अस्तित्व के समय की माप में

Biology

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Kaneko, G., Yoshinaga, T., Gribble, K. E., Welch, D. M., Ushio, H. Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54126, doi:10.3791/54126 (2016).

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Abstract

Introduction

रोटीफर्स सूक्ष्म महानगरीय प्राणीमन्दप्लवक (<1 मिमी) कर रहे हैं कि जाति रोटिफेरा 1 गठन। वे एक साधारण शरीर लगभग 1000 दैहिक कोशिकाओं के साथ ही एक विशेषता पहिया तरह सिलिअरी तंत्र की रचना की योजना कोरोना, जो हरकत और खिलाने के लिए प्रयोग किया जाता है कहा जाता है। अधिकांश रोटीफर्स कक्षाओं Monogononta या Bdelloidea, जिसके बारे में 1600 और 500 प्रजातियों में क्रमश: 2 को रोकने के लिए संबंधित। Monogonont रोटीफर्स आम तौर पर, दोनों यौन और अलैंगिक प्रजनन चरणों (चक्रीय अनिषेकजनन) है, जबकि bdelloid रोटीफर्स अनिवार्य अनिषेकजनन 3 से पुनरुत्पादन। यह इस प्रकार आनुवंशिक रूप से समान किरीटी व्यक्तियों, जो प्रयोगों में उच्च reproducibility सुनिश्चित करता है प्राप्त करने के लिए संभव है। इसके अलावा, वे इतने कम उम्र, संस्कृति में आसानी, जीनोमिक और transcriptomic अनुक्रम डेटा 4-7 की उपलब्धता, और एक अद्वितीय वंशावली स्थिति एक से दूर के रूप में मॉडल जीवों के रूप में कई अन्य लाभ है,rthropods और नेमाटोड 8। रोटीफर्स इसलिए पारिस्थितिकी, विषाक्तता में अकशेरुकी मॉडल का वादा किया, और उम्र बढ़ने के अध्ययन 9-12 रहे हैं।

पर्यावरण के तनाव या रसायनों के लिए जोखिम के तहत अस्तित्व के समय इन अनुसंधान क्षेत्रों 13-19 में एक बार मापा पैरामीटर है। हालांकि, सतर्कता जब रोटीफर्स के अस्तित्व के समय को मापने क्योंकि यह उनकी माताओं के पर्यावरण की स्थिति के लिए अतिसंवेदनशील है की जरूरत है। अर्थात्, monogonont किरीटी Brachionus manjavacas में, वृद्ध मां से महिला वंश युवा माताओं से उन लोगों की तुलना में कम देता है; हालांकि, मातृ कैलोरी प्रतिबंध (सीआर) आंशिक रूप से उन्नत मातृ उम्र 20 के हानिकारक प्रभावों ऑफसेट। बी में plicatilis, मातृ सीआर संतानों दीर्घायु, भुखमरी के तहत लंबे समय जीवित रहने के लिए, और उच्च ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिरोध एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों 21,22 का बढ़ाया अभिव्यक्ति के साथ जुड़ा हुआ है। मातृ उम्र प्रभावयह भी bdelloid रोटीफर्स 23 में देखा गया है। इसलिए, प्रयोगात्मक रोटीफर्स की शर्तों को ध्यान से अस्तित्व के समय के मापन से पहले कई पीढ़ियों पर सिंक्रनाइज़ किया जाना चाहिए।

यहाँ हम कई पीढ़ियों से अधिक संस्कृति की स्थिति के तुल्यकालन निम्नलिखित Brachionus रोटीफर्स में अस्तित्व के समय की माप के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। रुक-रुक कर उपवास (यदि), सीआर के विभिन्नता जहां रोटीफर्स समय समय पर तंग आ चुके हैं, दीर्घायु 22,24 पर अगर अच्छी तरह से ज्ञात प्रभाव के कारण तुल्यकालन के प्रभाव प्रकट करने के लिए लागू किया गया था।

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Protocol

1. मीडिया की तैयारी

नोट: उपयोग लवणता 16.5 पीपीटी (पीएसयू) के आधे-पतला Brujewicz कृत्रिम समुद्री जल। अन्य कृत्रिम seawaters भी अक्सर संस्कृति Brachionus रोटीफर्स 25,26 करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।

  1. 454 मिमी NaCl, मे 26 मिमी 2 MgCl, 27 मिमी MgSO 4, 10 मिमी KCl, और आसुत जल के 10 मिमी 2 CaCl 4.5 एल (अंतिम मात्रा हो जाएगा 5 एल)। वैकल्पिक रूप से, विआयनीकृत पानी कमजोर पड़ने के बजाय आसुत जल का उपयोग करें। 2 CaCl अन्य सभी लवण भंग के बाद जोड़ें।
  2. 0.48 एम 3 NaHCO शेयर समाधान (200x एकाग्रता) तैयार करें। ऊपर समाधान करने के लिए इसे 25 मिलीलीटर जोड़ें। 3 NaHCO के अंतिम एकाग्रता 2.4 मिमी है।
  3. 0.4 मीटर NaBr शेयर समाधान (500x एकाग्रता) तैयार करें। ऊपर समाधान करने के लिए इसे के 10 मिलीलीटर जोड़ें। NaBr के अंतिम एकाग्रता 0.8 मिमी है। आसुत जल के साथ 5 एल अप करें।
  4. एक 0.45 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर के साथ समाधान फ़िल्टर।यह बाँझ पानी के साथ दो बार उपयोग करने से पहले पतला (वी / वी)।
    नोट: यह एक शेयर समाधान के रूप में Brujewicz कृत्रिम समुद्री जल की एक 2x एकाग्रता बनाने के लिए संभव है।

2. सामान्य संस्कृति की स्थिति

  1. कल्चर प्रयोगशाला उठाया या 20 और 30 डिग्री सेल्सियस के बीच एक बाँझ 100 मिलीलीटर बीकर में जंगली कब्जा कर लिया रोटीफर्स। उच्च तापमान कम जीवनकाल और त्वरित प्रजनन में परिणाम। प्रयोगों की सुविधा के लिए 25 डिग्री सेल्सियस का प्रयोग करें। किरीटी घनत्व या कृत्रिम समुद्री जल की मात्रा एक बड़ा मुद्दा यहाँ नहीं है।
  2. कृत्रिम समुद्री जल में 11 संस्कृति आहार microalgae प्रजातियों। विवरण 11 के लिए स्नेल एट अल देखें। (2014)। आमतौर पर, Tetraselmis tetrathele का उपयोग करें (~ 2 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल 27,28), टी suecica (~ 6 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल 25,29), और Nannochloropsis oculata (~ 7 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल 30,31)। आहार शैवाल के बाद से (प्रजातियों, संस्कृति Conditआयनों, जैव रासायनिक रचनाओं) काफी Brachionus रोटीफर्स के अस्तित्व के समय को प्रभावित करती है, सभी प्रयोगात्मक समूहों में microalga का एक ही बहुत का उपयोग करें।
  3. खिलाने और कभी कभी मीडिया बदल रहा है (उदाहरण के लिए, हर 2 दिन खिलाने के लिए और हर हफ्ते टीका लगाना) द्वारा एक बैच संस्कृति में रोटीफर्स के एक शेयर की आबादी रखें। कई नवजात शिशुओं और वयस्कों असर 2-3 अंडे जब रोटीफर्स इष्टतम स्थिति में हैं मनाया जा सकता है।
    नोट: प्रयोगात्मक रोटीफर्स प्राप्त करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका आराम कर रही अंडे हैच करने के लिए है। आराम कर रही अंडे से रची रोटीफर्स अच्छी तरह से सिंक्रनाइज़ करने के लिए माना जाता है, और उनके जीवन काल amictic अंडे 11 से रची रोटीफर्स के उस से काफी अलग नहीं है। हालांकि, आराम कर रही अंडे से रोटीफर्स प्रजनन amictic अंडे से उन लोगों की तुलना में पहले शुरू करते हैं। इस प्रकार, सावधानी उनके प्रजनन लक्षण के मापन के लिए आवश्यक है।

प्री-संस्कृति से रोटीफर्स 3. तुल्यकालन

  1. अनुसूचित जनजाति से एक भी किरीटी का चयन करेंOck जनसंख्या और संस्कृति के रूप में 2.1-2.3 में वर्णित एक उप-जनसंख्या है कि प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जाएगा स्थापित करने के लिए। आमतौर पर दो सप्ताह के लिए संस्कृति।
  2. उप जनसंख्या से अंडे असर रोटीफर्स लीजिए (व्यक्तियों है कि प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा की एक डबल संख्या में एकत्र)। एक भी पलटन के रूप में संस्कृति उन्हें (घनत्व: ~ 50 व्यक्तियों / एमएल) 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली जी भरकर खिलाने के तहत एक ताजा मीडिया में 2.1-2.3 में वर्णित के रूप में। जनसंख्या घनत्व को नियंत्रित करना महत्वपूर्ण है क्योंकि वातानुकूलित माध्यम Brachionus रोटीफर्स 32,33 की प्रजनन शरीर विज्ञान को प्रभावित करता है।
  3. वयस्कों 'पहले अंडे से नव तैयार संस्कृति मीडिया के लिए रची नवजात शिशुओं स्थानांतरण। 2-3 पीढ़ियों से इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  4. अस्तित्व के समय को मापने के लिए एक निश्चित समय अवधि (जैसे, <3 घंटा) के भीतर रची नवजात शिशुओं का प्रयोग करें। एक व्यक्ति के चयन में एक संभव पूर्वाग्रह से बचने के लिए, हालांकि बहुत असंभव है, कई स्वतंत्र का उपयोग कर reproducibility जाँचलटकता हुआ उप आबादी।
    नोट: रोटीफर्स आम तौर पर इस शर्त के तहत केवल अलैंगिक पुन: पेश के रूप में, यह सुनिश्चित कोई पुरुषों प्रयोग भर में मौजूद हैं। नर नवजात शिशुओं की तुलना में छोटे होते हैं और आम तौर पर तेजी से महिलाओं की तुलना में चलते हैं। Mictic महिलाओं को कुछ शर्तों के तहत 29 amictic महिलाओं से अलग जीवनकाल की है।

4. अस्तित्व के समय की माप

  1. प्लास्टिक की प्लेटें प्लेस में नवजात शिशुओं (आमतौर पर 24 या 48 अच्छी तरह प्लेटें, कृत्रिम समुद्री जल के प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त 1 मिलीलीटर के साथ)।
  2. 24 घंटा के अंतराल पर, उच्च तापमान (30 डिग्री सेल्सियस या उससे ऊपर) पर अगर नव तैयार संस्कृति मीडिया के लिए या 12 घंटे के अंतराल पर रोटीफर्स हस्तांतरण। संतानों की संख्या रिकॉर्ड और प्रत्येक व्यक्ति के जिंदा या मुर्दा है या नहीं। मृत के रूप में किरीटी रिकॉर्ड जब प्रभामंडल की सिलिया आंदोलन पूरी तरह से बंद कर दिया है।
    नोट: रोटीफर्स अक्सर कुओं की ओर दीवारों को देते हैं। पानी की कोमल pipetting उन्हें खोजने के लिए मदद करता है। रोटीफर्स नहीं मिला या एआर रहे हैंई गलती से pipetting द्वारा क्षतिग्रस्त, उन्हें रिकॉर्ड नहीं के रूप में "मृत" के रूप में "सेंसर"।
  3. नवजात शिशुओं निकालें जब प्रयोगात्मक रोटीफर्स सक्रिय रूप से reproducing रहे हैं। नवजात शिशुओं के लिए तेजी से आगे बढ़ने और यह उन्हें प्रयोगात्मक रोटीफर्स से अलग करने के लिए कभी कभी मुश्किल है।

5. डेटा विश्लेषण

  1. कापलान Meier अस्तित्व वक्र (आंकड़े 1 और 2) एक्स अक्ष पर वाई अक्ष और समय पर संचयी जीवित रहने की दर साजिश रचने के द्वारा बनाएँ। यह अस्तित्व के डेटा का सबसे आम प्रतिनिधित्व है। अस्तित्व के समय 34 के सांख्यिकीय तुलना के लिए गैर पैरामीट्रिक लॉग-रैंक परीक्षण (मेंटल भी-कॉक्स परीक्षण कहा जाता है) का प्रयोग करें। लॉग-पद की परीक्षा भी इस तरह के जेएमपी और आर के रूप में अन्य मानक सांख्यिकीय पैकेज में शामिल किया जाता है
    नोट: छात्र की टी परीक्षण या विचरण (एनोवा) पैरामीट्रिक एकाधिक तुलना द्वारा पीछा के विश्लेषण का उपयोग न करें, क्योंकि सामान्य वितरण आम तौर पर अस्तित्व डेटा 35 से नहीं मिले है। इसके अलावा, इन methoडी एस के खाते में सेंसर व्यक्तियों से नहीं लेते हैं। अगर कोई सेंसर डेटा है मान व्हिटनी यू परीक्षण का इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Representative Results


चित्रा 1 खराब सिंक्रनाइज़ आबादी (दो प्रतिकृति के बाहर) के प्रतिनिधि अस्तित्व घटता से पता चलता है। इस प्रयोग में, रोटीफर्स थे या तो फेड हर रोज [जी भरकर (AL) समूह] या (समूह यदि) हर दूसरे दिन। माध्य अस्तित्व अल समूहों में है और अगर 13 और 18 दिनों क्रमशः था। हालांकि यह अच्छी तरह से मालूम है कि अगर किरीटी की उम्र फैली, इस प्रयोग AL की और समूहों यदि जीवनकाल के बीच एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर का पता लगाने में विफल रहा है। अनुभव से, जल्दी मृत्यु दर और जीवित रहने की दर में धीरे-धीरे गिरावट आती है में अपर्याप्त तुल्यकालन परिणाम के रूप में इस प्रयोग में मनाया। अनुचित उपचार या उप आबादी के लिए कम पानी की गुणवत्ता की वजह से रोटीफर्स को नुकसान इसी तरह के परिणाम उपज के लिए जाता है।

किरीटी शर्तों इष्टतम और अच्छी तरह से सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं, जल्दी मृत्यु दर मुश्किल से मनाया जाता है और accordin हैGly रोटीफर्स प्रयोग (चित्रा 2) के बाद के चरण के दौरान एक सिंक्रनाइज़ रास्ते में मर जाते हैं। माध्य अस्तित्व अल समूहों में है और अगर 13 और 20 दिन क्रमशः था। कम जानवरों के चित्र 1 में प्रयोग की तुलना में इस्तेमाल किया गया है, इन समूहों के बीच उम्र में अंतर सांख्यिकीय महत्वपूर्ण था। यह अधिक से अधिक पांच प्रयोगों है कि पहले 22 प्रकाशित किया गया है से प्रतिनिधि परिणाम है।

आकृति 1
चित्रा 1:। आंतरायिक उपवास (यदि) के अधीन खराब सिंक्रनाइज़ व्यक्तियों के लिए कापलान-मायर घटता अल समूह, प्रयोग के दौरान जी भरकर तंग आ गया था जबकि अगर समूह हर दूसरे दिन तंग आ गया था। एन = 11 और एन = 12 अल के लिए और समूहों यदि क्रमश: (एन प्रयोग में इस्तेमाल अलग-अलग की संख्या को संदर्भित करता है)। प्रयोग के कामकाज की गई थीमेड 25 डिग्री सेल्सियस पर। जीवन काल में कोई महत्वपूर्ण अंतर जब लॉग-रैंक परीक्षण का इस्तेमाल किया गया था (पी = 0.1207) का पता चला था। हालांकि, इस डेटा की व्याख्या करने की वजह से लॉग-रैंक परीक्षण दो क्रासिंग अस्तित्व घटता तुलना करने के लिए हालांकि परीक्षण मजबूत 36 हो जाता है नहीं किया जाना चाहिए मुश्किल है। कोई स्थापित तरीकों वर्तमान सेंसर डेटा के साथ अस्तित्व घटता पार करने के लिए उपलब्ध हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। यदि अधीन सिंक्रनाइज़ व्यक्तियों के लिए कापलान-मायर घटता किरीटी पलटन, पूर्व संस्कृति से प्राप्त की, वही अगर अनुसूची के अधीन था (हर दूसरे दिन तंग आ गया)। एन = 6 और एन = 8 अल के लिए और समूहों अगर, क्रमशः। प्रयोग 25 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया गया था। Log-रैंक परीक्षण, पी = 0.0057। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल Brachionus रोटीफर्स में अस्तित्व के समय को मापने के लिए एक विधि का वर्णन है। महत्वपूर्ण कदम कई पीढ़ियों से अधिक किरीटी की स्थिति के तुल्यकालन है। जब प्रयोगात्मक रोटीफर्स अच्छी तरह से सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं, एक ठेठ प्रकार मैं अस्तित्व वक्र के रूप में कई पिछले अध्ययनों 18,24,37,38 की रिपोर्ट में बहुत थोड़ा जल्दी मृत्यु दर के साथ मनाया जाता है। अपने अस्तित्व के समय के मानक विचलन इसलिए खराब सिंक्रनाइज़ रोटीफर्स की तुलना में छोटे हो जाते हैं, उच्च सांख्यिकीय शक्ति में जिसके परिणामस्वरूप। तुल्यकालन भी अस्तित्व के समय माप के reproducibility वृद्धि की संभावना है - क्योंकि माताओं इष्टतम परिस्थितियों में संवर्धित कर रहे हैं, मौजूदा प्रोटोकॉल मातृ पीढ़ियों के संभावित हानिकारक प्रभाव ऑफसेट। जल्दी मृत्यु दर अभी भी सावधान तुल्यकालन के बाद मनाया जाता है, नव तैयार संस्कृति मीडिया का उपयोग करने पर विचार करें, शैवाल खिला है, या एक नव स्थापित प्रयोगात्मक पलटन का एक और बहुत कुछ (यानी,प्रोटोकॉल 3.1 से शुरू)।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि अच्छी तरह से सिंक्रनाइज़ रोटीफर्स संभावित ओवर के प्रति संवेदनशील हैं। उदाहरण के लिए, रसायन है कि उम्र बढ़ाने की स्क्रीनिंग पर, कुछ इस प्रोटोकॉल के द्वारा जांच की रसायन खराब सिंक्रनाइज़ रोटीफर्स के जीवनकाल पर महत्वपूर्ण प्रभाव का पता लगाने में विफल हो सकता है (उदाहरण के लिए, जंगली और बैच सुसंस्कृत आबादी से व्यक्तियों)। इस प्रकार, इस तरह के प्रयोगों के परिणामों को सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए।

संतानों के अस्तित्व के समय पर मातृ उम्र का असर भी फल मक्खी ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर और निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस 39,40 सहित अन्य अकशेरुकी मॉडल में सूचना दी गई है। हालांकि इसे और अधिक समय लेने वाली इन लंबे समय रहते मॉडल में है, कई पीढ़ियों से अधिक तुल्यकालन प्रक्रिया इन जानवरों के अस्तित्व के समय की माप में प्रयोगात्मक रूपों को कम करने के लिए उपयोगी होगा।

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Acknowledgements

हम फिल्मांकन में उनकी मदद के लिए, जॉर्ज जार्विस, मार्था बोक, और बेट्टे Hecox-घास का मैदान, समुद्री जैव प्रयोगशाला के आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Wako 190-13921
Magnesium chloride Wako 136-03995
Magnesium sulfate Wako 131-00427
Potassium chloride Wako 168-22111
Calcium chloride Wako 035-00455
Sodium bicarbonate Wako 199-05985
Sodium bromide Wako 190-01515
Membrane filter (0.45 µm pore size) Millipore HAWP04700
Culture plate, 6-well, non-treated Thomas Scientific 6902D01 Flat bottom
Culture plate, 48-well, non-treated Thomas Scientific 6902D07 Flat bottom
Tetraselmis, Living Carolina Biological Supply Company 152610
PRISM 6 GraphPad Software Version 6.0d

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References

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