 con la fusión ABL1, LC2 con la fusión RET, EOL1 con la fusión PDGFRalpha y RT- 4 con la fusión FGFR3). Las cuatro muestras se agruparon y se secuenciaron con 2x 100 pb lee en un secuenciador de escritorio, que genera archivos FASTQ. FASTQ archivos se llevaron a cabo a través de un análisis de tuberías RNAseq, que incluye cinco componentes principales: 1) la evaluación del control de calidad, 2) la alineación de transcriptoma humano, 3) de cuantificación de la expresión génica, 4) de llamadas de fusión, y 5) la variante de llamadas. El archivo de alineación (BAM) se utiliza para llamar variantes de nucleótido único y calcular la expresión génica. Las fusiones se llaman utilizando los llamadores de fusión, tales como fusión TopHat (que realizan su propia alineación) y la salida se anotan using software de detección de fusión.

Comparación de la expresión génica de RNAseq y captura demuestra el enriquecimiento de los transcritos dirigidos por 10 a 1000 veces utilizando el método de captura (Figura 2A). Además, la Figura 2B muestra un aumento en el porcentaje de lecturas de mapeo para las regiones de transcripción dirigidas utilizando de captura en comparación con RNAseq. La evaluación de las medidas de control de calidad está representado en la figura 3. RNAseq capturar y realizar igual en términos de alineamiento con el transcriptoma (3A, 94% vs. 93%) y el tamaño de inserción (3B, 174 pb frente a 162 pb) significan. Utilizando el método de captura, un mayor porcentaje de regiones exónicas se secuenció (3C, 77% vs. 60%), y por el contrario un porcentaje más bajo de las regiones intrónicas están en secuencia (3D, 4% vs. 20%). Los recuentos totales serán leídos por muestra se representan en 3E (3F, 4% vs. 15%).

Salida de detección de fusión se muestra en la Tabla 1 se genera con la fusión normalizado apoyo lee. Captura RNAseq tuvo éxito en la detección de fusiones de las cuatro líneas celulares. La comparación de las variantes de nucleótido único en las regiones llamadas de captura y RNAseq superposición se muestra en la Figura 4. Esto demuestra una alta concordancia entre las variantes de Captura y RNAseq dentro de la región de destino.

Figura 1
Figura 1. Esquema de captura RNAseq pasos. En esta demostración experimental, el ARN es el primer depleted de ARN ribosomal, seguido por la fragmentación química y la síntesis de ADN complementario (ADNc) usando la transcriptasa inversa. A continuación, el ADNc se poliadenilado y se ligó en ambos extremos a los adaptadores específicos de la plataforma para generar una biblioteca. Sólo bibliotecas de ADNc con adaptadores adecuados se amplifican por PCR. Las bibliotecas se hibridaron a sondas de oligonucleótidos personalizados y capturaron con perlas magnéticas. Esta pequeña cantidad de biblioteca capturado se debe amplificar un segundo tiempo, la suficiente para la secuenciación de próxima generación. bibliotecas múltiples luego pueden ser secuenciados en paralelo. Datos de secuenciación se analizaron para eventos de ARN de interés, tales como fusiones de genes, expresión o mutaciones. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. COMPARACIÓN de determinados genes en comparación con la captura RNAseq. Una, la comparación entre la expresión génica de captura y RNAseq en cuatro líneas celulares de cáncer K562, LC2, EOL1 y RT-4 medidas por lecturas por kilobase por millón asignada lee (FPKM) (Escala logarítmica). Estos genes de interés se enriquecen (azul) en comparación con los genes que no son objeto (gris). B, el porcentaje de lecturas de mapeo de la región de orientación se incrementa en Capture frente bibliotecas RNAseq en cuatro líneas celulares de cáncer. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Secuencia de métricas de captura contra RNAseq en líneas celulares de cáncer Cuatro Representante. A, lee Porcentaje de mapeo para el transcriptoma, C, Porcentaje de lecturas en las regiones exonic. D, porcentaje de lecturas en las regiones intrónicas. E, la secuenciación total lee. F, Porcentaje de lecturas de mapeo para el ARN ribosomal. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Línea celular Fusión biblioteca de tipos total de Lecturas El destino lee Fusión normalizado Apoyo Lee (NFSR)
TophatFusion ChimeraScan TRARRIBA
K562 BCR-ABL RNAseq 150300482 279.438 0 438 0
Capturar 9,341,148 7,566,087 598 343 0
LC2 CCDC6-RET RNAseq 128861790 307.566 0 97 0
Capturar 12320692 10314284 71 44 6
EOL1 FIP1L1-PDGFRA RNAseq 135321406 225.222 0 0 170
Capturar 9,317,418 7,680,818 143 0 7
RT4 FGFR3 -TACC3 RNAseq 161350024 208.741 0 131 469
Capturar 8,305,950 6,563,574 358 88 34

Tabla 1. Detección de la fusión de captura contra RNAseq de K562, LC2, EOL1 y RT-4. Esta tabla muestra cuatro líneas celulares de cáncer y tres algoritmos de detección de fusión diferentes, TopHat2, ChimeraScan y TRUP utilizados en esta demostración. Esta tabla demuestra la capacidad de detectar fusiones con captura usando menos de 10 millones en total en comparación con lecturas superiores a 60 millones de lecturas utilizadas para RNAseq. Fusión que soporta lee se calcula dividiendo la fusión de soporte lee por la quinasa lee, multiplicado por un millón.

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Figura 4. SNV pidiendo captura contra RNAseq. Estos diagramas de Venn muestra el número de variantes de un solo nucleótido (SNVS) que fueron detectados por Captura y RNAseq para cada uno de cuatro líneas celulares (K562, LC2, EOL1 y RT-4). Esto ilustra alta concordancia de SNVS entre Captura y RNAseq dentro de la zona de destino:. K562 (81,3%), LC2 (78,3%), EOL1 (89,5%) y RT-4 (73,9%) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Captura RNAseq es una estrategia intermedia entre RNAseq y microarrays enfoques para la evaluación de una parte seleccionada del transcriptoma. Las ventajas de captura incluyen el costo, el tiempo de respuesta rápido redujeron en un secuenciador de escritorio, de alto rendimiento, y la detección de alteraciones genómicas. El método puede ser adaptado para caracterizar los ARN no codificantes 23, detectar solo nucleótido variantes 4-6, examinar empalme de ARN, y para identificar las fusiones de genes o reordenamientos estructurales 24. Además, este enfoque se puede aplicar a muestras clínicas o procesados ​​que se han sometido a la fijación con formalina y embebidos en bloques de parafina 24,25.

Hay varias ventajas significativas de captura RNAseq en comparación con microarrays, cuantitativa en tiempo real PCR, secuenciación de Sanger y secuenciación de ADN. Microarray está limitada por alto fondo debido a la hibridación cruzada y la unión no específica de sondas. La cuantificación de los genes con lexpresión ow está restringido debido a ruido de fondo, mientras que las mediciones de genes altamente expresados ​​son afectados por saturación de la señal 1. En comparación con la captura de RNAseq, PCR en tiempo real resulta difícil de reproducir. Además, RNAseq permite la detección de nuevas transcripciones, requiere menos material de entrada de partida y puede detectar splicing alternativo 26 .En contraste con la secuenciación de Sanger, RNAseq permite un mayor rendimiento y análisis de baja miARN expresado. secuenciación de Sanger ha demostrado ser una herramienta valiosa para la verificación de fusiones con conocidos exón-exón cruces y mutaciones de ADN somáticas, sin embargo identificación de nuevas fusiones se ve obstaculizada por los requisitos de un punto de interrupción candidato priori. La secuenciación del ADN no es costo eficiente, requiere mayor espacio de almacenamiento para los datos, y es incapaz de detección de modificaciones post-transcripcional.

Hay varios pasos críticos implicados en la captura RNAseq. En primer lugar, para mejorar el rendimiento de los productos de la bibliotecaARN / perlas paramagnéticas específica de cDNA y perlas paramagnéticas durante el lavado, tenga cuidado de no sobre secar los granos, lo que conducirá a la pérdida de rendimiento. Además, no menores de secar los granos, asegurar que todo el etanol se elimina de los tubos de muestra, como el etanol puede reducir el rendimiento de ADNc. En segundo lugar, la hibridación de bibliotecas de ADNc con sondas complementarias depende de la temperatura constante, se recomienda el calentamiento de tampón de lavado I y riguroso Buffer a 65 ° C durante al menos dos horas de antelación. Además, después de la hibridación es esencial para mantener 65 ° C durante la unión y la etapas de lavado. Las sondas utilizadas aquí fueron diseñados para los exones de genes de interés para el desarrollo de fármacos incluyendo quinasas, los genes implicados en reordenamientos comunes, tales como factores de transcripción, y la casa de mantenimiento de los genes. Por otra parte, el contenido de genes es personalizable y tamaños de panel de captura puede variar. Además, como surge nueva información sobre regiones genómicas, sondas adicionales pueden ser diseñados y se añaden a tpanel de captura de él existente.

Evaluación de las métricas de alineación, específicamente lo que la tasa objetivo, se proporciona información sobre qué tan bien se enriqueció la región objetivo. Una tasa de en-blanco bajo puede ser debido a una hibridación y captura fallado, por lo que la región diana deseada no fue capturado y enriquecido. En este caso, una re-hibridación y captura del conjunto de la biblioteca deben llevarse a cabo. Una tasa de en-blanco bajo también puede ser debido a la falta de agotar rRNA, que se puede confirmar mediante el cálculo del porcentaje de rRNA en las muestras. porcentaje de alta rRNA dentro de la muestra requerirá re-preparación de la muestra a partir de agotamiento rRNA. Además, si la concentración de biblioteca cae por debajo de los requisitos para la hibridación y la captura, sería conveniente para optimizar la cantidad de entrada de partida para el tipo de muestra y la calidad (rango: 50-1,000 ng).

Mientras que hay varias ventajas para aplicaciones RNAseq dirigidos, también hay limitaciones aconsiderar. Las muestras con la mala calidad del ARN basado en RIN o el grado de fragmentación no pueden producir bibliotecas de calidad para la secuenciación. Varios grupos han demostrado tener éxito con las muestras incluidas en parafina fijadas en formol, sin embargo, hay muestras de que no va a pasar para la secuenciación 24,25,27. Además, puesto que la captura RNAseq se centra en conocer las transcripciones, pierde los beneficios de RNAseq imparcial para la novela o transcripciones anotadas. Además, para la detección de SNP, los métodos RNAseq sólo pueden detectar las mutaciones en las transcripciones expresadas.

oportunidades futuras de captura RNAseq incluyen la investigación y aplicaciones clínicas. Reciente descubrimiento de miles de largo ARN no codificante y su papel en la biología requerirá caracterización enfocada. En la clínica, RNAseq captura puede extenderse más allá de las pruebas de investigación y ensayos clínicos traducirse en caracterizar las enfermedades humanas como el cáncer, las enfermedades infecciosas, y la prueba no invasiva. En conjunción con approa secuenciación genómicaches, captura RNAseq se puede integrar para estudiar y caracterizar el genoma expresado.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thermomixer R Eppendorf 21516-166
Centrifuge 5417R Eppendorf 5417R
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004
Molecular Biology Grade Ethanol Sigma Aldrich E7023-6X500ML
Thermoblock 24 x 1.5 ml Eppendorf 21516-166
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles) Illumina MS-102-2002
MiSeq Desktop Sequencer Illumina
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA Illumina RS-122-2301
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p5 IDT 127040822
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(6nt) IDT 127040823
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(8nt) IDT 127040824
Agencourt® AMPure® XP - PCR Purification beads  Beckman-Coulter A63880
Dynabeads® M-270 Streptavidin Life Technologies 65305
COT Human DNA, Fluorometric Grade, 1 mg Roche Applied Science 05480647001
Qubit® Assay Tubes  Life Technologies Q32856
Qubit® dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
SeqCap® EZ Hybridization and Wash Kits  (24 or 96 reactions) Roche NimbleGen  05634261001 or 05634253001 
Qubit® 2.0 Fluorometer  Life Technologies Q32866
10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution) IDT
Tween20 BioXtra Sigma P7949-500ML
Nuclease Free Water Life Technologies AM9937
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96–Well Fast Rection Module Biorad 185-1196
SeqCap EZ Hybridization and Wash Kits Roche Applied Science 05634253001
SuperScript II Reverse Transcription 200 U/μl Life Technologies 18064-014
D1000 ScreenTape Agilent Technol. Inc. 5067-5582
Agencourt RNAClean XP - 40 ml Beckman Coulter Inc A63987
RNA ScreenTape Agilent Technol. Inc. 5067-5576
RNA ScreenTape Ladder Agilent Technol. Inc. 5067-5578
RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent Technol. Inc. 5067-5577
Sodium Hydroxide Sigma 72068-100ML
DynaBeads MyOne Streptavidin T1 Life Technologies 65602
DYNAMAG -96 SIDE EACH Life Technologies 12331D
Chloroform Sigma C2432-1L
KAPA HotStart ReadyMix KAPA Biosystems KK2602
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Scientific
My Block Mini Dry Bath Benchmark BSH200
D1000 Reagents Agilent Technol. Inc. 5067- 5583
Vacufuge Plus Eppendorf 022829861 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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