RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren

Biology

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Martin, D. P., Miya, J., Reeser, J. W., Roychowdhury, S. Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations. J. Vis. Exp. (114), e54090, doi:10.3791/54090 (2016).

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Abstract

RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) ist ein vielseitiges Verfahren, die verwendet werden können, um die Genexpression, Mutationen Genfusionen und nichtkodierenden RNAs nachzuweisen und zu charakterisieren. Standard-RNA-Seq erfordert 30-100000000 Sequenzierung liest und können mehrere RNA-Produkte wie mRNA und nicht-kodierenden RNAs enthalten. Wir zeigen, wie gezielte RNA-Seq (Capture) ermöglicht eine gezielte Untersuchung an ausgewählten RNA-Produkte einen Desktop-Sequenzer. RNA-Seq-Capture können unkommentierte, niedrig, charakterisieren oder transient Transkripte ausgedrückt, die sonst übersehen werden traditionelle RNA-Seq-Methoden. Hier beschreiben wir die Extraktion von RNA aus Zelllinien, ribosomale RNA Verarmungs, cDNA-Synthese, Herstellung von barcodierten Bibliotheken, Hybridisierung und Einfangen von Ziel Transkripte und multiplex-Sequenzierung auf einem Desktop-Sequenzer. Wir skizzieren auch die rechnerische Analyse-Pipeline, die Bewertung der Qualitätskontrolle beinhaltet, Ausrichtung, Fusion Erkennung, Genexpression Quantifizierung und Identifizierung von einzelnen Nukleotide Varianten. Dieser Test ermöglicht die gezielte Sequenzierung Transkript Genexpression, Genfusionen und Mutationen zu charakterisieren.

Protocol

Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die gleichzeitige Verarbeitung und Analyse von vier Proben. Dieses Verfahren ist kompatibel mit RNA aus Zellen isoliert, frisch gefrorenes Gewebe und Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeproben (FFPE). Dieses Protokoll beginnt mit 50 - 1000 ng (250 empfohlen ng) für jede Probe RNA Eingabe beginnen.

1. rRNA Depletion und Fragmentation von RNA-Verfahren

  1. rRNA Depletion
    1. Entfernen Sie elute, Prime, Fragment-Mix, rRNA Entfernung Mischung, rRNA Bindungspuffer und Resuspensionspuffers von -20 ° C und bei Raumtemperatur auftauen. Entfernen Elutionspuffer, rRNA Entfernung Perlen und RNA / cDNA-spezifischen paramagnetischen Perlen von 4 ° C und auf Raumtemperatur bringen.
    2. In 0,25 ug RNA PCR-Röhrchen. Verdünnen Sie die Gesamt-RNA mit Nuklease-freiem ultrareinem Wasser auf insgesamt Endvolumen von 10 ul. In 5 ul rRNA Bindungspuffer in jedes Röhrchen fügen Sie dann 5 ul Entfernung Mix rRNA und sanft pipette nach oben und unten zu mischen. Die Röhrchen in Thermocycler mit Deckel vorgewärmt auf 100 ° C und Programm Thermocycler bis 68 ° C für 5 min, um die RNA zu denaturieren.
    3. Nach RNA Denaturierung Entfernen Röhrchen aus Thermocycler und für 1 min bei Raumtemperatur inkubieren. Vortex rRNA Entfernung bead Rohr kräftig um die Perlen zu resuspendieren. In 35 ul rRNA Entfernung Perlen in neue Röhrchen und übertragen die RNA Denaturierung Reaktion (20 & mgr; l) zu Röhrchen, die rRNA Entfernung Perlen.
    4. Passen Sie Pipette auf 45 & mgr; l und Pipette schnell nach oben und unten 20x zu mischen. Die Röhrchen bei RT für 1 min. Dann legen Sie Rohre in Magnetfuß bei Raumtemperatur für 1 min. Überstand in neue PCR-Röhrchen beschriftet und setzen diese Rohre wieder in Magnetfuß bei Raumtemperatur für 1 min. Dadurch wird sichergestellt, dass keine Perlen übertragen werden. Überstand in neu PCR-Röhrchen beschriftet.
    5. Vortex RNA / cDNA-spezifischen paramagnetischen Perlen und zu jedem Röhrchen 99 ul Perlen hinzuzufügen. Gently Pipette gesamteVolumen nach oben und unten 10x zu mischen. Wenn mit degradierten-RNA beginnt, fügen Sie 193 ul gut gemischte RNA / cDNA-spezifischen paramagnetischen Perlen in jedes Röhrchen. 15 min bei RT inkubiert. Dann legen Sie Rohre auf dem Magnet Stand bei Raumtemperatur für 5 min. Entfernen und den Überstand verwerfen.
    6. Mit 200 & mgr; l frisch zubereiteter 70% Ethanol (EtOH). Halten Sie Rohre auf Magnetfuß und kümmern sich nicht um die Perlen zu stören. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Sekunden, dann entfernen und Überstand verwerfen. Erlauben Röhrchen bei Raumtemperatur stehen, 5 - 10 min trocknen.
    7. Zentrifuge aufgetaut Elutionspuffer Raumtemperatur bei 600 × g für 5 sec. In 11 ul Elutionspuffer in jedes Röhrchen und sanft Pipette auf und ab 10-fach zu mischen. Röhrchen bei RT für 2 min. Die Röhrchen auf Magnetfuß bei Raumtemperatur für 5 min. Übertragen 8,5 & mgr; l des Überstandes auf neu markierten PCR-Röhrchen.
  2. Die Fragmentierung der rRNA Depleted RNA
    1. 8.5 ul elute, 8,5 ul prime und 8,5 ul Fragment Mischung in jedes Röhrchen. Pipette vorsichtig nach oben und unten 10x zu mischen. Die Röhrchen in Thermocycler mit Programm folgenden: vorge Heizdeckel bis 100 ° C, 94 ° C für 8 min, dann 4 ° C gehalten.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist für eine durchschnittliche Insertgröße von 155 bp zu erzeugen. Wenn durchschnittliche Fragmentgröße von RNA-Probe von weniger als 200 bp ist, überspringen Sie diesen Schritt und fahren Sie mit First Strand cDNA-Synthese.

2. cDNA-Synthese

  1. Synthetisieren First Strand cDNA
    1. Entfernen Synthese des ersten Strangs Mischung von -20 ° C und bei Raumtemperatur auftauen.
    2. Vorprogramm der Thermocycler mit den folgenden Einstellungen: Vorheizen Deckel Option und auf 100 ° C, dann 25 ° C für 10 min, 42 ° C für 15 min, 70 ° C für 15 min und halten bei 4 ° C . Speichern Sie dieses Programm als "Synthesize 1. Strand."
    3. Zentrifuge aufgetaut-Erststrangsynthese Mischrohr bei 600 & #215; g für 5 sec. Mix 1 & mgr; l-Transkriptase mit 9 ul Synthese des ersten Stranges Mix umkehren.
    4. In 8 ul Synthese des ersten Stranges und Reverse-Transkriptase-Mix zu jedem Röhrchen, sanft Pipette nach oben und unten 6x zu mischen. Zentrifugenröhrchen für 4 Sekunden eine feste Geschwindigkeit Mini-Tischzentrifuge bei 6,0 · g mit Flüssigkeit zu bringen, nach unten. Die Röhrchen in den Thermocycler und wählen Sie Synthesize 1 st Strand. Wenn der Thermocycler 4 ° C erreicht, entfernen Rohren und gehen unmittelbar zweite Strang cDNA zu synthetisieren.
  2. Synthesize zweite Strang cDNA
    1. Vorheizen Thermocycler bis 16 ° C mit Deckel vorgewärmt auf 30 ° C. Thaw zweiten Strang Master-Mix und die Resuspension Puffer auf Eis. Im Vorfeld, entfernen Sie die Flasche paramagnetischen Perlen von 4 ° C und lassen Sie sich für mindestens 30 Minuten stehen sie auf Raumtemperatur zu bringen.
    2. Werden 5 ul Resuspensionspuffer zu jedem Röhrchen PCR. Centrifuge zweiten Strang Master-Mix bei 600× g für 5 Sekunden und fügen Sie 20 ul zu jedem PCR-Röhrchen. Die Röhrchen in vorgewärmten Thermocycler bei 16 ° C für 1 Stunde. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Thermocycler und lassen Rohre auf Raumtemperatur kommen.
    3. Vortex die paramagnetischen Perlen, bis sie gut verteilt. Hinzufügen, 90 & mgr; l gut gemischten paramagnetischen Perlen zu jedem Röhrchen. Pipette vorsichtig das gesamte Volumen auf und ab 10-fach zu mischen. Die Röhrchen bei Raumtemperatur für 15 min. Die Röhrchen auf dem Magnet Stand bei Raumtemperatur für 5 min.
    4. Entfernen und entsorgen 135 ul Überstand dann verlassen Rohre auf dem Magnetständer EtOH waschen auszuführen. Mit 200 & mgr; l frisch hergestellte 80% EtOH in jedes Röhrchen, ohne die Perlen stören, inkubieren und dann bei Raumtemperatur für 30 sec. Entfernen und alle Überstand von jedem verwerfen. Wiederholen für insgesamt zwei 80% EtOH Wäschen.
    5. Lassen Sie Röhrchen bei Raumtemperatur stehen 5 - 10 min auf dem Magnetständer trocknen. Zentrifugieren Sie die aufgetaute Zimmer Temperature Resuspensionspuffer bei 600 × g für 5 sec. Entfernen Sie PCR-Röhrchen aus Magnetfuß. In 17,5 ul Resuspensionspuffers zu jedem Röhrchen PCR und sanft das gesamte Volumen bis Pipette und nach unten 10x gründlich zu mischen. Die Röhrchen für 2 min bei Raumtemperatur.
    6. Die Röhrchen auf dem Magnet Stand bei Raumtemperatur für 5 Minuten, dann Transfer 15 ul Überstand (doppelsträngige cDNA) zu 0,2 ml PCR-Streifen Rohre.
      HINWEIS: Dies ist eine sichere Haltepunkt als cDNA kann für bis zu 7 Tage bei -20 ° C gelagert werden.

3. Bibliothek Vorbereitung

  1. Adenylat 3 'Ends
    1. Entfernen A-Tailing-Mix von -20 ° C und bei Raumtemperatur auftauen. Vorprogramm der Thermocycler mit den folgenden Einstellungen: Wählen Sie die Vorheizung Deckel Option und auf 100 ° C, dann 30 min, 70 ° C für 5 Minuten und halten bei 4 ° C bei 37 ° C eingestellt. Speichern Sie dieses Programm als "ATAIL70."
    2. In 2,5 ul AufwirbelungPuffer zu jedem Röhrchen. Dann fügen Sie 12,5 ul aufgetaut A-Tailing-Mix. Pipette vorsichtig das gesamte Volumen auf und ab 10x gründlich zu mischen. Die Röhrchen in den Thermocycler und wählen Sie ATAIL70. Wenn der Thermocycler Temperatur bei 4 ° C, um die PCR-Röhrchen aus dem Thermocycler entfernen und gehen sofort Adapter abzubinden.
  2. Ligat - Adapter
    1. Entfernen Sie geeigneten RNA-Adapter Rohre, Ligierungspuffer und Resuspensionspuffers von -20 ° C und bei Raumtemperatur auftauen stoppen. Sie nicht die Ligationsmix Rohr von -20 ° C zu entfernen, bis entsprechende Anweisung in dem Protokoll zu tun. Entfernen Sie die Flasche paramagnetischen Perlen von 4 ° C und lassen Sie stehen für mindestens 30 Minuten auf Raumtemperatur zu bringen.
    2. Vorheizen Thermocycler bis 30 ° C und die Vorheizung Deckel Option und auf 100 ° C wählen. Centrifuge die aufgetauten RNA Adapter Röhrchen bei 600 × g für 5 Sekunden. Unmittelbar vor der Verwendung das Rohr Ligationsmix von -20 ° CLagerung.
    3. In 2,5 ul Resuspensionspuffers zu jedem Probenröhrchen. In 2,5 ul Ligationsmix. Liefert die Ligierungsgemisch Rohr auf -20 ° C Lagerung unmittelbar nach dem Gebrauch. In 2,5 ul der aufgetauten RNA Adapterindex zu jedem Probenröhrchen. Pipette vorsichtig das gesamte Volumen auf und ab 10x gründlich zu mischen.
    4. Zentrifugenröhrchen für 4 Sekunden eine feste Geschwindigkeit Mini-Tischzentrifuge bei 6,0 x g verwendet wird. Die Röhrchen in den vorgewärmten Thermocycler. Schließen Sie den Deckel und Inkubation für 10 min bei 30 ° C.
    5. Entfernen Sie Rohre aus Thermocycler und mit 5 ul Puffer Stop Ligatur zu jedem Röhrchen die Ligatur zu inaktivieren. Pipette vorsichtig das gesamte Volumen auf und ab 10x gründlich zu mischen.
    6. Wiederholen Sie waschen gemäß Abschnitt 2.2.3 - 2.2.4, 42 & mgr; l der gemischten paramagnetischen Kügelchen verwenden, und Verwerfen 79,5 ul Überstand. Mit den Rohren auf dem Magnetständer, lassen Sie die Proben der Luft trocknen bei Raumtemperatur für 5 - 10 min.
    7. Entfernen Sie die PCR-Streifen Röhrchen aus demMagnetfuß und zu jedem Röhrchen 52,5 ul Resuspensionspuffers hinzufügen. Pipette vorsichtig das gesamte Volumen auf und ab 10x gründlich zu mischen. Inkubieren der Röhrchen bei Raumtemperatur für 2 min. Die Röhrchen auf dem Magnet Stand bei RT für 5 min oder bis die Flüssigkeit klar. Dann werden 50 & mgr; l Überstand aus jedem Röhrchen auf neue 0,2 ml PCR-Streifen Rohre. Achten Sie darauf, nicht die Perlen zu stören.
    8. Wiederholen Sie waschen gemäß Abschnitt 2.2.3 - 2.2.4, 50 ul gemischt paramagnetischen Kügelchen verwenden, und Verwerfen 95 & mgr; l Überstand. Mit den Rohren auf dem Magnetständer, lassen Sie die Proben der Luft trocknen bei RT 5 - 10 min.
    9. Entfernen Sie die PCR-Streifen Röhrchen aus dem Magnetfuß und fügen Sie zu jedem Röhrchen 22,5 ul Resuspensionspuffers. Pipette vorsichtig das gesamte Volumen auf und ab 10x gründlich zu mischen.
    10. Die Röhrchen bei RT für 2 min. Die Röhrchen auf dem Magnet Stand bei Raumtemperatur für 5 Minuten oder bis die Flüssigkeit klar. Transfer 20 & mgr; l Überstand aus jedem Röhrchen auf eineneue 0,2 ml PCR-Streifen Rohr. Achten Sie darauf, nicht die Perlen zu stören. Dies ist eine sichere Haltepunkt und cDNA kann für bis zu 7 Tage bei -20 ° C gelagert werden.

4. Bibliothek Amplification

  1. Bereichern DNA - Fragmenten
    1. Entfernen Sie die PCR-Master-Mix, PCR-Primer-Cocktail und Resuspensionspuffers von -20 ° C Lagerung und bei Raumtemperatur auftauen. Entfernen Sie die Flasche paramagnetischen Perlen von 4 ° C Lagerung und stehen lassen für mindestens 30 Minuten auf Raumtemperatur zu bringen.
    2. Vorprogramm der Thermocycler mit den folgenden Einstellungen: Wählen Sie den Deckel Option vorheizen und auf 100 ° C, dann anfängliche Denaturierung bei 98 ° C eingestellt für 30 Sekunden, 15 Zyklen der Denaturierung bei 98 ° C für 10 sec, Glühen bei 60 ° C für 30 sec, und Verlängerung bei 72 ° C für 30 sec, eine letzte Verlängerungszyklus bei 72 ° C für 5 Minuten und halten bei 4 ° C. Speichern Sie dieses Programm als "PCR".
    3. Zentrifugieren Sie die aufgetauten PCR Mastermischen und PCR-Primer Röhrchen bei 600 × g für 5 Sekunden. Zugabe von 5 & mgr; l der aufgetauten PCR Primer an jedem Probenröhrchen. In 25 ul aufgetaut PCR Master-Mix zu jedem Probenröhrchen. Pipette vorsichtig das gesamte Volumen auf und ab 10x gründlich zu mischen.
    4. Legen Sie die mit einer Kappe bedeckt PCR Streifen Röhrchen in der vorprogrammierten Thermocycler. Schließen Sie den Deckel und PCR-Programm. Wenn PCR abgeschlossen ist, entfernen Sie Rohre aus Thermocycler und halten auf dem Eis.
    5. Wiederholen Sie waschen gemäß Abschnitt 2.2.3 - 2.2.4, 50 ul gemischt paramagnetischen Kügelchen verwenden, und Verwerfen 95 & mgr; l Überstand. Mit den Rohren auf dem Magnetständer, lassen Sie die Proben der Luft trocknen bei Raumtemperatur für 5 - 10 min.
    6. Entfernen Röhrchen aus dem Magnetfuß und fügen 32,5 ul Resuspensionspuffers zu jedem Probenröhrchen. Pipette vorsichtig das gesamte Volumen auf und ab 10x gründlich zu mischen. für 2 min bei RT inkubiert. Legen Sie die PCR-Röhrchen auf dem Magnet Stand bei Raumtemperatur für 5 Minuten oder bis die Flüssigkeit klar. Dann Transfer 30 ul supernatant an die frische 0,2 ml PCR-Röhrchen.
    7. Führen Quantifizierung der cDNA unter Verwendung eines Fluorometers 7 und cDNA - Qualität bestimmen 8 ein Kapillarelektrophorese - System.
      HINWEIS: Dies ist eine sichere Haltepunkt und cDNA kann für bis zu 7 Tage bei -20 ° C gelagert werden. Hinweis: Diese Bibliothek ist eine RNA-Seq-Bibliothek angesehen wird.
      Die nachfolgenden Schritte führen zu einer Capture-Bibliothek.

5. Die Hybridisierung, Capture and Sequencing

  1. Multiplexed Hybridization
    1. Entfernen Sie benutzerdefinierte hydratisiert Sonden, Cot-1-DNA, Universal blockiert Oligos und Adapter spezifischen Blockierung Oligos von -20 ° C und Auftauen auf Eis.
    2. In einem niedrigen binden 1,5-ml-Röhrchen, kombinieren 500 ng DNA (125 ng pro Probe, wenn Multiplexing 4 Proben), 5 ul Cot-1-DNA (1 ug / ul), 1 ul Universal-Blockierung Oligos, 0,5 ul p7 (6 Nukleotid) Adapter spezifische Oligos (dieser Betrag Blockierung kann in Abhängigkeit von Multiplex-conditi werden müssen angepasstons) und 0,5 ul p7 (8 Nukleotid) Adapter spezifischen Blockierung Oligos (dieser Betrag auf Multiplex-Bedingungen abhängig eingestellt werden müssen).
    3. Platzieren Sie die Probenröhrchen in einem Vakuum-Konzentrator mit Kappe offen die entgegengesetzte Drehrichtung gegenüber. Trockengehalte bei 45 ° C für 20 min oder bis zur vollständigen Verdampfung der Flüssigkeit.
    4. Resuspendieren getrocknet Gehalt mit 8,5 ul 2x Hybridisierungspuffer, 3,4 ul Hybridisierungs Komponente A und 1,1 ul Wasser frei Nuklease. Warten Sie 10 min für die Resuspendierung und Wirbel alle 2,5 min. Übertragen resuspendiert-Material auf eine 0,2 ml PCR-Röhrchen und Inkubation bei 95 ° C für 10 min auf einem Thermocycler.
    5. Entfernen Rohr Hybridisierungsprobe aus Thermocycler und fügen Sie 2 ul benutzerdefinierte Sonden in einer Konzentration von 1,5 erneut suspendiert pmol / ul. Alternativ fügen 4 ul benutzerdefinierten bei einer Konzentration von 0,75 pmol / ul resuspendiert Sonden. Inkubieren über Nacht Hybridisierungsreaktion (16-24 h) bei 65 ° C.
      HINWEIS: Probes von verschiedenen Anbietern erworben werden sollten verwendet werden und den Anweisungen des Herstellers befolgt werden. Die Dauer der Hybridisierungsschritt kann auch variieren.
  2. Bead Vorbereitung und Aufnahme
    1. Entfernen Flasche Streptavidin-gekoppelter paramagnetischen Perlen von 4 ° C und Äquilibrierung für 30 min bei Raumtemperatur. Verdünnen 10x Waschpuffer (I, II, III und stringent) und 2,5x Bead Waschpuffer 1x Arbeitslösungen erstellen.
    2. Aliquot 140 ul 1x Waschpuffer I in in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen. Wärme gesamte Menge des 1x stringent Puffer und Aliquot von 1x Waschpuffer bei I 65 ° C in einem Heizblock für mindestens 2 Std.
    3. Aliquot 100 ul Streptavidin-gekoppelten paramagnetischen Kügelchen pro Bild in ein 1,5-ml-Röhrchen. Setzen Sie auf Magnet und Überstand verwerfen. In 200 ul Perle Waschpuffer pro 100 & mgr; l Perlen und Wirbel für 10 Sekunden. Setzen Sie auf Magnet für 2 - 5 min oder bis Überstand klar ist. Sobald Überstand klar ist, verwerfen und neuTorf einmal für insgesamt zwei Waschungen.
    4. Nach dem Entfernen des Waschpuffer Korn, Startvolumen gleichen Volumen Perle Waschpuffer als Anfangs hinzufügen (dh 100 & mgr; l für ein Capture). Resuspendieren und in ein 0,2 ml PCR-Röhrchen. Das Röhrchen in magnetischen Rack für 2 - 5 min oder bis Überstand klar ist. Überstand verwerfen.
    5. Sowohl mit der Hybridisierungsprobe und Perlen in den Thermocycler bei 65 ° C, Transfer der Hybridisierungsmischung auf die Wulst Rohr und Pipetten und 10x bis zu mischen. Inkubieren bei 65 ° C für 45 min, Wirbel und Spin-down-Probe für 4 Sekunden eine feste Geschwindigkeit (6,0 × g) Tisch Mini-Zentrifuge.
  3. Bead Wash
    1. Entfernen Fangrohr aus Thermocycler und fügen 100 ul vorgewärmte 1x Waschpuffer I mit dem Rohr und Wirbel für 10 Sekunden zu mischen. Das Gemisch wird in einem frischen niedrigen binden 1,5-ml-Tube. Das Röhrchen wird in einem magnetischen Trenngitter und ermöglichen 2-5 min zur Trennung oder bis Überstand klar ist. Discard Überstand.
    2. In 200 ul vorgewärmte 1x strengen Waschpuffer und Pipette nach oben und unten 10-mal zu mischen. für 5 min bei 65 ° C inkubieren. Das Röhrchen wird in der magnetischen Trenngitter und lassen 2 - 3 min zur Trennung oder bis Überstand klar ist. Überstand verwerfen. Wiederholen stringenten Wasch nochmals für insgesamt zwei Waschungen.
    3. In 200 ul Raumtemperatur 1x Puffer waschen I und Wirbel für 2 Minuten zu mischen. Das Röhrchen wird in der magnetischen Trenngitter und damit 2 bis 5 min zur Trennung oder bis Überstand klar ist. Überstand verwerfen.
    4. In 200 ul Raumtemperatur 1x Puffer waschen II und Vortex für 1 min zu mischen. Das Röhrchen wird in der magnetischen Trenngitter und damit 2 bis 5 min zur Trennung oder bis Überstand klar ist. Überstand verwerfen.
    5. In 200 ul Raumtemperatur 1x Waschpuffer III und Vortex für 30 Sekunden zu mischen. Das Röhrchen wird in der magnetischen Trennung Rack ermöglicht 2 bis 5 min zur Trennung oder bis Überstandist klar. Überstand verwerfen.
    6. Entfernen Sie den Schlauch aus dem magnetischen Trennung Rack und fügen Sie 20 ul Nuklease-freies Wasser, um die Perlen zu resuspendieren. Gut mischen durch Pipettieren nach oben und unten 10-mal.
  4. Geben Sie Capture - PCR - Amplifikation
    1. Entfernen paramagnetischen Perlen von 4 ° C und Äquilibrierung für 30 min bei Raumtemperatur.
    2. Entfernen Sie die Hot-Start-PCR-Ready-Mix (2x) und PCR-Primer Mix von -20 ° C und Tauwetter bei RT und dann auf Eis. Bereiten Bibliothek Verstärkung Master Mix von 27,5 ul 2x Hot-Start-PCR-Ready-Mix mit 2,75 & mgr; l PCR-Primer 1 und 2,75 & mgr; l-PCR-Primer die Kombination von 2 (diese Mengen sind für 1-Hybridisierungs Bibliothek plus 10% Überschuß).
    3. Setup die Reaktion in PCR-Röhrchen von 20 & mgr; l Kügelchen Zugabe und erfasst DNA mit 30 ul Bibliothek Verstärkungs Mastermix für ein Gesamtvolumen von 50 & mgr; l. Cap Rohr richtig und Wirbel zu mischen. Zentrifugenröhrchen für 4 Sekunden eine feste Geschwindigkeit Mini-Reiterle-Zentrifuge bei 6,0 x g.
      1. Legen Sie die folgende PCR-Programm auf: Wählen Sie die Vorheizung Deckel Option und auf 100 ° C, dann setzen anfängliche Denaturierung bei 98 ° C für 45 sec, 10 - 12 Zyklen der Denaturierung bei 98 ° C für 15 Sekunden, Annealing bei 65 ° C für 30 sec und Verlängerung bei 72 ° C für 60 sec, eine letzte Verlängerungszyklus bei 72 ° C für 60 sec und halten bei 4 ° C.
    4. Entfernen Probe aus Thermocycler und fügen Sie 75 ul paramagnetischen Kügelchen. Gut mischen und Inkubation bei RT für 15 min.
    5. Die Röhrchen auf dem Magneten bei Raumtemperatur für 2 bis 3 min und dann Überstand zu entfernen. Waschen Sie Perlen auf Magnet von 200 ul 80% Ethanol Zugabe, Inkubation für 30 Sekunden dann Überstand zu entfernen. Wiederholen für insgesamt zwei 80% Wäschen.
    6. bei RT inkubieren 5 - 10 min Kügelchen zu trocknen lassen. Nicht übertrocknen zu knacken. Resuspendieren Perlen in 22 ul Tris-EDTA pH 8,0 (1x TE-Lösung) und 3 min zur Elution ermöglichen. Legen Sie Probe auf Magnet 3 - 5 min then Transfer 20 ul der eluierten Produkt zu einem frischen-Lowbind 1,5-ml-Röhrchen, werden keine Kügelchen sichergestellt übertragen.
    7. Führen Sie die Quantifizierung der erfassten cDNA unter Verwendung von Fluorometer 7 und bestimmen erfasst cDNA Qualität unter Verwendung eines Kapillar - Elektrophorese - System 8.
  5. Desktop - Sequencer Laden Verfahren 9
    1. Verdünnte erfasst cDNA-Bibliothek zu einer Endkonzentration von 4 nM unter Verwendung von 10 mM Tris-Cl pH 8,5 mit 0,1% Tween 20. Tauen 10 N NaOH und Hybridisierungspuffer auf Eis. Etwa 30 Minuten vor dem Gebrauch auftauen Desktop-Sequenzer v2 Reagenzienkit Box 1 in RT Wasser. Füllen Sie nicht über MAX FILL LINE 10. Bitte beachten Sie, dies ist eine Sequenzierung Plattform-spezifische Verfahren und kann den Anweisungen des Herstellers variieren.
    2. Bereiten Sie 1 ml von 0,2 N NaOH von 20 ul 10 N NaOH kombiniert mit 980 ul Nuklease freiem Wasser in einem Mikrozentrifugenröhrchen (immer frisch zubereiten). Verdünnen Sie die PhiX Bibliothek (Library Control) bis 4 nM durchKombination von 2 & mgr; l 10 nM Bibliothekssteuerung mit 3 & mgr; l 10 mM Tris-Cl pH 8,5 mit 0,1% Tween 20.
    3. Denaturieren endgültige Bibliothek und Bibliothek Kontrolle von 5 ul 4nM Bibliothek Kombination mit 5 ul 0,2 N NaOH und Wirbel kurz zu mischen. Zentrifugenröhrchen für 4 Sekunden eine feste Geschwindigkeit Mini-Tischzentrifuge bei 6,0 x g verwendet wird. bei RT inkubieren 5 min Bibliotheken zu denaturieren.
    4. Hinzufügen 990 & mgr; l vorgekühltem Hybridisierungspuffer zu den Röhrchen 10 & mgr; l denaturierter Bibliotheken enthält. Dies resultiert in einer 20 pM Bibliothek. Mark das denaturierte 20 pM Bibliothek mit dem Datum und kann für bis zu 3 Wochen bei -20 ° C gelagert werden.
    5. Mischen Sie 375 ul 20 pM Bibliothek Steuerung mit 225 & mgr; l vorgekühltes Hybridisierungspuffer und verdünnte Bibliothek Steuerung in einer 12.05-Bibliothek Kontrolle zu führen. Invert mehrmals die Lösung zu mischen.
    6. Kombinieren Sie 594 ul denaturiert endgültige Bibliothek mit 6 ul 12.05 denaturierten Bibliothek Kontrolle und Wirbel zu mischen. Stellen Sie die kombinierte sample Bibliothek und Bibliothek Kontrolle beiseite auf Eis, bis Proben sind bereit, in die Desktop-Sequenzer Reagenzpatrone zu laden.

6. Datenanalyse

  1. Sequence Quality Assessment
    1. Berechnen Sie die Qualität der Roh - Sequenzdaten (fastq - Dateien) unter Verwendung von Sequenzqualitätsbeurteilung 11.
      HINWEIS: Dieser Schritt hilft, die Daten zu prüfen, bevor es weiter zu nachgelagerten Analyse unterzogen wird. Die Software läuft mit eingebauten Parameter und erzeugt einen Satz von Metriken für jede fastq Datei.
  2. Ausrichtung
    1. Richten Sequenz liest (fastq Dateien) mit dem Bezugs menschlichen Genoms hg19 und Transkriptom mit Tophat2 12 (Version 2.0.10) , während die Bereitstellung bekannter Transkripte als GTF - Datei. Der Ausgang ist in der Form eines binären Ausrichtungsformat der BAM-Datei bezeichnet.
    2. Führen Sie die nach Verarbeitungsschritte einschließlich Sortierung und Indizierung mit samtools 13 (Version 0.1.19) Auf der BAM-Datei. Führen Sie doppelte Kennzeichnung, Neuordnen SAM, legen Sie Größenberechnung und das Hinzufügen oder Austauschen von Lesegruppen mit Picard Tools 14 (Version 1.84).
  3. RNA-Seq Quality Assessment
    1. Berechnen Sie eine Reihe von Qualitätskontrolle Metriken für RNA-Seq Daten RNA-Seq Qualitätsbeurteilung verwendet. Die Eingabe in dieser Software ist ein BAM - Datei 15 von dem Tophat2 Ausrichtung. Die Ausgabe ist eine HTML - Datei , die Gesamtlesezählung auflistet, Duplikate, kartiert lesen Prozentsatz und rRNA Prozentsatz usw., unter anderem.
  4. Variant Berufung
    1. Verwenden STAR (Version 2.4.0) 16 für die Ausrichtung und dann single nucleotide nennen Varianten mit GATK der (Version 3,3-0) HaplotypeCaller 17 .Follow GATK BAM Nachbearbeitungsschritte und Filterkriterien Flagge und entfernen False Positives aus der Ausgabe.
  5. Gen Ausdruck
    1. Berechnen Genexpression using Manschettenknöpfe Software (Version 2.1.1) von Tuxedo Suite 18.
      HINWEIS: Die Eingabe ist eine BAM-Datei von Tophat2 Ausrichtungswerkzeug. Die Ausgabe wird an der Isoform, Gen- und Transkriptebene erzeugt, wobei die Expression als FPKM (Fragmente pro Kilobasen pro Million Reads mapped) berechnet wird.
  6. Fusion Berufung
    1. Rufen Fusionen aus jeder Probe mit ChimeraScan 19 (Version 0.4.5), Tophat Fusion 20 individuelle und Trup 21. Anmerken die Fusionen für Domains mit Oncofuse 22 (Version 1.0.9b2).

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Representative Results

Eine schematische Hervorhebung Schlüsselschritte in RNA-Seq - Capture ist in Fig . 1 vier Krebszelllinien mit bekannten Mutationen , die Wirksamkeit der RNA-Seq - Capture - Technik (K562 mit ABL1 Fusion, LC2 mit RET - Fusion, EOL1 mit PDGFRalpha Fusion und RT- verwendet wurde gezeigt , demonstrieren 4 mit FGFR3 Fusion). Die vier Proben wurden gepoolt und sequenziert mit 2x 100 bp auf einem Desktop-Sequenzer liest, die fastq Dateien erzeugt. Fastq Dateien wurden durch eine RNA-Seq Analyse Pipeline laufen, die fünf Hauptkomponenten umfasst: 1) Bewertung der Qualitätskontrolle, 2) die Ausrichtung auf die menschliche Transkriptom, 3) Genexpression Quantifizierung, 4) Fusion Berufung und 5) Variante Berufung. Die Ausrichtung Datei (BAM) wird verwendet, Einzel-Nukleotid-Varianten zu nennen und die Genexpression zu berechnen. Fusions verwenden Fusion Anrufer genannt, wie TopHat Fusion (Durchführung ihrer eigenen Ausrichtung) und der Ausgang wird usin kommentierteg Fusion Erkennungssoftware.

Vergleich der Genexpression von RNA-Seq und Erfassung zeigt die Anreicherung von gezielten Transkripte von 10 bis 1000-fache des Capture - Methode unter Verwendung von (2A). Zusätzlich zeigt Figur 2B eine Zunahme in dem Prozentsatz der Abbildung auf die Zielregionen Transkript liest Capture mit im Vergleich zu RNA-Seq. Bewertung der Kontrollmaßnahmen Qualität ist in Abbildung 3 dargestellt. Erfassen und RNA-Seq führen ebenso in Bezug auf die Ausrichtung auf das Transkriptom (3A, 94% vs. 93%) und Insert - Größe (3B, 174 bp vs. 162 bp) bedeuten. Verwendung des Erfassungsverfahren, ein höherer Prozentsatz an exonische Regionen sequenziert (3C, 77% vs. 60%), und umgekehrt ein geringerer Prozentsatz der Intronregionen sind sequenziert (3D, 4% vs. 20%). Insgesamt Lese Zählungen pro Probe werden in 3E dargestellt (3F, 4% vs. 15%).

Fusionserfassungsausgabe in Tabelle 1 gezeigt wird erzeugt mit normalisierten Fusionsstütz liest. Capture-RNA-Seq erfolgreich war in Fusionen für alle vier Zelllinien zu erkennen. Vergleich von Einzel - Nukleotid - Varianten genannt in überlappenden Bereichen der Aufnahme und RNA-Seq in Abbildung 4 dargestellt. Dies zeigt eine hohe Übereinstimmung der Varianten zwischen Erfassung und RNA-Seq innerhalb der Zielregion.

Abbildung 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung der RNA-Seq - Capture - Schritte. In dieser experimentellen Demonstration ist RNA erste depleted ribosomaler RNA, die durch chemische Fragmentierung und Synthese von komplementärer DNA (cDNA) unter Verwendung von reverser Transkriptase, gefolgt. Als nächstes wird die cDNA polyadenylierte und an beiden Enden an plattformspezifischen Adapter ligiert, um eine Bibliothek zu erzeugen. Nur cDNA-Bibliotheken mit der richtigen Adapter werden dann durch PCR amplifiziert. Bibliotheken werden dann an individuelle Oligonukleotid-Sonden hybridisiert und unter Verwendung von magnetischen Kügelchen eingefangen. Diese geringe Menge der aufgenommenen Bibliothek muss ein zweites Mal für die nächste Generation Sequenzierung genug, um verstärkt werden. Mehrere Bibliotheken können dann parallel sequenziert werden. Die Sequenzierung Daten werden für die RNA - Ereignisse von Interesse, wie Genfusionen, Expression oder Mutationen analysiert. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2 CERGLEICH von Targeted Gene im Aufnahme gegen RNA-Seq. A, Genexpression Vergleich zwischen Erfassung und RNA-Seq in vier Krebszelllinien K562, LC2, EOL1 und RT-4 gemessen liest pro Kilobasen- pro Million abgebildet liest (FPKM) (Log - Skala). Gezielte Gene von Interesse angereichert sind (blau) im Vergleich zu Nicht-Zielgene (grau). B, Prozentsatz von Reads Zuordnung zu Zielregion erhöht wird im Aufnahme gegen RNA-Seq - Bibliotheken in vier Krebszelllinien. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version diese Figur.

Figur 3
Abbildung 3. Die Sequenzierung Metrics von Capture im Vergleich zu RNA-Seq in vier repräsentativen Krebszelllinien. A, Prozentsatz der Abbildung auf die Transkriptom liest, C, Prozentsatz der in exonische Regionen liest. D, Prozentsatz der in Intron Regionen liest. E, Totalsequenzierung liest. F, Prozentsatz der Abbildung auf der ribosomalen RNA liest. Bitte klicken Sie hier anzuschauen größere Version der Figur.

Zelllinie Verschmelzung Bibliothek Typ Gesamt gelesen On Target Liest Normierte Fusion Unterstützung Liest (NFSR)
TophatFusion ChimeraScan TROBEN
K562 BCR-ABL RNA-Seq 150300482 279438 0 438 0
Erfassung 9341148 7566087 598 343 0
LC2 CCDC6-RET RNA-Seq 128861790 307566 0 97 0
Erfassung 12320692 10314284 71 44 6
EOL1 FIP1L1-PDGFRA RNA-Seq 135321406 225222 0 0 170
Erfassung 9317418 7680818 143 0 7
RT4 FGFR3 -TACC3 RNA-Seq 161350024 208741 0 131 469
Erfassung 8305950 6563574 358 88 34

Tabelle 1. Fusion Erkennung für Capture im Vergleich zu RNA-Seq von K562, LC2, EOL1 und RT-4. Diese Tabelle zeigt vier Krebszelllinien und drei verschiedenen Fusionserkennungsalgorithmen, TopHat2, ChimeraScan und Trup in dieser Demonstration genutzt. Diese Tabelle zeigt die Fähigkeit, Fusionen mit Capture zu erkennen, die weniger als insgesamt 10 Millionen liest im Vergleich zu mehr als 60 Millionen liest für RNA-Seq genutzt. Fusion Stütz liest berechnet wurden durch Fusion Dividieren Unterstützung liest von Kinase liest, multipliziert mit einer Million.

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Abbildung 4. SNV Aufruf für Capture im Vergleich zu RNA-Seq. Diese Venn - Diagramme zeigen die Anzahl der Single Nucleotide Varianten (SNVs) , die durch Abscheidung und RNA-Seq für jede der vier Zelllinien (K562, LC2, EOL1 und RT-4) nachgewiesen wurden. Dies zeigt hohe Übereinstimmung von SNVs zwischen Capture and RNA-Seq innerhalb gezielte-Region. K562 (81,3%), LC2 (78,3%), EOL1 (89,5%) und RT-4 (73,9%) Bitte hier klicken , um eine größere Version zu sehen diese Figur.

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Discussion

RNA-Seq Capture ist eine Zwischen Strategie zwischen RNA-Seq und Microarray-Ansätze für einen ausgewählten Teil der Transkriptom-Auswertung. Die Vorteile von Capture beinhalten Kosten, schnelle Durchlaufzeit auf einem Desktop-Sequenzer, einen hohen Durchsatz und der Nachweis genomischer Veränderungen reduziert. Das Verfahren angepasst werden kann , nicht-kodierenden RNAs 23, erkennen single nucleotide zu charakterisieren Varianten 4-6, RNA - Splicing untersuchen und 24 Genfusionen oder strukturelle Umlagerungen zu identifizieren. Weiterhin kann dieser Ansatz zur klinischen oder verarbeiteten Proben angewendet werden , die 24,25 Fixierung mit Formalin und eingebettet in Paraffin Blöcken unterzogen wurden.

Es gibt mehrere bedeutende Vorteile von RNA-Seq capture im Vergleich zu Mikroarray, Real-time quantitative PCR, Sanger-Sequenzierung und DNA-Sequenzierung. Microarray zeichnet sich durch hohe Hintergrund begrenzt durch Kreuzhybridisierung und nicht-spezifischen Sonden binden. Quantifizierung von Genen, die mit low Ausdruck ist wegen Hintergrundrauschen beschränkt, während stark exprimierte Gen Messungen von Signalsättigung 1 betroffen sind. Im Vergleich zu RNA-Seq-Capture erweist sich real-time PCR schwierig zu reproduzieren. Zusätzlich RNA-Seq zur Erkennung von neuer Transkripte ermöglicht, erfordert weniger Ausgangsinputmaterial und kann alternatives Spleißen 26 .Im Gegensatz zu Sanger - Sequenzierung erfassen, ermöglicht RNA-Seq für einen höheren Durchsatz und Analyse von niedrigen ausgedrückt miRNA. Sanger-Sequenzierung hat sich als ein wertvolles Werkzeug für die Überprüfung der Fusionen mit bekannten Exon-Exon-Verbindungen und somatische Mutationen DNA sein, aber Identifizierung neuer Fusionen von Anforderungen eines priori Kandidatenunterbrechungs behindert wird. DNA-Sequenzierung ist nicht kosteneffizient, erfordert größere Speicherkapazität für Daten, und unfähig ist, Nachweis von post-transkriptionalen Modifikationen.

Es gibt mehrere wichtige Schritte in RNA-Seq-Capture beteiligt. Erstens, zur Verbesserung der Ausbeute von Library-Produkte aus derRNA / cDNA-spezifischen paramagnetischen Perlen und paramagnetischen Kügelchen während Waschungen werden nicht vorsichtig die Perlen über trocken, was zu Ausbeuteverlust führen wird. Auch nicht unter trocknen die Kügelchen, sicherzustellen, dass alle von Ethanol aus den Probenröhrchen, wie Ethanol entfernt wird, kann cDNA Ausbeute verringern. Zweitens ist die Hybridisierung von cDNA - Bibliotheken mit komplementären Sonden abhängig von gleich bleibende Temperatur, wir empfehlen Erwärmung Waschpuffer I und Strikte Buffer auf 65 ° C für mindestens zwei Stunden im Voraus. Ferner wird nach der Hybridisierung ist es wesentlich , während des Bindens und Waschschritte 65 ° C zu halten. Die Sonden hier verwendet wurden für die Exons von Genen von Interesse für die Entwicklung von Arzneimitteln entwickelt, einschließlich Kinasen, Gene gemeinsam Umlagerungen wie Transkriptionsfaktoren beteiligt sind, und Housekeeping-Genen. Außerdem Gen Inhalt ist anpassbar und Capture-Panel-Größen variieren kann. als neue Informationen über Genomregionen Weiterhin entsteht, können zusätzliche Sonden entwickelt und hinzugefügt werden, um ter bestehende Aufnahmetafel.

Auswertung der Ausrichtung Metriken, die speziell auf Zielkurs, liefert Informationen darüber, wie gut die Zielregion angereichert wurde. Der Low-Zielrate auf eine fehlgeschlagene Hybridisierung und Einfangen zurückgeführt werden kann, wodurch die gewünschte Zielregion nicht erfasst und angereichert. In diesem Fall wird eine erneute Hybridisierung und Erfassung der Bibliothek Satz muss durchgeführt werden. Der Low-Zielrate kann auch durch Ausfall sein rRNA zu verarmen, die durch Berechnung des Prozentsatzes der rRNA in der Probe bestätigt werden kann. Hohe rRNA Prozentsatz innerhalb der Probe wird erneut Vorbereitung der Probe erfordern mit rRNA Depletion beginnen. Außerdem, wenn Bibliotheks Konzentration unter den Anforderungen für die Hybridisierung und Einfangen fällt, wäre es ratsam, die Menge des Ausgangs Eingang für den Probentyp und die Qualität (Bereich 50-1000 ng) zu optimieren.

Zwar gibt es mehrere Vorteile zur gezielten RNA-Seq-Anwendungen sind, gibt es auch EinschränkungenErwägen. Proben mit schlechter Qualität RNA basierend auf RIN oder der Grad der Fragmentierung kann nicht die Qualität Bibliotheken für die Sequenzierung ergeben. Mehrere Gruppen Erfolg mit Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Proben unter Beweis gestellt haben, aber es gibt Beispiele , die nicht 24,25,27 für die Sequenzierung passieren. da RNA-Seq Capture auf bekannte Transkripte Weiterhin konzentriert, verliert sie die Vorteile der unvoreingenommene RNA-Seq für neue oder nicht-Transkripte. Darüber hinaus ist für SNP-Nachweis können RNA-Seq Methoden nur Mutationen in exprimierten Transkripte nachzuweisen.

Zukunftschancen von RNA-Seq-Capture umfassen Forschung und klinische Anwendungen. Kürzliche Entdeckung von Tausenden von langen nicht-kodierenden RNA und ihre Rolle in der Biologie wird fokussierter Charakterisierung erforderlich. In der Klinik kann RNA-Seq-Capture über Forschungstests erweitern und übersetzen in die klinische Assays menschlicher Krankheiten wie Krebs, Infektionskrankheiten, und nicht-invasive Tests zu charakterisieren. In Verbindung mit der genomischen Sequenzierung approaChes können RNA-Seq-Capture integriert werden, um das zum Ausdruck Genom zu untersuchen und zu charakterisieren.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thermomixer R Eppendorf 21516-166
Centrifuge 5417R Eppendorf 5417R
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004
Molecular Biology Grade Ethanol Sigma Aldrich E7023-6X500ML
Thermoblock 24 x 1.5 ml Eppendorf 21516-166
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles) Illumina MS-102-2002
MiSeq Desktop Sequencer Illumina
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA Illumina RS-122-2301
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p5 IDT 127040822
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(6nt) IDT 127040823
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(8nt) IDT 127040824
Agencourt® AMPure® XP - PCR Purification beads  Beckman-Coulter A63880
Dynabeads® M-270 Streptavidin Life Technologies 65305
COT Human DNA, Fluorometric Grade, 1 mg Roche Applied Science 05480647001
Qubit® Assay Tubes  Life Technologies Q32856
Qubit® dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
SeqCap® EZ Hybridization and Wash Kits  (24 or 96 reactions) Roche NimbleGen  05634261001 or 05634253001 
Qubit® 2.0 Fluorometer  Life Technologies Q32866
10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution) IDT
Tween20 BioXtra Sigma P7949-500ML
Nuclease Free Water Life Technologies AM9937
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96–Well Fast Rection Module Biorad 185-1196
SeqCap EZ Hybridization and Wash Kits Roche Applied Science 05634253001
SuperScript II Reverse Transcription 200 U/μl Life Technologies 18064-014
D1000 ScreenTape Agilent Technol. Inc. 5067-5582
Agencourt RNAClean XP - 40 ml Beckman Coulter Inc A63987
RNA ScreenTape Agilent Technol. Inc. 5067-5576
RNA ScreenTape Ladder Agilent Technol. Inc. 5067-5578
RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent Technol. Inc. 5067-5577
Sodium Hydroxide Sigma 72068-100ML
DynaBeads MyOne Streptavidin T1 Life Technologies 65602
DYNAMAG -96 SIDE EACH Life Technologies 12331D
Chloroform Sigma C2432-1L
KAPA HotStart ReadyMix KAPA Biosystems KK2602
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Scientific
My Block Mini Dry Bath Benchmark BSH200
D1000 Reagents Agilent Technol. Inc. 5067- 5583
Vacufuge Plus Eppendorf 022829861 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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