微RNA循环使用定量DNA结合染料化学和液滴的数字PCR

Bioengineering

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Ferracin, M., Salamon, I., Lupini, L., Miotto, E., Sabbioni, S., Negrini, M. Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR. J. Vis. Exp. (112), e54102, doi:10.3791/54102 (2016).

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Abstract

循环微RNA(miRNA)(无细胞的),从细胞释放到血流中。在循环的特定微小RNA的量已与一种疾病状态,并具有被用作疾病的生物标志物的潜力。用于使用基于染料的化学和液滴数字PCR技术循环微RNA定量的灵敏和准确的方法最近已开发。具体而言,使用锁核酸(LNA)为基础的miRNA特异性引物用绿色荧光DNA结合染料在相容的液滴数字PCR系统能够获得特定miRNA的绝对定量。在这里,我们描述了如何执行此技术,以评估在生物流体,例如血浆和血清的miRNA量,是可行和有效的。

Protocol

从血浆或血清中分离的microRNA

注意:血浆和血清制剂是循环的miRNA定量的相关步骤。存在用于血浆和血清制备没有优选的程序。唯一要考虑的重要的事情是,所有来自同一实验的样品必须使用完全相同的工作流程进行处理。从200μl的血清或血浆开始。总RNA可以从血清或血浆用市售试剂盒进行分离。

1,协议总RNA(miRNA的包括)隔离

  1. 在冰上解冻血清/血浆样本。
  2. 1毫升裂解试剂( ,Qiazol加)添加到200微升血清/血浆。
  3. 涡旋混匀,含在板凳上的匀浆在室温5分钟管。
  4. 从添加C的合成的miRNA CEL-MIR-39-3p的4.16纳米的解决方案的3微升线虫
  5. 加入200μl氯仿。摇动该管剧烈持续15秒。第广场在室温替补2分钟就电子管。
  6. 离心机以12,000 xg离心15分钟,在4℃,以获得相分离:上层水相含有的RNA。
  7. 水相转移到一个新的管,约700微升,避免任何白色相间的材料转移。
  8. 加入1ml的100%乙醇并通过倒置混合。
  9. 吸管向上700微升样品放入一个微型旋转柱置于2ml的收集管。盖上盖子,离心机在12000 XG为15秒。丢弃的流量通过。
  10. 重复使用剩余的样本这一步骤。
  11. 加入700μlBuffer RWT到微型离心柱,盖上盖子,离心15秒12,000 XG洗列。丢弃的流量通过。
  12. 吸取500微升缓冲液RPE到微型离心柱。盖上盖子,离心15秒12,000 RPM。丢弃的流量通过。再次重复此步骤。
  13. 离心全速微型旋转柱2分钟以干燥离心柱从膜残留的乙醇。
  14. 微型旋转柱转移至新的1.5 ml收集管和移液管35微升不含RNA酶的水在列的膜。
  15. 离心1分钟以12,000 xg离心以洗脱RNA。
  16. 储存在-80℃的RNA。
    注意:由于RNA浓度不能精确确定的,使用固定的卷作为输入量的量度。

2.微小RNA反转录

  1. 解冻的逆转录(RT)试剂混合物成分:5×反应缓冲液,不含核酸酶的水。混合轻轻翻转冰上管和地点。在使用前,立即删除从冰箱中的酶混合物置于冰上。降速所有试剂。
  2. 表1中所述制备在冰上对RT试剂混合物。制备至少10%的超过组合。
  3. 混合吹打反应,然后降速。
  4. 在42℃孵育60分钟。
  5. 热灭活的逆向工程&本身酶为在95℃5分钟。
  6. 立即冷却至4℃。
  7. 存放在-20°C的基因。

3.稀释的cDNA

  1. 稀需要在无核酸酶的水计划ddPCR反应cDNA模板的量。稀释1:50和1之间的基因反应:500水,取决于目标miRNA的丰度。储存在-20℃下的稀释的cDNA。所述稀释的cDNA被证明为在-20℃至少3个月是稳定的。

4.产生液滴和PCR

注意:液滴生成应该在8个样品在同一时间内进行。技术重复不是必需的,因为这种技术12,15 .A无模板对照(NTC)的样品应当在每一个板中运行的高再现性,并为每个不同ddPCR条件。

  1. 解冻并平衡了主结构( 例如 ,EvaGreen预混),微小RNA引物和cDNA在室温。
  2. 混合母液日oroughly通过倒转试管几次。降速所有试剂。
  3. 表2中所述制备ddPCR组合。当执行多个ddPCR反应,制备ddPCR混合工作溶液。至少准备10%的超额组合。
  4. 一旦组装,调匀和降速ddPCR组合。
  5. 分配12微升ddPCR的混合到96孔PCR板或PCR管。
  6. 添加8微升稀释的cDNA模板的每个管/孔。
  7. 将液滴生成墨盒插入支架。
  8. 转移20微升每种制备的样品,以微滴发生器盒小心,同时避免空气在井的底部的气泡的样品孔(中间行)。
  9. 用70微升液滴生成油填充每个油井(下排)。
  10. 钩在盒保持器的垫片和插入液滴发生器。
  11. 盖上盖子,开始根据液滴代制造商的公关otocol。当液滴的一代已经完成,打开盖子,取出一次性垫圈。盒的顶部孔包含液滴。
  12. 吸管慢慢,平稳40微升的八个顶部孔(液滴)的内容到一个96孔PCR板中的一列。
  13. 转移液滴蒸发避免后立即密封带箔的PCR板。使用可刺穿箔片密封件是与液滴读者针相容。
  14. 密封板30分钟内开始热循环(PCR)。
  15. 根据表3进行循环协议。

5.阅读液滴

  1. 上电液滴读者。
  2. 从热循环仪,以液滴读者移动板。
  3. 放置含有PCR后液滴入盘保持器的底部的96孔PCR板。
  4. 放置在PCR板的板保持器的顶部。用力按下两个释放卡舌到固定支架中的PCR板。
  5. 开始从系统计算机软件。
    1. 单击设置来定义试​​验(绝对定量),然后单击Run启动液滴读数。
    2. 当液滴阅读完毕后,单击“分析”按钮,打开和分析数据。
    3. 使用2D振幅积在分析软件来选择阳性微滴(套索工具)( 图1B)。
    4. 使用事件选项卡,检查阳性,总滴数。为18,000的总人数 - 21000飞沫通常与probeless ddPCR实现。
    5. 一旦正液滴被选择,导出使用来自浓度标签导出的.csv选项所述miRNA浓度值。

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Representative Results

可使用绿色荧光DNA结合染料和液滴数字PCR技术来确定每毫升的血浆或血清的特定miRNA的绝对量。 图1表示正极的液滴选择的过程中,它决定了最终的miRNA浓度(拷贝/微升)在由分析软件计算的扩增反应。血液中的每个miRNA的量是非常不同的,是一些miRNA族比其他人更丰富。使用在ddPCR反应1:50稀释的cDNA,可以得到正和负的液滴的足够数量。在正液滴饱和( 例如 ,没有剩余的负液滴)的情况下,cDNA样本的进一步的稀释可能是必要的。

每一LNA的引物组应该被优化以液滴数字PCR系统上正常工作。对的miR-181A-5P优化过程是在图2中表示的具体而言,改变引物的量(通常在0.25的范围内-每ddPCR反应1微升)。和退火温度(通常在56的范围内- 60℃),它是可以选择的组合确定正和负的液滴之间的更好的分离。在的miR-181A-5P,60℃的退火温度和两个0.5和1μl的引物的量的情况下提供以液滴振幅而言更好的结果。

是可能发生的一组引物给出了一些非特异扩增,可能是由于引物二聚体的形成。当与循环的miRNA工作,从样品的正信号可能是非常低的,因此类似的非特异性信号。如果非特 ​​异性靶扩增的“云”不与真实的信号( 图1C)重叠,所述miRNA仍可定量仅选择所述真实积极的液滴。在这种情况下,NTC样品为液滴选择是必不可少的。所有被包含在相同的分析样品需要使用同样的方法和相同的ddPCR条件进行处理。

图1
图1.积极液滴选择 。阳性液滴使用1D曲线(A)或执行围绕在二维图(B)中的正液滴云圆负液滴高于阈值的分析过程中手动选择。如果一些引物组给出了非特异性扩增,这是通过正液滴的第二云出现在阴性对照(无模板对照,NTC)样品(C)的证明。 “真正的”阳性仍然可以选择不包括在二维图中的非特异性信号。e.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.引物优化无细胞的miRNA定量与Probeless ddPCR上部面板使用4种不同的ddPCR条件的两个血浆样品(S1和S2)中的miR-181A-5P的定量。 MIR-181A-5P LNA的引物浓度(0.5和1微升)和退火温度(58和60℃)影响的正(蓝色)中的DNA-嵌入染料ddPCR的振幅和负(黑色)的液滴。可以得到在60℃下进行PCR,并使用0.5或1μl的引物对本miRNA的更好的分离。对照样品(NTC,无模板对照)没有正面滴,符合市场预期。中央板:在上述条件下的miR-181-5p的最终浓度。结果表示为在放大器每微升份fication反应。误差棒代表泊松95%置信区间。下图:上液滴(绿色)的总人数正滴(蓝色)的数量,请点击此处查看该图的放大版本。

试剂 体积(微升)
5X反应缓冲液 4
不含核酸酶的水 11
酶混合物 2
模板总RNA 3
总成交量 20

表1 - 逆转录试剂混合组件

试剂 体积(微升)
2X DNA结合染料超混合液 10
LNA引物可变(0.5 - 1)*
不含核酸酶的水变量
稀释cDNA模板 8
总成交量 20
*第一ddPCR反应应该是几样执行,建立底漆的最佳工作数量

表2 - ddPCR试 ​​剂混合组件

循环步骤 温度 时间 下降率 周期
激活酶 95℃ 5分钟 〜2℃/秒 1
变性 95℃ 30秒 40
退火/延伸 60℃ 1分钟
信号稳定 4℃ 5分钟 1
90℃ 5分钟 1
保持(可选) 4℃ 无穷 1
使用加热的盖设置为105℃,样品体积为40微升。

表3 - 热循环条件液滴的数字PCR

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Discussion

循环miRNA是存在于血液中的浓度极低,而且可以从血浆和血清样品中提取的RNA的量是低的。因为这个原因,它们难以与其它技术,如微阵列和RNA测序量化。此外,还有在数据归一化的一般化缺乏协议和内源性“参考”微RNA在血液中的存在。在这种情况下,一个灵敏的技术,如微滴数字PCR,能够每毫升血清或血浆,即使非常低的计数的miRNA拷贝数的,是非常有吸引力的。我们配对该技术具有普遍性的cDNA系统,反向转录在一个反应​​全部循环的miRNA从而节省时间,最重要的是,RNA的材料。在我们的方法,特异度为固有的使用LNA的引物,相对于其他的解决方案时,16 miRNA的定量其中表现非常出色。

液滴数字PCR是终点测定法,允许靶基因的计算绝对浓度。不像定量PCR,扩增效率不足不影响最终ddPCR定量。因此,考虑到本比如血液样本中的PCR抑制剂的量,ddPCR提供用于循环核酸评估一个强大的工具。

由于其高灵敏度,该技术提供了一个足够的量化也不太丰富的miRNA,即使起始原料的量有限。另外,假设每个miRNA分子在cDNA分子反转录,我们可以计算出在1微升血浆/血清的绝对拷贝ddPCR反应值所得到的浓度乘以要稀释因子(145.83)。

所提出的工作流程可以在8-96的样品在一个时间容易地进行,从而提供了在CLINICA微RNA定量的可靠和时间有效的工具L个样本。滴数字PCR有可能成为核酸的一个必不可少的工具生物标志物评估,诊断设置,从而使液体活检从替补到床边的潜力。

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Acknowledgements

从意大利癌症研究协会(AIRC)为MF(MFAG 11676)和MN资金支持(特别节目分子临床肿瘤学 - 5千分数ñ9980,2010/15)和指令意大利教育部,大学和研究FIRB 2011年明尼苏达州(项目RBAPIIBYNP)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 Columns for total RNA, including miRNA, extraction from serum/plasma
100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3p Integrated DNA Technologies Custom Sequence: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG
Universal cDNA synthesis kit II, 8-64 rxns Exiqon 203301 Kit for microRNA reverse transcription
MicroRNA LNA PCR primer set  Exiqon 204000-206xxx and 2100000-21xxxxx Primers for miRNA amplification inside droplets
QX200 droplet generator BioRad 186-4002 Instrument used for droplet reading
QX200 droplet reader BioRad 186-4003 Instrument used for droplet generation
QuantaSoft software BioRad 186-3007 Software for data collection and analysis
PX1 PCR plate sealer BioRad 181-4000 Plate sealer
DG8 droplet generator cartridges and gaskets BioRad 186-4008 Cartridges used to mix sample and oil to generate droplets
QX200 ddPCR EvaGreen supermix BioRad 186-4033/36 PCR supermix
QX200 droplet generator oil for EvaGreen dye BioRad 186-4005 Oil for droplet generation

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References

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