Die Messung der Überlebensdauer in

Biology

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Kaneko, G., Yoshinaga, T., Gribble, K. E., Welch, D. M., Ushio, H. Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54126, doi:10.3791/54126 (2016).

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Abstract

Introduction

Rotifers sind mikroskopisch kleine kosmopolitische Zooplankton (<1 mm), die die phylum Rotatorier 1 darstellen. Sie haben eine einfache Körperplan von ca. 1.000 somatischen Zellen besteht, sowie eine charakteristische radähnlichen ciliary Vorrichtung die corona genannt, die für die Fortbewegung und Fütterung verwendet wird. Die meisten rotifers gehören zu den Klassen Monogononta oder Bdelloida, die etwa 1600 und 500 Arten enthalten jeweils 2. Monogononta rotifers haben in der Regel sowohl sexuelle und asexuelle Reproduktionsphasen (zyklische Parthenogenese), während Bdelloid Rotatorien durch obligatorische Parthenogenese 3 reproduzieren. Es ist somit möglich, genetisch identische rotifer Individuen zu erhalten, die in Experimenten eine hohe Reproduzierbarkeit gewährleistet. Darüber hinaus haben sie mehrere andere Vorteile als Modellorganismen, wie beispielsweise eine kurze Lebensdauer, Einfachheit der Kultur, die Verfügbarkeit von genomischen und transkriptomischen Sequenzdaten 4-7 und eine einzigartige phylogenetische Position entfernt von a8 rthropods und Nematoden. Rotifers versprechen daher invertebrate Modelle in ökologische, toxikologische und Alterungsuntersuchungen 12.09.

Die Überlebenszeit unter der Exposition gegenüber Umweltstress oder Chemikalien ist ein häufig gemessene Parameter in diesen Forschungsfeldern 13-19. Allerdings ist Vorsicht geboten, wenn die Überlebenszeit von Rotatorien Messung, weil sie anfällig gegenüber Umweltbedingungen ihrer Mütter ist. Und zwar in der Monogononta rotifer Brachionus Manjavacas, weiblichen Nachkommen von im Alter von Mütter haben eine kürzere Lebensdauer als die von jungen Mütter; jedoch mütterliche Kalorienrestriktion (CR) kompensiert teilweise die schädlichen Auswirkungen von fortgeschrittenen Alter der Mutter 20. In B. plicatilis, mütterliche CR bietet Nachkommen Langlebigkeit, Beständigkeit lange Überlebenszeit unter Hunger und hohen oxidativen Stress verbunden mit erhöhter Expression von antioxidativen Enzymen 21,22. Das Alter der Mutter WirkungAuch in Bdelloid Rotatorien 23 beobachtet. Daher sollten die Bedingungen der experimentellen Rotatorien sorgfältig über mehrere Generationen vor der Messung der Überlebenszeit synchronisiert werden.

Hier bieten wir ein Protokoll für die Messung der Überlebenszeit in Brachionus rotifers nach der Synchronisation von Kulturbedingungen über mehrere Generationen hinweg. Intermittierende Fasten (IF), eine Variation von CR wo rotifers periodisch zugeführt werden, um die Wirkung der Synchronisation aufgrund der bekannten Wirkung von IF auf Langlebigkeit 22,24 offenbaren angewendet.

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Protocol

1. Herstellung von Medien

Hinweis: Verwenden Sie Halb verdünnt Brujewicz künstlichem Meerwasser Salzgehalt 16,5 ppt (PSU). Andere künstliche seawaters werden auch häufig verwendet , um Kultur Brachionus rotifers 25,26.

  1. Hinzufügen 454 mM NaCl, 26 mM MgCl 2, 27 mM MgSO 4, 10 mM KCl, und 10 mM CaCl 2 bis 4,5 L destilliertem Wasser (Endvolumen 5 wird L sein). Alternativ dazu können Sie entsalztem Verdünnungswasser anstelle von destilliertem Wasser. In CaCl 2 , nachdem alle anderen Salze aufzulösen.
  2. Bereiten Sie die 0,48 M NaHCO 3 - Stammlösung (200x Konzentration). 25 ml davon zu der obigen Lösung. Die Endkonzentration von NaHCO 3 beträgt 2,4 mM.
  3. Bereiten Sie die 0,4 M NaBr-Stammlösung (500x Konzentration). 10 ml davon zu der obigen Lösung. Die Endkonzentration von NaBr 0,8 mM. Machen Sie bis zu 5 L mit destilliertem Wasser.
  4. Filtern der Lösung mit einem 0,45 um-Membranfilter.Verdünnen zweimal mit sterilem Wasser vor der Verwendung (v / v).
    Hinweis: Es ist möglich, eine 2x Konzentration von Brujewicz künstlichem Meerwasser als Stammlösung zu machen.

2. Allgemeine Kulturbedingungen

  1. Kultur im Labor erhöht oder Wild gefangen Rotatorien in einem sterilen 100-ml-Becher zwischen 20 und 30 ° C. Höhere Temperaturen führen zu kürzeren Lebensdauer und eine beschleunigte Wiedergabe. Verwenden 25 ° C für die Bequemlichkeit der Experimente. Die rotifer Dichte oder Volumen von künstlichem Meerwasser ist kein großes Problem hier.
  2. Kultur Nahrungs Mikroalge Spezies in künstlichem Meerwasser 11. Siehe Snell et al. (2014) für weitere Einzelheiten 11. Typischerweise verwenden Tetraselmis tetrathele (~ 2 x 10 5 Zellen / ml 27,28), T. suecica (~ 6 x 10 5 Zellen / ml 25,29) und Nannochloropsis oculata (~ 7 x 10 6 Zellen / ml 30,31). Da Diätalgen (Arten, Kultur conditIonen, biochemische Zusammensetzungen) , beeinflusst maßgeblich die Überlebenszeit von Brachionus Rotatorien, die gleiche Menge Mikroalge in allen Versuchsgruppen verwenden.
  3. Halten Sie eine Stammpopulation von Rotatorien in einer Batch - Kultur durch die Fütterung und wechselnden Medien gelegentlich (zB füttern alle 2 Tage und impfen jede Woche). Viele Neugeborene und Erwachsene 2-3 Eier tragen, können beobachtet werden, wenn Rotatorien unter optimalen Bedingungen sind.
    Hinweis: Eine alternative Möglichkeit, experimentelle Rotatorien zu erhalten, ist Dauereier auszubrüten. Rotifers aus ruhenden Eier ausgebrütet werden als gut synchronisiert werden, und ihre Lebensdauer ist nicht signifikant verschieden von der aus amictic Eier 11 schraffiert Rotatorien. Allerdings rotifers aus ruhenden Eier beginnen Reproduktion früher als die aus amictic Eier. Daher ist Vorsicht für Messungen ihrer Reproduktionsmerkmale erforderlich.

3. Synchronisation von Rotifers von Pre-Kultur

  1. Wählen Sie einen einzelnen rotifer aus dem stock Bevölkerung und Kultur wie in 2,1-2,3 beschrieben eine Subpopulation zu etablieren, die für Experimente verwendet werden. Typischerweise Kultur für zwei Wochen.
  2. Sammeln egg tragenden Rotatorien vom Subpopulation (eine doppelte Anzahl von Personen zu sammeln, die für das Experiment verwendet wird). Kultur als eine einzige Kohorte (Dichte: ~ 50 Personen / ml) in einer 6-Well - Kulturplatte wie in 2,1-2,3 in einem frischen Medien unter Ad - libitum - Fütterung beschrieben. Controlling Bevölkerungsdichte ist wichtig , weil das konditionierte Medium 32,33 Fortpflanzungsphysiologie von Brachionus rotifers beeinflusst.
  3. Übertragen ausgebrütet Neugeborenen von der ersten Eier "Erwachsene neu vorbereitet Kulturmedien. Wiederholen Sie diese Prozedur über 2-3 Generationen.
  4. Verwenden innerhalb eines bestimmten Zeitraums schraffierten Neugeborenen (zB <3 h) , um die Überlebenszeit gemessen wird . Um zu vermeiden, eine mögliche Verzerrung des einzelnen Individuums bei der Auswahl, wenn auch sehr unwahrscheinlich, überprüfen Reproduzierbarkeit unter Verwendung mehrerer independent Subpopulationen.
    Hinweis: Da Rotatorien der Regel nur ungeschlechtlich unter dieser Bedingung zu reproduzieren, sicherzustellen, dass keine Männchen während des gesamten Experiments vorhanden sind. Die Männchen sind kleiner als Neugeborene und in der Regel bewegen sich schneller als Frauen. Mictic Weibchen haben unterschiedliche Lebensdauern von amictic Weibchen unter bestimmten Bedingungen 29.

4. Messungen der Überlebenszeit

  1. Ort Neugeborenen in Kunststoffplatten (typischerweise 24- oder 48-Well-Platten, wobei jede Vertiefung mit 1 ml künstlichem Meerwasser).
  2. Nach 24 h Intervallen, übertragen Sie die Rotatorien neu vorbereitet Kulturmedien oder in 12 Stunden Intervallen, wenn bei höherer Temperatur (30 ° C oder höher). Notieren Sie die Anzahl der Nachkommen und ob jeder einzelne ist tot oder lebendig. Notieren Sie sich die rotifer als tot, wenn Zilien Bewegung der Korona vollständig zum Stillstand gekommen ist.
    Anmerkung: Rotifers befestigen häufig an den Seitenwänden der Vertiefungen. Vorsichtiges Pipettieren des Wassers hilft, sie zu finden. Wenn rotifers nicht gefunden oder are versehentlich durch Pipettieren beschädigt, sie aufzunehmen als "zensiert", nicht als "tot".
  3. Entfernen Neugeborenen, wenn experimentelle rotifers aktiv reproduzieren sind. Neugeborenen wachsen schnell und es ist manchmal schwierig, sie aus experimentellen Rotatorien zu unterscheiden.

5. Datenanalyse

  1. Erstellen Sie die Kaplan-Meier - Überlebenskurve (Abbildungen 1 und 2) durch kumulative Überlebensrate auf der Y - Achse und die Zeit auf der X - Achse aufgetragen ist . Dies ist die häufigste Darstellung der Überlebensdaten. Verwenden Sie den nicht-parametrischer Log-Rank - Test auf statistische Vergleich der Überlebenszeit 34 (auch Mantel-Cox - Test genannt). Die Log-Rank-Test wird auch in anderen statistischen Standardpakete wie JMP und R. enthalten
    Hinweis: da Normalverteilung 35 durch das Überleben Daten erfüllt in der Regel nicht nicht Student-t-Test oder Varianzanalyse (ANOVA) , gefolgt von parametrischer mehrere Vergleich verwenden. Auch sind diese methods nehmen nicht zensiert Personen berücksichtigt. Mann-Whitney U-Test kann verwendet werden, wenn es keine zensierten Daten ist.

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Representative Results


Abbildung 1 zeigt repräsentative Überlebenskurven von schlecht synchronisierten Populationen (von zwei Wiederholungen). In diesem Experiment rotifers waren entweder gefüttert jeden Tag [ad libitum (AL) Gruppe] oder jeden zweiten Tag (IF - Gruppe). Das mediane Überleben betrug 13 und 18 Tage in der AL und IF-Gruppe. Obwohl es bekannt ist, dass, wenn die Lebensdauer der rotifer erstreckt, scheiterte dieser Versuch einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den Lebensdauern der AL zu erkennen und IF-Gruppen. Empirisch unzureichende Synchronisation Ergebnisse in der frühen Sterblichkeit und allmählichen Rückgang der Überlebensrate wie in diesem Experiment beobachtet. Schäden an Rotatorien durch unsachgemäße Behandlung oder niedrige Wasserqualität für die Subpopulation verursacht tendenziell ähnliche Ergebnisse zu erzielen.

Wenn rotifer Bedingungen sind optimal und gut synchronisiert, ist frühe Sterblichkeit kaum beobachtet und accordingly Rotatorien neigen dazu , in einer synchronisierten Art und Weise während der späteren Phase des Experiments (Abbildung 2) sterben. Das mediane Überleben betrug 13 und 20 Tage in der AL und IF-Gruppe. Obwohl weniger Tiere als das Experiment in Figur 1 verwendet wurden, war der Unterschied in der Lebensdauer zwischen diesen Gruppen statistisch signifikant. Dies ist die repräsentative Ergebnisse aus mehr als fünf Experimenten , die vorher 22 veröffentlicht wurden.

Abbildung 1
Abb . 1: Kaplan-Meier - Kurven für schlecht synchronisierte Personen zu intermittierenden Fastens (IF) unterworfen , um die AL - Gruppe wurde ad libitum während des gesamten Experiments eingespeist, während die ZF - Gruppe jeden zweiten Tag gefüttert wurde. N = 11 und N = 12 für das AL und IF-Gruppen jeweils (N bezieht sich auf die Anzahl der einzelnen in dem Experiment verwendet). Das Experiment wurde PERFORmed bei 25 ° C. Kein signifikanter Unterschied in der Lebensdauer festgestellt wurde , wenn Log-Rank - Test verwendet wurde (P = 0,1207). Allerdings ist diese Daten schwer zu interpretieren , da Log-Rank - Test nicht verwendet werden sollte , zwei sich kreuzende Überlebenskurven zu vergleichen , obwohl der Test bekannt ist robust 36 zu sein. Keine etablierten Methoden sind zur Zeit für die Überquerung Überlebenskurven mit zensierten Daten verfügbar. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2:. Kaplan-Meier - Kurven für synchronisierte Individuen ausgesetzt IF Die rotifer Kohorte, erhalten durch Vorkultur wurde der gleichen IF Zeitplan unterworfen (jeden zweiten Tag gefüttert). N = 6 und N = 8 für AL und IF-Gruppe. Der Versuch wurde bei 25 ° C durchgeführt wird. Log-Rank - Test, p = 0,0057. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Das aktuelle Protokoll beschreibt ein Verfahren zur in Brachionus Rotatorien die Überlebenszeit gemessen wird . Der entscheidende Schritt ist die Synchronisation von rotifer Bedingungen über mehrere Generationen. Bei experimentellen rotifers gut synchronisiert sind, ist eine typische Typ - I - Überlebenskurve mit sehr wenig frühe Sterblichkeit beobachtet , wie 18,24,37,38 in mehreren früheren Studien berichtet. Die Standardabweichungen der Überlebenszeit werden deshalb kleiner im Vergleich zu schlecht synchronisierten Rotatorien, in hoher statistischer Aussagekraft zur Folge hat. Die Synchronisation wird auch die Reproduzierbarkeit der Überlebenszeitmessungen zu erhöhen erwartet - weil Mütter unter optimalen Bedingungen kultiviert werden, die aktuelle Protokoll Offsets möglich schädlichen Auswirkungen der mütterlichen Generationen. Wenn frühe Sterblichkeit noch nach sorgfältiger Synchronisation beobachtet wird, sollten Sie neu vorbereitet Kulturmedien verwenden, eine andere Menge Fütterung Algen, oder eine neu gegründete experimentelle Kohorte (dhStart von Protokoll 3.1).

Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass die gut synchronisiert Rotatorien sind potentiell überempfindlich. Zum Beispiel beim Screening von Chemikalien , die Lebensdauer verlängern, einige durch dieses Protokoll gescreent Chemikalien versagen kann erhebliche Auswirkungen auf die Lebensdauern von schlecht synchronisierten Rotatorien (zB Personen aus wilden und Batch-kultivierten Populationen) zu erkennen. Somit sollten die Ergebnisse dieser Versuche mit Vorsicht interpretiert werden.

Die Wirkung des mütterlichen Alters auf die Nachkommen , die Überlebenszeit wurde auch in anderen wirbellosen Modelle einschließlich der Fruchtfliege Drosophila melanogaster und dem Nematoden Caenorhabditis elegans 39,40 berichtet. Obwohl es zeitraubend in dieser langlebigen Modelle ist, wäre die Synchronisationsprozedur über mehrere Generationen, die für diese Tiere in der Messung der Überlebenszeit experimentellen Schwankungen zu verringern.

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Acknowledgements

Wir danken George Jarvis, Martha Bock und Bette Hecox-Lea, Marine Biological Laboratory, für ihre Hilfe bei der Verfilmung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Wako 190-13921
Magnesium chloride Wako 136-03995
Magnesium sulfate Wako 131-00427
Potassium chloride Wako 168-22111
Calcium chloride Wako 035-00455
Sodium bicarbonate Wako 199-05985
Sodium bromide Wako 190-01515
Membrane filter (0.45 µm pore size) Millipore HAWP04700
Culture plate, 6-well, non-treated Thomas Scientific 6902D01 Flat bottom
Culture plate, 48-well, non-treated Thomas Scientific 6902D07 Flat bottom
Tetraselmis, Living Carolina Biological Supply Company 152610
PRISM 6 GraphPad Software Version 6.0d

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