アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオ センサーによる検出

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Summary

アナスタシスは、細胞死のプロセスを逆転させた細胞は通常の健康な細胞と形態学的区別することができますので、生体内で検出する技術的に困難です。ここでの検出と追跡システムを使用して、新たに開発した生体内でCaspaseTracker バイオ センサー アナスタシスは生きている動物を受ける細胞のプロトコルについて述べる。

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Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e54107, doi:10.3791/54107 (2018).

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Abstract

アナスタシスは (ギリシャ語の生活に""ライジング) という本質的に取り返しのつかないことに一般に見なされる後期細胞死のプロセスを逆転できる死ぬセルが最近発見された細胞回復現象であります。アナスタシスを促進が保持または原則レスキューけが細胞心筋細胞や神経細胞、これにより組織の回復を促進するなど交換しにくい。逆に、抗癌治療後アポトーシスを受けるアナスタシスは癌細胞を抑制することで、癌細胞の死をことを確認可能性があり、再発の可能性を減らします。ただし、これらの研究は、生きている動物のアナスタシスを受ける細胞の運命を追跡するためのツールの欠如によって妨げられています。課題は、回復後の形態学的正常な外観にもかかわらず細胞死のプロセスを逆転させた細胞を識別することです。この困難を克服するため、ショウジョウバエおよび哺乳類の CaspaseTracker バイオ センサー システムを識別および anastatic 細胞体外体内を永久に追跡することができますを開発しました。生成と検出および細胞死の刺激に対する一時的な暴露後アナスタシスはキイロショウジョウバエを追跡する CaspaseTracker デュアル センサー システムの使用のため生体内でプロトコルを紹介します。一方、従来のバイオ センサー、プロトコル積極的に受けてアポトーシス細胞死細胞をラベルすることができます、CaspaseTracker バイオ センサー完全にカスパーゼ活性化 - 後期アポトーシスの特徴後回復した細胞にラベルをでき、同時にアクティブなアポトーシス プロセスを識別します。このバイオ センサーは、直接または間接的に関与カスパーゼ活性細胞死の他の形態をした細胞の回復も追跡できます。したがって、このプロトコルにより、私たちは継続的にこれらの細胞との生物学的機能、分子機構、生理学的および病理学的結果との治療上の含意将来の研究を促進する彼らの子孫の運命を追跡するにはアナスタシスは。また、非アポトーシス カスパーゼ活性のin vivoを表示するからアナスタシスを受けるセルを区別するために適切なコントロールを議論しました。

Introduction

プログラムされたアポトーシスなどの細胞死は、多細胞生物1,2,3不要、負傷、または危険な細胞を排除することによって胚と通常の恒常性に重要な役割を果たしています。細胞死と生存のバランスの損失は、癌、心不全、自己免疫疾患、変性4,5,6,7,8など致命的な結果につながることができます。カスパーゼは、"ノーリターンのポイント「アポトーシス9,1011、それとして従来考えられている死刑執行人の活性化を迅速かつ大規模な細胞解体12、トリガー 13,14,,1516。この一般的な教義に挑戦、我々 は実証が死ぬ主細胞と癌細胞を回復できるだけでも次の重要な細胞のカスパーゼ活性化後、膜ブレブ、細胞の収縮を含む死の特徴ミトコンドリアの断片化、細胞質、核 chromatin の凝縮が、DNA 損傷、核の断片化へのミトコンドリアのチトクロームcの放出細胞アポトーシス小体の形成とホスファチジルセリン (PS) の表面の露出17,18,19,20,21. 提案するそのアナスタシスは本質的な細胞回復現象、死細胞は細胞死の刺激17,18,19,20,を除去した後回復できるよう21. 私たちの造語「アナスタシスは」(Αναστάσης)18、「上昇生活に」ギリシャ語でを意味するこの予期しない細胞回復現象を記述します。アナスタシスはの私達の観察はホスファチジルセリン外在化22,23,24、限定ミトコンドリア、後細胞の回復も明らかに最近の独立した研究によってサポートされてさらに外側膜透過25キナーゼのような混合系の活性化 (MLKL) と細胞収縮26

アナスタシスを規定しているメカニズムを特徴付けるお越しのパラダイム シフトの生理学的、病理学的、および治療の影響。アナスタシスは救助または左心室と心室をアンロードして重要な後細胞と置き換えるには、困難な組織、おそらく心不全逆転のアカウントを保持する未知の細胞保護メカニズムを表すことができます。脳損傷32後デバイス (LVADs)27,28, 視細胞の過度光29,30,31, 一時的な露出やニューロンの修理後の復旧を支援します。その場合推進アナスタシスは細胞・組織の回復を高めることができます。逆に、アナスタシスはがん細胞が細胞死誘導療法、がん再発17,18の原因を生き残るために使用予期しないエスケープ戦術かもしれない。したがって、アナスタシスは中にがん細胞が死ぬことで、がん治療後の再発を防止することによって癌を治療する新たな治療戦略を抑制します。

アナスタシスはの過程で、我々 は、アポトーシス18,20,21 の中に DNA 損傷原因の可能性が発生したこと、いくつかの回復された細胞恒久的な遺伝子変異を取得し、発癌を受けたを発見しました。.DNA ダメージを受けた細胞の死のプロセスを逆転させることができる腫瘍形成のメカニズム、食道の慢性的な熱損傷が誘発されるよう組織の様にがんのリスクを増加可能性のある組織の損傷を繰り返し観察の基礎となります。非常に熱い飲料33,34,35、アルコール中毒36,37による肝臓の損傷、腫瘍の進化の遺伝毒性癌療法38,後の消費によって39,40, および抗癌性療法41,42,43,44のサイクルの間隔中に発生した正常組織から新しい癌の開発.True の場合、アナスタシスはターゲットを防ぐ可能性があります。 または癌の発生と進行を逮捕します。我々 は、飢餓による死生殖細胞を再供給のショウジョウバエ19でアナスタシスは受けることを発見しました。 アナスタシスは DNA 損傷と生殖細胞の発生、環境ストレスを長期観察のためのアカウントは、遺伝病の開発を促進するかもしれない。たとえば、飢饉は継代継承可能な糖尿病と冠動脈心疾患45疾患の発展に貢献します。したがって、この潜在的なメカニズムに起因する継承可能な疾患の発症予防のための戦略理解アナスタシスは可能性があります。

アナスタシスはの発見を活用し、革新的な治療法の開発にそれを直接、原因とアナスタシスは生きている動物での結果を研究に不可欠です。ただし、それは技術的に識別し、細胞死のプロセスから回収した細胞は通常の健康な細胞と形態学的区別がつかない表示され、アナスタシスはマーカーがないため anastatic 細胞は生体内で、追跡に挑戦します。特定まだ17,18,21。これらの問題に対処するため、我々 は最近新しい生体内でカスパーゼ バイオ センサーを識別およびカスパーゼ活性化19,46, 後アポトーシスを生き残る細胞を追跡する"CaspaseTracker"19日を指定を開発、アポトーシス10,14の特徴。スキャット12,47、Apoliner48, CA GFP49、ApoAlert18,50, C3AIs51 iCasper52 など「リアルタイム」カスパーゼ バイオ センサーとそれを区別します。にカスパーゼ活性を検出する、CaspaseTracker バイオ センサーはまた永久にも一過性細胞その特急のカスパーゼ活性にラベルを付ける機能します。したがって、CaspaseTracker バイオ センサーは、カスパーゼを介した崩細胞死のプロセスで vivo後アナスタシスはの長期追跡を可能。 にします。

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Protocol

1) ハエ CaspaseTracker バイオ センサーの作製

  1. CO2ハエを麻酔し、絵筆を使用してはえの食糧と新鮮な酵母のペーストと同じ瓶で 7 に 10 カスパーゼに依存した Gal4 (DQVD)19処女女性および 7 10 G トレース53 Gal4 記者若い男性のハエ (またはその逆) を転送します。
    注:カスパーゼに依存 (DQVD) Gal4 と G トレース ハエの十字架 CaspaseTracker 子孫ハエが生成されます。カスパーゼ -機密性の高い (DQVA)19 Gal4 のクロス、G トレース ハエはネガティブ コントロール ハエ (ディスカッションを参照) を提供します。新鮮な酵母ペーストは子孫の数が増加するので、卵の生産を強化するたんぱく源として提供しています。処女の女性とその表現型54によると若い男性のハエを選択します。
  2. 3 〜 7 日、十字架の中に摂氏 18 度 (oC) でハエをインキュベートし、18 ° C で新しいクロスを設定する新しいバイアルにハエを転送子孫が eclose を飛ぶまでに 18 ° C で元のバイアルをインキュベートし続けます。
    注:親のハエを元のバイアルに子孫の混雑を避けるために新しい瓶に転送します。親のハエは最初 2 に 3 スイッチで生鮮食品酵母の子孫を作り出すことができるし、生産性が時間大幅減少します。ハエを発生させる 18 の ° C は、CaspaseTracker バイオ センサーの非固有の信号を減らすことができます (ディスカッションを参照してください)。
  3. 選択の子孫は次の実験のための正しい表現型54で飛ぶ。
    注:ここで両方のカスパーゼに依存した Gal4 と G トレースの transgenes、CyO バランサーとのバランス、2 番目の染色体にあります。カスパーゼ依存 Gal4 および G トレースの両方の遺伝子を持つ (町)、なし非巻き毛翼子孫を選択します。

2) 一時的な細胞死誘導 CaspaseTracker バイオ センサーへの応用を飛ぶ

  1. 10 に 20 新しく卵卵室の生産を許可する 18 の ° C で 1 日新鮮なはえの食糧と新鮮な酵母ペースト新しいバイアルにこの女性がジャンプを転送します。
    注:雄と雌を維持する産卵室を高める可能性があります。
  2. 低温ショックによってアポトーシスを受けるに卵室を誘導して、メスの成虫を 1 h の-7 ° C に配置され、新しい空のバイアルに転送します。
    : 低温プラズマ膜破裂55,56を誘導することによって細胞を傷つけます。
  3. タンパク質飢餓によるアポトーシスを受けるに卵室を誘導して、3 日間の 18 ° C で 8% 蔗糖および 1% 寒天の食物と一緒に新しいバイアルにメスの成虫を転送します。
    注:タンパク質不足 (非蛋白質食品) は、アポトーシス57,58,59とオートファジー60,61を受ける卵室をトリガーできます。はえの食糧、ショ糖の最適な状態を保つために、毎日 8% のショ糖と 1% の寒天食品と新しいバイアルにハエを切り替えます。
  4. 回復することを許可するように 18 ° C で 3 日間新鮮なはえの食糧と新鮮な酵母ペースト新しいバイアルに強調したハエを転送します。飢え死にしたと記述されている62として卵巣に卵室を取得する飢えた回復ハエを解剖します。
    注:ショウジョウバエ卵巣を取得するを解剖、CO2ハエを麻酔しハエの頭を削除する鉗子の 2 組を使用し、ハエの卵巣を削除する腹部の基部をプルする鉗子を使用します。

3) 固定およびイメージングの切り裂かれた卵室の汚損

  1. 0.5 mL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中一緒に切り裂かれた卵室を 1 mL の遠心管に転送します。定住する卵を許可します。
    注:1% ウシ血清アルブミン (BSA) を水や卵室の先端のプラスチックの表面に固執するを防ぐために PBS に溶解とプラスチック ピペット チップをコートします。赤色けい光たんぱく質 (RFP、下流とも呼ばれます) の変質を避けるために暗闇の中で次の手順を実行、卵室で緑の蛍光蛋白質 (GFP)。
  2. ピペッティングで PBS を削除し、20 から 30 分のために室温で卵室を修正する PBS で 0.5 mL 4% パラホルムアルデヒドを適用します。
    注:この手順と次のインキュベーション手順で緩やかな回転を適用します。
  3. ピペッティングして、パラホルムアルデヒドを削除し、0.5 ml の pbst; 卵室を洗浄し (PBS + 0.1% トリトン X-100) 3 回。
    注:長期固定は、RFP と GFP の信号を減らすことができます。
  4. PBST と卵室に室温で 1 ~ 2 時間孵化させなさいまたは卵室を permeabilize 緩やかな回転で 4 ° C で一晩します。
    : pbst; また非 BSA のプラスチック表面に固執する卵室を避けることができます。
  5. ピペットで、pbst; を削除し、卵室に核を染色する室温で 1 ~ 2 時間に 10 μ g/ミリリットル PBST で青い核ヘキスト染料の 0.5 mL を適用します。
    注 1:非固有の信号を高めるため核染付長期間の加温は避けてください。
    注 2:ヘキストせず核を染色する方法は 200 を追加、DAPI μ L 抗漂白取付エージェント (資料参照) プロトコル 3.8 で説明したように、ガラス製カバー スリップ上組織をマウントする前に一晩63、孵化させなさいと。
    注 3: 退色を避けるために暗闇の中で染色し、次の手順を実行します。
  6. ピペッティングで核染色を削除し、0.5 mL pbst; 洗浄の各ステップ間の緩やかな回転と 10 〜 20 分孵化での 3 時間のため 1 mL の遠心管に卵室を洗浄します。
  7. 罰金のピペットですべて pbst; を削除し、200 を適用 μ L 抗漂白取付エージェント (参照資料) 卵室が管の底に沈むまで 4 ° C で 3 時間室温または一晩卵室をインキュベートします。
    注意: 取り付けエージェントを完全に吸収している組織が管の底に沈みます。
  8. アンチ漂白 200 μ L でそれらを転送することによって汚された卵室をマウント 20 × 20 mm あらかじめ洗浄し、ガラス カバー スリップの卵室をカバーし、置くことによってスライド ガラスにカバーガラスをシール ピペッティングによるイメージングのためのあらかじめ洗浄し、ガラス スライド上のエージェントを実装マニキュア カバー スリップの端に。
    注 1:あらかじめスライド ガラスと水または 70% エタノールとカバー スリップをきれい。
    注 2:スライド ガラスと overcompression によって卵室を破壊しないようにカバー スリップの石油ゼリーを適用します。
  9. イメージの蛍光または 20 x、NA 0.8 を用いた共焦点顕微鏡を用いた卵溜まり計画アポクロマート目的は、染色性が核の励起光の波長 405 nm (検出排出 〜 461 nm)、561 RFP (進行中または最近カスパーゼ活性) 信号 (nm放出 ~ 590 nm を検出) と 488 (過去のカスパーゼ活性) GFP シグナルの nm (発光を検出 〜 518 nm)。
    注:顕微鏡20,64の私たちの公開プロトコルを参照してください。

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Representative Results

それは回復した細胞形態学的に区別がつかないためセルを受けた動物では、アナスタシスは識別するために挑戦的なコマ撮りの生細胞顕微鏡検査は、培養細胞20管アナスタシスは信頼性の高い方法は、通常の健康な細胞から、細胞死を試みていません。たとえば、ひと子宮頸癌 HeLa 細胞は細胞死に対してアポトーシス1,2,14細胞の収縮、核の凝縮膜ブレブなどの形態学的特徴を表示します。1 μ m スタウロスポリン17 (図 1 a図 1 b i ii) の刺激。新鮮な培地で培養、細胞死の刺激を除去した後死細胞細胞死のプロセスと、逆にアナスタシスは17,18, 形態の回復 (図 1 b iii-iv) によって示される増殖 (図 1 b v vi) が続きます。私たちの以前の研究はまた、カスパーゼ活性化18,20後 ApoAlert (ファミコン DEVD-YFP-NLS) アポトーシスの逆転を示すなど、「リアルタイム」カスパーゼのバイオ センサーを使用します。このバイオ センサーは (図 11 Dは私) の健康な細胞の細胞質に局在します。カスパーゼ活性化細胞死の刺激 3.7% のエタノールによって引き起こされるこの YFP バイオはカスパーゼによって切断され、核、どこそれが蓄積して、YFP のタグの結果として得られる核蛍光に行くとセルを識別するにカスパーゼ活性 (図 1 C1 D ii-iii)。死細胞はまたエタノール誘導1,14,18,20、管状のミトコンドリア、核の断片化など中にアポトーシスの形態学的特徴を表示します。結露・細胞収縮・細胞膜ブレブ (図 1 ii-iii)。興味深いことに、細胞死の刺激を除去した後は同じセルし正常な形態 (図 1 iv ・ viii) を取り戻す、回復できます。特に、ApoAlert (劈開バイオ センサー) の核の蛍光が消えて回復細胞 (図 1 iv ・ viii) で 1 時間以内おそらく anastatic で破損したコンポーネントを排除するようなプロセスによる細胞18、切断カスパーゼ 3、PARP、ICAD アポトーシス中に生成されたなど。したがって、新しい戦略は、長い期間、特に生体内でアナスタシスを追跡するため必要です。

Anastatic 細胞の運命を追跡するには、死刑執行カスパーゼ活性によって切断されて後ラベル セルを完全に哺乳類 CaspaseTracker バイオ センサー システムを開発しました。このバイオ センサーは、カスパーゼに依存した情報を頼むこと (逆テトラサイクリン制御トランス) と Cre ベース LoxP レポーター情報を頼むことアクティビティ (図 2 aB) で構成されます。カスパーゼ アクティビティがないと健康な細胞の転写活性化情報を頼むこと65は膜アンカー (リン11)66,67, 核除外信号 (NES) 地図のキナーゼのキナーゼ (MAPKK)68につながれているとカスパーゼ劈開 (DEVD)70リンカーを介してエストロゲン受容体 (ERT2) の変形69は PARP (図 2 a 2 b) に由来。若しつなぎ縄でつながれた情報を頼むことはできない核に細胞質から、それは情報を頼むことレポーターをアクティブにできません。ただし、活性化細胞死の刺激への応答で、カスパーゼ切断 DEVD リンカー、若し核 (図 2 b) に情報を頼むことを解放します。テト応答配列 (TRE) と CAG プロモーターとのコーディング シーケンスの停止コドン カセットを削除する不可逆的な組換えイベントにつながる Cre リコンビナーゼの儚い表情をトリガーに、情報を頼むことをバインド、核で一度赤色蛍光タンパク質 (下流)。これは、結果、恒久的な発現した DsRed (図 2 b)、彼らは彼らの子孫 (図 2) と同様に、カスパーゼ活性を経験している後生きている残ることができるそれらの細胞の永久的な蛍光マーカーとして機能します。

哺乳類の CaspaseTracker バイオ センサーをテストするには、我々 はトランスフェクションによって HeLa 細胞に導入すること、細胞死の刺激 (1 μ m スタウロスポリン) とセルを扱ったし、我々 が持っていると時間経過の生きているセルの共焦点顕微鏡で細胞の回復を監視20を説明します。ドキシサイクリン (1µg/mL 最終濃度)、情報を頼むこと活動65,71を許可するように不可欠であるは、実験を通してバイオ センサーをオンにする細胞培養液に追加されました。細胞死の刺激に応答して、扱われた細胞は、アポトーシス、細胞の収縮と期待される (図 2 D i ~ iii) として膜ブレブなどの特徴を表示します。細胞死の刺激を除去した後、通常形態 (図 2 D iv-vii) へのリターンによって示されるとして、死細胞の細胞層を一度、新鮮な培地追加、アナスタシスは洗浄を観察できます。診断によって、のみ回復細胞エクスプレスした DsRed 蛍光マーカー アナスタシスは (図 2 D iv-vii) と非回復細胞 (図 2 D iv-vii) と制御の細胞の両方からそれらを区別します。細胞死の刺激 (図 2 e) には公開されません。これはアプリケーションを例示して、識別し、完全に anastatic 細胞のカスパーゼ活性化からの回復をラベリング小説新しいツールとして哺乳類の CaspaseTracker の有用性と追跡し、彼らの長期的な運命を研究する方法を提供します。

検出して生きている動物のアナスタシスは、CaspaseTracker バイオ センサー トランスジェニック動物が必要です。したがって、私たち最初ショウジョウバエとして使用モデル システム19、ので動物の開発および人間の病気72,73,74 の研究の重要な遺伝的扱いやすい生物であります。 ,75。哺乳類の CaspaseTracker バイオ センサーからを変更すると、ショウジョウバエのデュアル センサーは識別し、「最近/に」から「過去」のカスパーゼ活性を区別しますしますできます。このデュアル センサーは、カスパーゼに依存した Gal419と Gal4 記者 G トレース53 (図 3 a) で構成されます。DIAP1 から派生したカスパーゼ劈開リンカー (DQVD) を通じて膜アンカー (mCD8) ドメインにつながれている酵母転写因子 Gal4 ないカスパーゼ活性と細胞 (図 3 b)、劣化を防ぐために 21NN/GV22 突然変異を持っていることBIR1 ドメイン77drICE カスパーゼ阻害作用を廃止するリンカー afterAsp2076, と D135R の突然変異のカスパーゼ胸の谷間に N 末端規則で Gal4 の若しテザー Gal4 はことはできませんそれを解放するカスパーゼによって胸の谷間なく核へ、Gal4 記者 G トレース アクティブでない細胞のカスパーゼ活性19ことないが内に残ります。Caspase のアクティブ化時にただし、カスパーゼの活性化は G トレース記者 (図 3 a)19をアクティブにする核に若しに Gal4 を解放 DQVD リンカーを切断します。Gal4 バインド固有上流、Gal4 まで最近または現在のカスパーゼ活性の蛍光レポーターとして、シーケンス (UAS) 一時的な転写し、RFP の式をトリガーするをアクティブにする (カスパーゼ) 活動を停止し、RFP のタンパク質は、低下します。Gal4 も核をターゲットとした GFP (nucGFP) のユビキチン (Ubi) プロモーターとコーディング シーケンスの停止コドン カセットを削除します再結合イベントにつながる、遺伝子から FLP リコンビナーゼの発現がトリガーされます。それらの細胞のカスパーゼ活性を経験している、生きているままの永久的なマーカーとして機能する nucGFP の永久的な式でこの結果します。

アナスタシスはアポトーシスを検出するためショウジョウバエCaspaseTracker バイオ センサーをテストするのには生体内で女性を飛ぶ CaspaseTracker を受けた生理的ストレス (図 3)、コールド ショック19、効率的にすることができますようトリガー細胞死、カスパーゼ活性化、核凝縮し細胞収縮19,78, とも膜の完全性の損失と細胞質の漏出を引き起こす低温による壊死によって示されるアポトーシスを含む内容55,56。予想通り、CaspaseTracker、卵でアクティブではなかったストレス細胞死がなかった制御ハエ商工誘導 (図 3 D)。対照的に、重点を置かれたハエの卵室 1 日低温ショック後示しただけでなく特徴的なアポトーシス細胞収縮核凝縮ですがまた RFP GFP 式、最近の存在を示すまたは進行 (RFP +) と過去 (GFP +) カスパーゼアクティビティ (図 3E)。ただし、通常非強調条件、GFP がない RFP を強調したハエを帰国後 3 日で回復した卵室 (図 3 f) で式が検出されました。これは、細胞死のプロセスを克服し、生き残るためにストレスに続くカスパーゼ活性を表明していた卵室ができたことを示します。

さらに卵室19の可逆性の細胞死のプロセスをテストするため CaspaseTracker のメスの成虫は 1% 寒天培地で 3 日間 8% ショ糖を供給されて後タンパク質飢餓によって強調されました。以前の研究で示されて蛋白質飢餓がカスパーゼ - アポトーシスと組織体細胞におけるオートファジーをトリガーできます、生殖細胞、卵室57,60,61を含みます。予想通り、CaspaseTracker は、タンパク質不足 (図 3) 3 日後卵室でアクティブ化されました。アポトーシスの形態と、RFP と GFP のバイオ マーカー、最近か進行を示す (RFP +) と過去のカスパーゼ活性 (GFP +) (図 3) 式死んで卵室を展示しました。CaspaseTracker が以前経験した死刺激後のカスパーゼ活性化回復した細胞を追跡ことができますを示すため、飢えたハエ、通常タンパク質を含むフライ食品に譲渡されました。予想通り、これらの再供給のハエの回収卵室は最近または進行中のカスパーゼ活性 (図 3 H) がないことを示す、RFP 過渡カスパーゼ記者を欠いています。ただし、これらはこれらの卵室で GFP カスパーゼ記者 (図 3 H) ことを示すセルを表示通常の食品にそれらを返すことによってストレスを解消後、ハエの卵室が逆に後時点で開始される細胞死のプロセスカスパーゼの活性化。DQVA、どちらのカスパーゼは切断することができるとバイオ センサー アクティビティ (図 3 b 3 i を廃止する一連の胸の谷間シーケンス DQVD を置き換えることによって得られた CaspaseTracker バイオ センサー活動がカスパーゼによってトリガーされることの検証).

GFP、しかしない RFP (図 3J 卵室、身体 (包) 細胞などの細胞や生殖細胞 (栄養細胞と卵母細胞) の複数の種類が表示されることがわかった CaspaseTracker のショウジョウバエは、タンパク質不足から回復した後)19, これらの細胞がカスパーゼ活性化後アナスタシスを受けることができることを示します。興味深いことに、GFP も同じ小管チェーンに関連付けられている卵室と共に、幹細胞が含まれている germarium (図 3J)19に、セルのラベル。したがって、これらの GFP 陽性卵室がカスパーゼ活性化後の細胞死のプロセスから回復している幹細胞から派生されていることがあります。重要なは、飢えと再供給の女性が飛ぶ gfp 発現する子孫ハエ19を作り出すことができる肥沃な卵を産むこと潜在的セル逆に細胞死のプロセス後、カスパーゼ活性化は明らかに正常な機能を取り戻すことができますを示唆しています。アナスタシスは結果として生き残る子孫ハエ展示永続的な後遺症であるかどうかは、今後の研究が必要です。

Figure 1
図 1.Hela 細胞の回復細胞の細胞死誘導後
(A) 細胞死を誘導し、その後細胞死誘導剤の除去後に回復する細胞が死ぬことを許可する方法の模式図。
(B) 時間経過の生きているセル () 健康の HeLa 細胞の顕微鏡検査、1 μ m スタウロスポリン (ii) と治療後のセルの同じグループと洗浄し、さらにスタウロスポリン (を削除する新鮮な培養液で培養iii vi)。白い矢印は、分割セルを示します。
(C) カスパーゼ バイオ センサー融合タンパク質ファミコン DEVD YFP NLS の回路図と YFP の局在や細胞死誘導中、アナスタシスは後。
3.7% エタノール (ii ~ iii) の前後の露出の間に前に ()、カスパーゼのバイオ センサー融合タンパク質ファミコン DEVD YFP NLS を表現する 1 つの HeLa 細胞の (D) 時間経過の生きているセルの共焦点顕微鏡培 (ivviii) からエタノールを削除します。ここではカスパーゼ バイオ センサーのみの画像 (蛍光グリーン、一番上の行) です。ヘキスト染色核 (青色蛍光) とミトコンドリア (赤い蛍光性) の画像をマージ (中段) と中央の行に画像がさらに DIC 画像 (下の行) と合併します。一番上の行の白い矢印は、核のローカライズされた YFP を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2.哺乳類の CaspaseTracker バイオ センサー システム
(A) 図のカスパーゼに依存した情報を頼むこと。
(哺乳類の CaspaseTracker 情報を頼むことバイオ センサー システム B) 図。
(C) アナスタシスを検出する CaspaseTracker 情報を頼むことバイオ センサー システムを使用してのフローチャート。赤/黄の三角形 (細胞死誘導剤は適用)、緑/青 (オフ洗浄インデューサ) シンボル図 1 aのように。
(()、前に哺乳類の CaspaseTracker 情報を頼むことバイオ センサー発現 HeLa 細胞のクラスターの D) 時間経過の生きているセルの共焦点顕微鏡と 1 μ m スタウロスポリン (ii ~ iii)、しを削除した後に露光中にスタウロスポリン培 (iv - vii) から。DIC と下流の信号のイメージをマージします。矢印 (黄色) の 1 セルを表すし、セル 2 (緑)。
(未処理のバイオ センサー発現 HeLa 細胞の E) 時間経過の生きているセルの共焦点顕微鏡。DIC と下流の信号のイメージをマージします。白い矢印は、分裂細胞を示します。
ドキシサイクリン (1ug/mL) (D)および(E)パネルに表示される実験全体中に存在していた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3.ショウジョウバエCaspaseTracker デュアル センサー システム。(許可を得てから唐ら科学的なレポート 2015 年 9:9015 採用19).
(ショウジョウバエCaspaseTracker Gal4 バイオ センサー システム A) 図。
(B) カスパーゼに依存 (DQVD) およびカスパーゼに依存しない制御 (DQVA) の図 Gal4。
(C)ショウジョウバエ卵巣および 1 日古いハエでは、通常の状態で 3 日間回復続く細胞死誘導のためのフローチャートの概略図。ダレン ・ Obbard によって提供されるショウジョウバエのイメージ。
(D) 女性バイオ ハエの卵巣から卵室の代表的な共焦点画像は 6 日間 (未処理の) 通常のはえの食糧にうんざり。
(コールド ショックを受けた女性バイオ ハエの卵巣から卵室の E) 代表的な共焦点画像は-7 ° C 1 時間に配置され、通常の培養条件 (低温ショック、CS) 1 日に切り替えた。
(F) パネルEコールド ショックをハエを除いてのような 3 日間 (CS 後回復) の通常の培養条件になっていた。
(飢えた女性バイオ センサーの卵巣からチャンバーのフライ卵 G) 代表的な共焦点画像は 3 日間 (飢えた) 8% スクロースを蛋白質がなければ 1% 寒天にうんざり。
(H) のような扱われたハエを除くパネルG (再供給) 蛋白質飢餓治療後 3 日間通常のはえの食糧に切り替えていた。
ネガティブ コントロールとして、機密の CaspaseTracker (DQVA) 女性のバイオ センサー ハエカスパーゼの飢餓を示す以外のGのパネル (I) が好きです。
(飢えと再供給女性ショウジョウバエから卵室の J) 代表的な共焦点画像。矢印は、核 GFP 看護師細胞 (黒)、卵 (白) と卵胞細胞 (黄色) 卵室と germarium (緑) で表現することを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4.アナスタシスはの生理、病理、治療への影響。(許可を得てから唐 et al., F1000Res 2017 6:43 採用21).この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

CaspaseTracker デュアル センサー システムが斬新で、最近の検出を可能にするユニークなツールまたは進行中のカスパーゼ活性と細胞死を逆転させた細胞の追跡処理およびカスパーゼ活性体内を経て生き残るため。成長の研究が非アポトーシス カスパーゼ活性がニューロン活動79,の規制などの多様な細胞機能の潜在的な役割を果たしていることを明らかにする一方、カスパーゼ活性がアポトーシスの特徴として伝統的に仮定されて、80、学習およびメモリ81,82,83,84, necroptotic 細胞死85,86, spermatid 個別化87の抑制 8889、細胞増殖9091をパターニング細胞運命の処理マイクロ Rna。アポトーシスにアナスタシスは加え、CaspaseTracker バイオ センサー システムは従って脳と視葉、噴門、腸、キイロショウジョウバエマルピギー管、気管、筋肉との他の組織に存在する非アポトーシス カスパーゼ活性を検出します。ショウジョウバエ19,46,64。このバイオ センサー信号も胚または通常恒常性これらの組織の中に現在または過去の anastatic の活動を表すことができます。アナスタシスは生きている動物の一時的な細胞死を誘発する環境ストレス後、勉強するには、通常の生理条件下でのカスパーゼ バイオ活性を示さないことが誘導され、カスパーゼを受ける細胞組織を選択する重要です。一時的な細胞死誘導による活性化。通常がないのでステージ 10 に germarium からカスパーゼ活性卵58,59,92中、卵室がこの目的に最適です。

女性ショウジョウバエ非定常環境応力を公開する、蛋白質不足や低温ショックなど効率的にトリガーできるカスパーゼ活性化と細胞死卵室19,57,58 78。プロトコルの中で重要なステップは、ハエに長時間細胞死誘導を避けることなど。タンパク質飢餓 (8% スクロースを 3 日間の 1% 寒天) と低温ショック (-7 oC で 1 h) のメスの成虫に最適化された条件できます卵室でカスパーゼ活性化細胞死のプロセスをトリガーし、する強調したハエが返された後に回復し通常の状態の19。細胞死の刺激との長期治療は、細胞死のプロセスを受けることにより多くの卵室を引き起こすことができますが、回収率も減少し、おそらく死んで卵室修復不可能なほどの大規模な被害を経験。

このプロトコルでは追加の重要なステップを横断し、調達、CaspaseTracker ハエ 18 oC. など、低温を維持する卵室の CaspaseTracker バック グラウンド信号を減らすためにはハエが卵形成58中ステージ 10 を germarium でカスパーゼ活性を表示しないから卵室の大半は最適な飼育、卵室の約 1% は細胞死誘導19 なしカスパーゼ バイオ活性を示すことが.これは生得的なエラーのため通常の離職率を反映可能性があります。 または標準的な実験室の条件によって卵形成中に意図せずに引き起こされるかもしれない。Gal4 低温93でハエに、以下の活動の表示で 18 oC ではなく、室温でハエを発生させる CaspaseTracker システムをアクティブに内因性信号を減らすことができます。また、29 oC などの高温にハエを切り替えることができます増加 CaspaseTracker システムの感度 Gal4 活動93、および可能性のあるその他内因性温度依存性酵素の増加活動。

細胞死のプロセスまたは非アポトーシス カスパーゼ活性を示す細胞からアナスタシスは受ける CaspaseTracker 陽性細胞を区別することが重要です。死細胞はその切断活性化 Gal4 進行中のカスパーゼ活性を持っていると、アポトーシス細胞表現 RFP (あるいは最近カスパーゼ活性の一時的なマーカー) とアポトーシス誘導の治療にしばしば GFP (過去のカスパーゼ活性の永久的なメーカー)その過渡 (Gal4 活動依存した RFP) と永久をアクティブに (Gal4 トリガー FLPase FRT GFP を介した) G トレース システムの記者。これらの細胞のアポトーシスを確認できない形態学的および生化学的特徴そのような米国核凝縮核染料14,19,58, 染色によって検出およびカスパーゼによって検出された胸の谷間免疫染色19,94。アナスタシスを既に受けている細胞は、G トレース システムの FLPase を介する組み換えイベントのため恒久的な GFP の表現を表示します。彼らはないにカスパーゼ活性とアポトーシス19の他の特徴を持っていると、これらの細胞 RFP 表現ないです。これらの細胞は、正常な核形態を表示もできます。細胞は、RFP と GFP 発現を頻繁に表示しても正常な核形態19に非アポトーシス カスパーゼ活性を持っています。

両方は GFP のみを表示し、細胞死の認刻極印があるため非アポトーシス カスパーゼ活性過去があったそれらの細胞からアナスタシスは経験豊富な細胞を区別するために困難になることができます。したがって、注意の制御実験は、含まれている19をある必要があります。例については卵室でアナスタシスを勉強する強調回復ハエと非強調したハエ (マイナス コントロール) の両方における GFP 発現を調べることが不可欠です。アナスタシスは、カスパーゼ活性化後に発生した場合回復したハエ gfp 発現する強勢のショウジョウバエよりセルが表示されます。また、キューティクル、顔料、および脂肪体19の観測としての非特異的自己蛍光 CaspaseTracker 蛍光信号を区別することが重要です。我々 は、非分解シーケンス (DQVA) にバイオ センサー (DQVD) のカスパーゼの胸の谷間のサイトを変更しそれによりレンダリング制御バイオ センサーをカスパーゼ活性19に対応して陰性対照バイオ センサー ハエを生成されます。信号は、カスパーゼ機密 (DQVD) の検出しますが、ネガティブ コントロール (DQVA) バイオ センサーのハエではなく自動蛍光よりもむしろカスパーゼ活性によってトリガーされる、興味の信号。

私たちの現在のショウジョウバエデュアル CaspaseTracker バイオは、RFP の式による「最近」のカスパーゼ活性細胞と GFP19の発現による「過去」のカスパーゼ活性細胞を識別できます。我々 は RFP が「リアルタイム」カスパーゼのアクティビティインジケーターはカスパーゼ活性への応答における RFP の発現を駆動する Gal4 の反応時間のいくつかの時間がかかるので注意してください。最近開発された iCasper バイオ センサー52, と「リアルタイム」関数を追加するショウジョウバエCaspaseTracker バイオ センサーを組み合わせることは、「リアルタイム」と「明るい、暗い」体内バイオ センサーだけだとその赤外信号を表示します。カスパーゼによって裂かれます。

アポトーシスから離れて CaspaseTracker 可能性がある細胞は、直接または間接的、後オートファジーなどのカスパーゼ活性化の過程で細胞死経路を切り替えることができますとしても別の種類の細胞死の中にアクティブ化します。飢餓95,96, 冷たい衝撃誘起プラズマ膜破裂19,55,56,78, スタウロスポリン誘発ネクロトーシス97、によって壊死 98。私たちの現在と以前の研究実証 CaspaseTracker バイオ センサーがこれら細胞死誘導生体外でまたは生体内で17,18,19から回復した細胞をラベルすることができます。,20,21. 死細胞の回復が、アナスタシスは、異なる細胞死を逆にすることができます一般的な細胞回復現象を示唆しているようにこれらの細胞の死の帰納だけでは、同じセルに複数の細胞死経路を有効にできる同時に、プロセスを個別に、または同時に、アポトーシス、オートファジー、壊死、ネクロトーシスを含みます。

体内の CaspaseTracker バイオ センサーはまだ未知の機能、メカニズム、およびアナスタシスは(図 4)21の治療上の含意の追求を促進します。アナスタシスはの分子シグネチャを明らかにするため行った時間コース全ゲノム遺伝子発現マイクロ アレイ研究エタノールによるアポトーシス誘導の反転中マウス初代肝細胞を分析し、興味深いことの顕著な変化を発見するには生存、抗酸化の DNA 損傷応答、ヒストン修飾、血管新生、細胞移動、変換18,21を含む複数の経路に関与する遺伝子の転写。この発見は、ひと肝臓癌 HepG2 細胞のアポトーシス18,21, からの回復の検証研究とまた HeLa 細胞アポトーシス99の回復の最近独立した RNA 塩基配列解読研究によってサポートされます。興味深いことに、anastatic の細胞で見つけられたいくつかの生存因子の発現は心不全反転、腫瘍の進行と癌再発100,101,102, 観察も示唆アナスタシスはの潜在的な参加。アナスタシスは生理学的、病理学的、治療の可能性を研究するには、これは機構と治療研究を有効にすると anastatic 細胞を識別し、小動物の彼らの運命を追跡することが重要です。私たちショウジョウバエおよび哺乳類の CaspaseTracker バイオ センサーは正常な発達、恒常性、組織の回復、腫瘍の進化、ガンの再発、転移のアナスタシスはの潜在的な貢献をテストするための便利なツールになります。これらの研究からの知見はアナスタシスは、自然な役割の私達の理解を増加し、細胞死と生存とアナスタシスはの制御を媒介して難治性疾患の画期的な新しい治療法を識別するために可能性を提供します。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

ショウジョウバエイメージ図 3 およびビデオの原稿; ありがとうダレン ObbardJ. マリー ・ ハードウィック、ウェイド ・ ギブソン、ヘザー M. ラムこの原稿の貴重な議論のため。この作業によって、卿エドワード ・ ユード記念フェローシップ (H.L.T.)、博士ウォルター Szeto 記念奨学金 (H.L.T.) が支持されたフルブライト付与生命科学研究財団フェローシップ (H.L.T.) と NCI K22 付与 CA204458 (H.L.T.) 007-2009 (H.L.T.) です。ホー ラム唐は、Shurl と生命科学研究財団 (2014-2017) ケイ Curci 財団研究員だった。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium Vector Products H-1000 Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI) Vector Products H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Mitotracker Red CMXRos  Molecular Probes M-7512 Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS) Sigma-Aldrich A8806 Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline  VWR 114-056-101 Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T8787 Detergent for cell permeabilization
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000  Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W AmScope WBM99316  Light source

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