Measurement of Survival Time in

Biology

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Kaneko, G., Yoshinaga, T., Gribble, K. E., Welch, D. M., Ushio, H. Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54126, doi:10.3791/54126 (2016).

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Abstract

Introduction

Rotíferos são microscópicos cosmopolita zooplâncton (<1 mm), que constituem o filo rotifera 1. Eles têm um plano de corpo simples composto por cerca de 1000 células somáticas, bem como um dispositivo de roda-ciliar como característica chamada coroa, que é usado para locomoção e de alimentação. A maioria dos rotíferos pertencem a classes monogononta ou bdelloidea, que contêm cerca de 1.600 e 500 espécies, respectivamente 2. Rotíferos monogononta geralmente têm duas fases reprodução sexuada e assexuada (partenogênese cíclico), enquanto rotíferos bdelloid reproduzir por partenogênese obrigatória 3. É, assim, possível a obtenção de indivíduos geneticamente idênticos rotíferos, o que assegura uma elevada reprodutibilidade em experiências. Além disso, eles têm várias outras vantagens como organismos modelo, tal como um tempo de vida curto, facilidade de cultura, a disponibilidade de dados de sequências genómicas e transcriptomic 4-7, e uma posição filogenética a partir de uma única distanterthropods 8 e nemátodos. Rotíferos são, portanto, prometendo modelos de invertebrados em ecológica, toxicológicas e envelhecimento estudos 9-12.

O tempo de sobrevivência sob a exposição ao stress ambiental ou produtos químicos é um parâmetro frequentemente medida nestes campos de pesquisa 13-19. No entanto, é preciso ter cuidado quando se mede o tempo de sobrevivência de rotíferos porque é suscetível às condições ambientais de suas mães. Ou seja, no monogononta Manjavacas rotíferos Brachionus, descendentes do sexo feminino a partir de mães com idade têm uma vida útil mais curta do que os de mães jovens; no entanto, a restrição calórica materna (CR) compensa parcialmente os efeitos deletérios da avançada idade materna 20. Em B. plicatilis, CR materno proporciona longevidade prole, o tempo de sobrevivência muito tempo sob fome e de resistência ao estresse oxidativo alta associada com a expressão aumentada de enzimas antioxidantes 21,22. O efeito da idade maternaTambém tem sido observado em rotíferos bdelloid 23. Portanto, as condições de rotíferos experimentais devem ser cuidadosamente sincronizada ao longo de várias gerações antes das medições do tempo de sobrevivência.

Aqui nós fornecemos um protocolo para a medição do tempo de sobrevivência em rotíferos Brachionus seguinte sincronização das condições de cultivo ao longo de várias gerações. Jejum intermitente (IF), uma variação do CR onde rotíferos são alimentados periodicamente, foi aplicado para revelar o efeito de sincronização devido aos efeitos conhecidos de SE na longevidade 22,24.

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Protocol

1. Preparação de Mídia

Nota: Use meio diluída Brujewicz água do mar artificial da salinidade 16,5 ppt (PSU). Outros seawaters artificiais também são frequentemente usados ​​para cultura Brachionus rotíferos 25,26.

  1. Adicionar NaCl a 454 mM, 26 mM de MgCl2, 27 mM de MgSO4, 10 mM de KCl e 10 mM de CaCl 2 a 4,5 L de água destilada (volume final será de 5 L). Em alternativa, usar água de diluição desionizada em vez de água destilada. Adicionar CaCl2 depois de se dissolverem todos os outros sais.
  2. Prepare o M NaHCO solução 0,48 3 estoque (concentração de 200x). Adicionar 25 ml de solução para o acima. A concentração final de NaHCO 3 é de 2,4 mm.
  3. Preparar a solução stock M NaBr 0,4 (concentração 500x). Adicionar 10 ml da solução para o acima. A concentração final de NaBr é de 0,8 mm. Perfaz-se 5 L com água destilada.
  4. Filtra-se a solução com um filtro de membrana de 0,45 um.Diluir duas vezes com água estéril antes da sua utilização (v / v).
    Nota: É possível fazer uma concentração 2x de Brujewicz água do mar artificial como uma solução estoque.

2. Condições Gerais Cultura

  1. laboratório-raise Cultura ou rotíferos selvagens-capturado em um copo de 100 ml estéril entre 20 e 30 ° C. As temperaturas mais elevadas resultam em expectativa de vida mais curtos e reprodução acelerada. Usar 25 ° C para a conveniência dos experimentos. A densidade de rotíferos ou o volume de água do mar artificial não é um grande problema aqui.
  2. Cultura espécies de microalgas alimentares em água do mar artificial 11. Veja Snell et al. (2014) para mais detalhes 11. Tipicamente, usar Tetraselmis tetrathele (~ 2 x 10 5 células / ml) 27,28, T. suecica (~ 6 x 10 5 células / mL), 25,29 e Nannochloropsis oculata (~ 7 X 10 6 células / ml 30,31). Uma vez que dieta algas (espécies, Condit culturaíons, composições bioquímicas) influencia significativamente o tempo de sobrevivência de rotíferos Brachionus, use o mesmo lote de microalga em todos os grupos experimentais.
  3. Manter uma população de ações de rotíferos em uma cultura em lote através da alimentação e mudando media ocasionalmente (por exemplo, alimentar a cada 2 dias e inocular todas as semanas). Muitos recém-nascidos e adultos portadores de 2-3 ovos pode ser observado quando rotíferos estão em condições óptimas.
    Nota: Uma forma alternativa de obter rotíferos experimentais é para chocar ovos de repouso. Rotíferos eclodidos de ovos de repouso são considerados para ser bem sincronizados, e o seu tempo de vida não é significativamente diferente da de rotíferos eclodidos de ovos amictic 11. No entanto, rotíferos de ovos que descansam iniciar a reprodução mais cedo do que os de ovos amictic. Assim, é necessária cautela para medições de suas características reprodutivas.

3. Sincronização de rotíferos pelo Pré-cultura

  1. Selecione um único rotíferos do stpopulação e cultura ock como descrito no 2,1-2,3 para estabelecer uma sub-população que vai ser utilizado para experiências. Normalmente cultura durante duas semanas.
  2. Recolha rotíferos portadores de ovos da sub-população (a cobrar o dobro do número de indivíduos que serão utilizados para o experimento). Cultura-los como uma única coorte (densidade: ~ 50 indivíduos / mL) em uma placa de cultura de 6 poços, como descrito no 2,1-2,3 no estado fresco de comunicação sob alimentação ad libitum. Controlando a densidade de população é importante porque o meio condicionado afecta a fisiologia reprodutiva de rotíferos Brachionus 32,33.
  3. Transferir recém-nascidos nascidos de primeiros ovos dos adultos para meios de cultura recém-preparado. Repita este procedimento ao longo de 2-3 gerações.
  4. Use neonatos nascidos dentro de um determinado período de tempo (por exemplo, <3 h) para medir o tempo de sobrevivência. Para evitar um possível viés na seleção do único indivíduo, embora muito improvável, verificar a reprodutibilidade usando vários independentes sub-populações.
    Nota: Como rotíferos normalmente se reproduzem assexuadamente sob esta condição, garantir que não haja homens estão presentes durante todo o experimento. Os machos são menores do que recém-nascidos e, normalmente, se mover mais rápido do que as fêmeas. Fêmeas Mictic têm diferentes tempos de vida das fêmeas amictic sob certas condições 29.

4. Medições de Tempo de Sobrevivência

  1. neonatos lugar em placas de plástico (tipicamente de 24 ou 48 poços placas, com cada uma das cavidades contendo 1 ml de água do mar artificial).
  2. Em intervalos de 24 horas, transferir os rotíferos aos meios de cultura recém-preparados ou em intervalos de 12 horas, se a temperatura mais elevada (acima de 30 ° C ou). Grave o número de filhos e se cada indivíduo está vivo ou morto. Grave o rotíferos como morto quando o movimento dos cílios da corona parou completamente.
    Nota: Rotíferos muitas vezes atribuem às paredes laterais das cavidades. pipetagem suave da água ajuda a encontrá-los. Se rotíferos não são encontrados ou are acidentalmente danificado pelo pipetagem, gravá-las como "censurado", não como "morto".
  3. Remover neonatos quando rotíferos experimentais estão reproduzindo ativamente. Os recém-nascidos crescem rapidamente e às vezes é difícil distingui-los dos rotíferos experimentais.

Análise 5. Os dados

  1. Criar a curva de sobrevivência de Kaplan-Meier (Figuras 1 e 2) através da representação gráfica taxa de sobrevivência cumulativa no eixo Y e o tempo no eixo x. Esta é a representação mais comum de dados de sobrevivência. Use o teste de log-rank não paramétrico (também chamado de teste de Mantel-Cox) para comparação estatística de tempo de sobrevivência 34. O teste de log-rank também está incluído em outros pacotes estatísticos padrão, tais como JMP e R.
    Nota: Não use t-teste ou análise de variância (ANOVA), seguido de comparação múltipla paramétrico Student porque distribuição normal geralmente não é encontrado por dados de sobrevivência 35. Além disso, estes metods não levam indivíduos censurado em conta. Mann-Whitney U Test pode ser usada se não houver dados censurados.

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Representative Results


A Figura 1 mostra as curvas de sobrevida representativas de populações mal sincronizados (de duas repetições). Neste experimento, os rotíferos ou eram todos os dias Fed [ad libitum grupo (AL)] ou em dias alternados (IF grupo). A sobrevida média foi de 13 e 18 dias na AL e se os grupos, respectivamente. Embora seja bem sabido que se estende a vida útil do rotíferos, esta experiência não conseguiu detectar uma diferença estatisticamente significativa entre a expectativa de vida da AL e se os grupos. Empiricamente, a insuficiência de resultados de sincronização na mortalidade precoce e quedas graduais na taxa de sobrevivência como observado neste experimento. Danos ao rotíferos causadas pelo tratamento inadequado ou de baixa qualidade da água para a sub-população tende a produzir resultados semelhantes.

Quando as condições de rotíferos são óptimas e bem sincronizados, mortalidade precoce é pouco observada e accordingly rotíferos tendem a morrer de forma sincronizada durante a fase posterior do experimento (Figura 2). A sobrevida média foi de 13 e 20 dias na AL e se os grupos, respectivamente. Embora menos animais foram usadas do que o experimento na Figura 1, a diferença no tempo de vida para os dois grupos foi estatisticamente significativa. Este é o resultado representativos de mais de cinco experimentos que foram publicados anteriormente 22.

figura 1
Figura 1:. Curvas de Kaplan-Meier para indivíduos mal sincronizados submetidos a jejum intermitente (IF) O grupo AL foi alimentado ad libitum durante todo o experimento, enquanto o grupo SE foi alimentado todos os dias. N = 11 e N = 12 para o AL e se os grupos, respectivamente (N refere-se ao número de indivíduo utilizado na experiência). O experimento foi PerforMed, a 25 ° C. Não houve diferença significativa no tempo de vida quando o teste log-rank foi utilizado (P = 0,1207). No entanto, estes dados são difíceis de interpretar porque teste de log-rank não deve ser utilizado para comparar duas curvas de sobrevivência de passagem, embora o teste é conhecido por ser robusta 36. Não há métodos estabelecidos estão atualmente disponíveis para atravessar curvas de sobrevida com dados censurados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2:. As curvas de Kaplan-Meier para os indivíduos submetidos a sincronizados SE A coorte de rotíferos, obtido por pré-cultura, foi submetida ao mesmo Se o Schedule (alimentadas a cada dois dias). N = 6 e N = 8 para AL e SE grupos, respectivamente. A experiência foi realizada a 25 ° C. Registro-teste de classificação, P = 0,0057. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O actual protocolo descreve um método para medir o tempo de sobrevivência em rotíferos Brachionus. O passo crítico é a sincronização das condições de rotíferos ao longo de várias gerações. Quando rotíferos experimentais são bem sincronizados, um tipo de curva típica I sobrevivência é observada com muito pouco mortalidade precoce como relatado em vários estudos anteriores 18,24,37,38. desvios-padrão de seu tempo de sobrevivência, portanto, tornam-se menores em comparação com rotíferos sincronizados mal, resultando em alto poder estatístico. A sincronização também é esperado um aumento reprodutibilidade das medições de tempo de sobrevivência - porque as mães são cultivadas sob condições ideais, o protocolo atual compensa possíveis efeitos deletérios das gerações maternas. Se a mortalidade precoce ainda é observado após a sincronização cuidadosa, considerar o uso de meios de cultura recém-preparado, outro lote de algas alimentação, ou um grupo experimental recém-estabelecida (ou seja,começar a partir de protocolo 3.1).

Uma limitação deste protocolo é que os rotíferos bem sincronizados são potencialmente mais sensível. Por exemplo, ao rastreio de substâncias químicas que se estendem a vida útil, alguns produtos químicos selecionados por este protocolo pode falhar na detecção de efeitos significativos na expectativa de vida de rotíferos mal sincronizados (por exemplo, indivíduos de populações selvagens e de lote-cultivadas). Assim, os resultados desses experimentos devem ser interpretados com cautela.

O efeito da idade materna no tempo sobrevivência da prole também foi relatado em outros modelos de invertebrados, incluindo a mosca da fruta Drosophila melanogaster e o nematóide Caenorhabditis elegans 39,40. Embora seja mais nestes modelos de vida longa demorado, o procedimento de sincronização ao longo de várias gerações seria útil para estes animais para diminuir a variações experimentais na medição do tempo de sobrevivência.

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Acknowledgements

Somos gratos a George Jarvis, Martha Bock, e Bette Hecox-Lea, Laboratório de Biologia Marinha, por sua ajuda na filmagem.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Wako 190-13921
Magnesium chloride Wako 136-03995
Magnesium sulfate Wako 131-00427
Potassium chloride Wako 168-22111
Calcium chloride Wako 035-00455
Sodium bicarbonate Wako 199-05985
Sodium bromide Wako 190-01515
Membrane filter (0.45 µm pore size) Millipore HAWP04700
Culture plate, 6-well, non-treated Thomas Scientific 6902D01 Flat bottom
Culture plate, 48-well, non-treated Thomas Scientific 6902D07 Flat bottom
Tetraselmis, Living Carolina Biological Supply Company 152610
PRISM 6 GraphPad Software Version 6.0d

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