생존 시간의 측정에

Biology

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Kaneko, G., Yoshinaga, T., Gribble, K. E., Welch, D. M., Ushio, H. Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54126, doi:10.3791/54126 (2016).

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Abstract

Introduction

로티퍼는 문 Rotifera 1을 구성하는 미세한 국제 동물 플랑크톤 (<1mm)입니다. 이들은 약 1000 체세포과 특성 차륜 형 섬모 장치 이루어지는 간단한 신체 운동 계획 및 공급을 위해 사용되는 코로나라고있다. 대부분의 로티퍼는 약 1,600과 500 종 각각 2를 포함하는 클래스 단 소강 또는 질 형목에 속한다. bdelloid 로티퍼가 의무 처녀 생식 (3)에 의해 재생하는 동안 단 소강 로티퍼는 일반적으로 모두 성적과 무성 생식 단계 (순환 처녀 생식)가 있습니다. 이 실험에서 높은 재현성을 보장 전적으로 동일한 로티퍼 개인을 얻는 것이 가능하다. 또한, 그들은 짧은 수명, 배양 용이성, 게놈과 transcriptomic 4-7 시퀀스 데이터의 가용성, 및로부터 떨어진 독특한 계통 위치로서 모델 생물 여러 다른 장점을 가지고rthropods 및 선충 8. 로티퍼 따라서 생태 학적, 독성의 무척추 동물 모델을 약속하고, 연구 9-12 노화된다.

환경 스트레스 또는 화학 물질에 노출 하에서 생존 시간이 13-19 연구 분야에서 자주 측정 된 파라미터이다. 이 어머니의 환경 조건에 민감하기 때문에 피퍼의 생존 시간을 측정하는 경우에는주의가 필요하다. 즉, 단 소강 로티퍼 Brachionus의 manjavacas에 세 어머니에서 여성 자손은 젊은 산모에서보다 짧은 수명을 가지고, 그러나 산모의 칼로리 제한 (CR)은 부분적으로 고급 산모의 나이 (20)의 해로운 효과를 상쇄. B.에서 plicatilis, 산모 CR은 자손의 수명, 기아에서 오래 생존 기간 및 항산화 효소 (21, 22)의 강화 된 표현과 관련된 높은 산화 스트레스 저항을 제공한다. 임산부 연령 효과또한 bdelloid 로티퍼 (23)에서 관찰되었다. 따라서, 실험 로티퍼의 조건을주의 깊게 생존 시간을 측정하기 전에 몇 세대에 걸쳐 동기화되어야합니다.

여기에서 우리는 여러 세대에 걸쳐 배양 조건의 동기화 다음 Brachionus의 로티퍼의 생존 시간의 측정을위한 프로토콜을 제공합니다. 간헐적 단식 (IF), 피퍼 주기적으로 공급되는 CR의 변형은 22, 24에 의한 장수 IF의 잘 알려진 효과 동기화의 효과를 나타 내기 위해 적용 하였다.

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Protocol

미디어의 1. 준비

참고 : 사용에게 염분 16.5 PPT (PSU)의 반 희석 Brujewicz 인공 해수를. 다른 인공 seawaters도 자주 문화 Brachionus의 로티퍼 (25), (26)에 사용된다.

  1. 454 mM의 염화나트륨을 추가, 26 밀리미터의 MgCl 2, 27 mM의 황산, 10 밀리미터의 KCl, 증류수 10 mM의 CaCl2를 4.5 L은 (최종 부피 5 L 될 것입니다). 또한, 탈 희석 물 대신에 증류수를 사용합니다. 다른 모든 염을 용해 후 CaCl2를 추가합니다.
  2. 0.48 M의 NaHCO3 원액 (200 배 농도)를 준비합니다. 상기 용액에 25 ML을 추가합니다. NaHCO3을 최종 농도가 2.4 mm이다.
  3. 0.4 M NaBr은 원액 (500 배 농도)를 준비합니다. 상기 용액에 10 ㎖를 추가합니다. NaBr은 최종 농도가 0.8 mm이다. 증류수로 5 L까지합니다.
  4. 0.45 ㎛ 멤브레인 필터 솔루션 필터.사용하기 전에 그것을 멸균 수로 2 회 희석 (v / v)로.
    참고 :이 원액으로 Brujewicz 인공 해수의 2 배 농도를 할 수있다.

2. 일반 문화 조건

  1. 문화 실험실 제기 또는 20 및 30 °의 C 사이의 멸균 100 ㎖ 비이커에 야생 캡처 로티퍼. 높은 온도는 더 짧은 수명 가속 재생을 초래한다. 실험의 편의를 위해 25 ° C를 사용합니다. 로티퍼 밀도 또는 인공 해수의 부피는 여기에 큰 문제가되지 않습니다.
  2. 인공 해수 (11) 문화식이 미세 조류 종. 스넬 등의 알을 참조하십시오. (2014) 자세한 내용은 11. 일반적으로, Tetraselmis의 tetrathele 사용 (~ 2 × 10 5 세포 / ㎖ 27,28), T. suecica (~ 6 × 10 5 세포 / ㎖ 25,29),Nannochloropsis의 oculata (~ 7 × 10 6 세포 / ㎖ 30, 31). 다이어트 조류 때문에 (종, 문화 CONDIT이온, 생화학 적 조성물은) 상당히 모든 실험군에서 microalga 같은 많이 사용, Brachionus의 로티퍼의 생존 기간에 영향을 미친다.
  3. 먹이 (예를 들어, 2 일마다 먹이를 매주 접종) 가끔 미디어를 변경하여 배치 문화에 로티퍼의 재고 인구를 유지합니다. 로티퍼가 최적의 상태에있을 때 많은 신생아 2-3 계란 베어링 성인 관찰 할 수있다.
    참고 : 실험 로티퍼를 얻기 위해 또 다른 방법은 휴식 달걀을 부화하는 것입니다. 휴식 계란에서 부화 로티퍼 잘 동기화 된 것으로 간주, 그들의 수명은 amictic 계란 (11) 부화 로티퍼의 그것과 크게 다르지 않다된다. 그러나, 휴식 계란에서 로티퍼 이전 amictic 계란에서보다 재생을 시작합니다. 따라서,주의는 생식 특성의 측정이 필요하다.

사전 문화에 의해 로티퍼 3. 동기화

  1. 보안 목표 명세서에서 하나의 로티퍼를 선택옥토퍼스의 인구와 문화로 실험에 사용되는 하위 집단을 설정 2.1-2.3에 설명. 2 주 동안 일반적으로 문화.
  2. 하위 집단에서 계란 베어링 로티퍼를 수집 (실험에 사용되는 개인의 이중 번호를 수집). 단일 코호트 같은 배양을 (농도 : ~ 50 개인 / ㎖) 광고 무제한 공급하에 신선한 배지에서 2.1-2.3에서 설명한 바와 같이, 6 웰 배양 플레이트이다. 조절 된 매체가 Brachionus의 로티퍼 (32, 33)의 생식 생리에 영향을주기 때문에 인구 밀도를 제어하는 것이 중요합니다.
  3. 새로 준비 문화 매체에 성인의 첫번째 계란에서 부화 신생아를 전송합니다. 2 ~ 3 세대에 걸쳐이 절차를 반복합니다.
  4. 생존 시간을 측정하기위한 소정의 시간주기 (예를 들어, <3 시간)에서 빗금 신생아를 사용한다. , 색인 전압 여러 가지를 사용하여 재현성을 확인 매우 희한하지만, 하나의 개인을 선택할 가능성 편견을 방지하기 위해늘어진 하위 집단.
    참고 : 로티퍼는 일반적으로이 조건으로 만 무성 생식으로, 어떤 남성이 실험을 통해 존재하지 않는 확인합니다. 남성은 신생아보다 작은 일반적으로 빠른 여성보다 이동합니다. Mictic 여성은 특정 조건 (29)에서 amictic 여성 다른 수명을 가지고있다.

생존 시간 4. 측정

  1. 플라스틱 접시에 배치 신생아 (인공 해수의 각 웰 포함 1 mL를 일반적으로 24 또는 48 웰 플레이트).
  2. 24 시간 간격으로, 만약 높은 온도 (위 30 ° C 이상)에서 새로 제조 된 배양 배지 또는 12 시간 간격으로 로티퍼를 전송합니다. 자손의 수를 기록하고 각 개인은 죽은이나 살아 있는지 여부. 코로나의 섬모 운동이 완전히 정지했을 때 죽은로 로티퍼를 기록합니다.
    참고 피퍼 종종 웰의 측벽에 부착. 물을 부드러운 피펫 그들을 찾는 데 도움이됩니다. 로티퍼를 찾을 또는 아칸소되지 않은 경우전자는 실수로 "검열​​"라고하지 "죽은"로, 그들을 기록, 피펫에 의해 손상.
  3. 실험 로티퍼 적극적으로 재생 될 때 신생아를 제거합니다. 신생아 빠르게 성장하고 실험 피퍼 구별 때때로 어렵다.

5. 데이터 분석

  1. 카플란 - 마이어 생존 곡선 (도 12)를 X 축, Y 축 및 시간을 누적 생존율을 플로팅하여 만들기. 이 생존 데이터의 일반적인 표현이다. 생존 시간 (34)의 통계 비교 (또한 벽난로 - 콕스 테스트라고도 함) 비모수 로그 순위 테스트를 사용합니다. 로그 순위 테스트는 또한 JMP와 R. 같은 다른 표준 통계 패키지에 포함되어 있습니다
    주 : 정규 분포는 일반적으로 생존 데이터 (35)에 의해 충족되지 않기 때문에 학생의 t- 테스트 또는 파라 메트릭 다중 비교 다음 분산 (ANOVA) 분석을 사용하지 마십시오. 또한, 이러한 운전 방식DS는 계정에 검열 개인을하지 않습니다. 더 검열 데이터가없는 경우 맨 - 휘트니 U 시험을 이용할 수있다.

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Representative Results


그림 1은 제대로 동기화 인구 (두 개의 복제 만점)의 대표적인 생존 곡선을 보여줍니다. 이 실험에서, 로티퍼이었다 중 공급 일상 [광고 무제한 (AL) 그룹] 또는 (그룹 IF) 매일. 평균 생존 기간은 각각 그룹화 AL 및 IF (13) 18 일이었다. 이를 잘 IF는 로티퍼의 수명을 연장하는 것이 알려져 있지만,이 실험은 AL 및 그룹 IF 수명 사이의 유의 한 차이를 검출하지 못했다. 경험적 조기 사망률과 생존율의 점진적인 감소가 불충분 동기화 결과는이 실험에서 관찰했다. 하위 집단에 대한 부적절한 처리 또는 낮은 수질로 인한 로티퍼 손상과 유사한 결과를 얻을하는 경향이있다.

로티퍼 조건이 최적 잘 동기화되면, 조기 사망은 거의 관찰되지 및 accordin된다의 Gly 로티퍼 실험 (그림 2)의 나중 단계에서 동기화 된 방식으로 죽는 경향이있다. 평균 생존 기간은 각각 그룹화 AL 및 IF (13) 20 일이었다. 적은 수의 동물이도 1의 실험보다 사용되었지만, 이들 그룹 간의 수명의 차이는 통계 학적으로 유의 하였다. 이것은 이전에 22 게시 된 개 이상 실험의 대표적인 결과입니다.

그림 1
그림 1 :.은 IF 그룹이 매일 공급 된 반면, 간헐적 단식 (IF)를 실시 제대로 동기화 개인에 대한 카플란 - 마이어 곡선은 AL 그룹은 실험을하는 동안 광고 무제한을 공급 하였다. N은 AL에 대해 11, N = 12 및 그룹 = 경우 각각 (N은 실험에 사용 된 개개의 개수를 나타낸다). 실험을 하였다 perfor의대 25 ° C에서. 로그 순위 테스트 (P = 0.1207)를 사용했을 때 수명에 유의 한 차이가 발견되지 않았다. 그러나,이 데이터는 시험 36 강력한 것으로 알려져 있지만 로그 - 랭크 시험을 두 횡단 생존 곡선을 비교하기 위해 사용되지 않아야하기 때문에 해석하는 것이 곤란하다. 확립 된 방법은 현재 검열 데이터와 생존 곡선을 교차 할 수 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 :. IF를 실시 동기화 개인 카플란 - 마이어 곡선은 예비 배양에 의해 얻어진 로티퍼 코호트는, (매일 먹이) 같은 IF 일정을 하였다. N = 6, AL에 대한 N = 8 및 그룹 IF, 각각. 실험은 25 ℃에서 수행 하였다. 기록-순위 테스트, P = 0.0057. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

현재의 프로토콜 Brachionus 피퍼의 생존 시간을 측정하는 방법을 설명한다. 중요한 단계는 여러 세대에 걸쳐 로티퍼 상태의 동기화이다. 실험 피퍼 잘 동기화되면 여러 선행 연구 18,24,37,38에보고 된 일반적인 유형 I 생존 곡선은 거의 조기 사망이 관찰된다. 생존 시간의 표준 편차 따라서 높은 통계 전력의 결과로 가난하게 동기화 로티퍼에 비해 작아진다. 동기화는 또한 생존 시간 측정의 재현성을 향상 할 것으로 예상된다 - 엄마 최적 조건에서 배양되므로, 현재 프로토콜 모체 세대의 가능한 해로운 효과를 상쇄. 조기 사망률이 여전히 조심 동기화 후 관찰되는 경우, 새로 준비 문화 미디어 사용을 고려, 먹이 조류, 또는 새로 설립 된 실험 집단의 다른 많은 (,) 프로토콜 3.1에서 시작합니다.

이 프로토콜의 제한은 잘 동기화 로티퍼 잠재적 통해 문자를 구분한다는 것입니다. 예를 들어, 수명을 연장 화학 물질의 심사에 따라,이 프로토콜에 의해 상영 일부 화학 물질은 제대로 동기화 로티퍼의 수명에 심각한 영향을 감지하지 못할 수 있습니다 (예를 들어, 야생 및 배치 배양 인구에서 개인). 따라서, 이러한 실험 결과는 신중하게 해석되어야한다.

자손의 생존 기간에 산모의 나이의 효과는 과일 파리 초파리 melanogaster의Caenorhabditis 엘레은 39, 40 엘레 간스 선충을 포함한 다른 무척추 동물 모델에서보고되었다. 더 시간 소모적이 장수 모델이지만 이들 동물이 생존 시간의 측정 실험에서의 변화를 감소시키기 위해 여러 세대에 걸쳐 동기화 절차에 유용하다.

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Acknowledgements

우리는 촬영에 그들의 도움을, 조지 자비스, 마사 복, 그리고 베티 Hecox - 레아, 해양 생물 연구소에 감사하고 있습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Wako 190-13921
Magnesium chloride Wako 136-03995
Magnesium sulfate Wako 131-00427
Potassium chloride Wako 168-22111
Calcium chloride Wako 035-00455
Sodium bicarbonate Wako 199-05985
Sodium bromide Wako 190-01515
Membrane filter (0.45 µm pore size) Millipore HAWP04700
Culture plate, 6-well, non-treated Thomas Scientific 6902D01 Flat bottom
Culture plate, 48-well, non-treated Thomas Scientific 6902D07 Flat bottom
Tetraselmis, Living Carolina Biological Supply Company 152610
PRISM 6 GraphPad Software Version 6.0d

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References

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