Mätning av levnadstid i

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kaneko, G., Yoshinaga, T., Gribble, K. E., Welch, D. M., Ushio, H. Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54126, doi:10.3791/54126 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Hjuldjur är mikroskopiska kosmopolitiska djurplankton (<1 mm) som utgör stammen hjuldjur 1. De har en enkel plan organ bestående av ca 1000 somatiska celler såväl som en karakteristisk hjuUiknande flimmerapparaten kallas koronan, som används för transport och utfodring. De flesta hjuldjur tillhör klasserna monogononta eller bdelloider, som innehåller cirka 1600 och 500 arter, respektive 2. Monogononta hjuldjur har i allmänhet både sexuella och asexuella reproduktionsfaser (cyklisk partenogenes), medan bdelloid hjuldjur förökar sig genom obligatorisk partenogenes 3. Det är således möjligt att erhålla genetiskt identiska hjuldjur individer, vilket säkerställer hög reproducerbarhet i experiment. Dessutom har de flera andra fördelar som modellorganismer, såsom en kort livslängd, enkel kultur, tillgång till iska och transcriptomic sekvensdata 4-7, och en unik fylogenetisk läge på avstånd från enrthropods och nematoder 8. Hjuldjur är därför lovande ryggradslösa modeller i ekologisk, toxikologisk och åldrande studier 9-12.

Överlevnadstiden i exponering för stress eller kemikalier är en ofta mätt parameter i dessa forskningsområden 13-19. Det krävs dock försiktighet vid mätning av överlevnadstiden för hjuldjur eftersom den är känslig för miljöförhållanden sina mödrar. Nämligen i monogononta rotifer Brachionus manjavacas, kvinnlig avkomma från äldre mödrar har en kortare livslängd än de från unga mödrar; Men moderns kalorirestriktion (CR) delvis kompenserar de skadliga effekterna av avancerad moderns ålder 20. I B. plicatilis ger moderns CR avkomma livslängd, lång överlevnadstid i svält och hög oxidativ stress motstånd i samband med ökad expression av antioxidativa enzymer 21,22. Moderns ålder effekthar också observerats i bdelloid rotatorier 23. Därför bör villkoren för försökshjuldjur noggrant synkroniseras över flera generationer innan mätningar av överlevnadstiden.

Här ger vi ett protokoll för mätning av överlevnadstiden i Brachionus hjuldjur efter synkronisering av odlingsbetingelser under flera generationer. Intermittent fasta (IF), en variant av CR där hjuldjur matas med jämna mellanrum, applicerades för att avslöja effekten av synkronisering på grund av de välkända effekterna av IF på livslängd 22,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av media

Obs: Använd halv-utspädd Brujewicz artificiellt havsvatten salthalt 16,5 ppt (PSU). Andra konstgjorda havsvatten används också ofta till kultur Brachionus rotiferer 25,26.

  1. Lägg 454 mM NaCl, 26 mM MgCl2, 27 mM MgSO 4, 10 mM KCl och 10 mM CaCla 2-4,5 L destillerat vatten (slutvolym kommer att vara 5 L). Alternativt använder avjoniserat utspädningsvatten i stället för destillerat vatten. Lägg CaCl2 efter upplösning alla andra salter.
  2. Förbered 0,48 M NaHCOs tre stamlösning (200x koncentration). Tillsätt 25 ml av det till ovanstående lösning. Den slutliga koncentrationen av NaHCOs 3 är 2,4 mM.
  3. Förbered 0,4 M NaBr stamlösning (500x koncentration). Tillsätt 10 ml det till ovanstående lösning. Den slutliga koncentrationen av NaBr är 0,8 mM. Fyll upp till fem L med destillerat vatten.
  4. Filtrera lösningen med ett 0,45 | im membranfilter.Späda ut det två gånger med sterilt vatten före användning (volym / volym).
    Obs: Det är möjligt att göra en 2x koncentration av Brujewicz artificiellt havsvatten som en stamlösning.

2. Allmänna odlingsbetingelser

  1. Odlingslaboratorium-upphöjda eller vilda-fångas hjuldjur i en steril 100 ml bägare mellan 20 och 30 ° C. Högre temperaturer resulterar i kortare livslängd och snabbare reproduktion. Använd 25 ° C för att underlätta för experiment. Den rotifer täthet eller volym av artificiellt havsvatten är inte en stor fråga här.
  2. Kultur kostmikroalger arter i artificiellt havsvatten 11. Se Snell et al. (2014) för mer information 11. Normalt använder Tetraselmis tetrathele (~ 2 x 10 5 celler / ml 27,28), T. Suecica (~ 6 x 10 5 celler / ml 25,29), och Nannochloropsis oculata (~ 7 x 10 6 celler / ml 30,31). Eftersom diet alger (art, kultur conditjoner, biokemiska sammansättningar) påverkar signifikant överlevnadstiden för Brachionus hjuldjur, använder samma massa mikroalg i alla experimentella grupper.
  3. Håll ett lager population av hjuldjur i en satsvis odling genom att mata och föränderliga medie ibland (t.ex. mata varje 2 dagar och ympa varje vecka). Många nyfödda och vuxna som bär 2-3 ägg kan observeras när hjuldjur är under optimala förhållanden.
    Obs: Ett alternativt sätt att få experimentella hjuldjur är att kläckas vila ägg. Hjuldjur kläckts från vila ägg anses vara väl synkroniserad, och deras livslängd är inte signifikant skiljer sig från hjuldjur kläckts från amictic ägg 11. Men hjuldjur från vila ägg börjar reproduktion tidigare än de från amictic ägg. Således behövs försiktighet för mätning av deras reproduktiva egenskaper.

3. Synkronisering av Rotifers av Pre-kultur

  1. Välj en enda hjuldjur från stock befolkning och kultur som beskrivs i 2,1 till 2,3 för att etablera en sub-population som kommer att användas för experiment. Typiskt kultur i två veckor.
  2. Samla ägg bärande hjuldjur från delpopulation (samla en dubbel antal personer som kommer att användas för experiment). Kultur dem som en enda kohort (densitet: ~ 50 personer / ml) i en 6-brunnsodlingsplatta som beskrivs i 2,1-2,3 i en färsk media under ad lib utfodring. Styra befolkningstätheten är viktigt eftersom det konditionerade mediet påverkar reproduktiv fysiologi Brachionus hjuldjur 32,33.
  3. Överföra nyfödda kläckts ur de vuxnas första ägg till nyligen beredd odlingsmedier. Upprepa denna procedur under 2-3 generationer.
  4. Använda nyfödda kläckta inom en viss tidsperiod (t.ex., <3 h) för mätning av överlevnadstiden. För att undvika en eventuell snedvridning i val den enskilde individen, även om mycket osannolikt, kontrollera reproducerbarhet med hjälp av flera indeständiga delpopulationer.
    Obs: Som hjuldjur vanligtvis reproducera endast asexuellt under detta förhållande, garantera att inga män är närvarande under hela experimentet. Män är mindre än nyfödda och typiskt gå snabbare än honorna. Mictic kvinnor har olika livslängd från amictic honor under vissa villkor 29.

4. Mätningar av Survival Time

  1. Placera nyfödda i plastplattor (typiskt 24- eller 48-brunnsplattor, där varje brunn innehåller 1 ml artificiellt havsvatten).
  2. Vid 24 h intervall, överföra hjuldjuren till nyligen framställda odlingsmedier eller på 12 timmars intervall om vid högre temperatur (30 ° C eller däröver). Registrera antalet avkommor och om varje individ är död eller levande. Anteckna hjuldjur som dött när cilier rörelse koronan har stannat helt.
    Notera: Hjuldjur kopplar ofta till sidoväggarna av brunnarna. Försiktig pipettering av vattnet hjälper till att hitta dem. Om hjuldjur inte hittas eller are misstag skadas av pipettering, spela in dem som "censurerade", inte som "död".
  3. Ta nyfödda när experimentella hjuldjur aktivt reproducera. Nyfödda växa snabbt och det är ibland svårt att skilja dem från experimentella hjuldjur.

5. Dataanalys

  1. Skapa överlevnadskurvan Kaplan-Meier (figur 1 och 2) genom att avsätta kumulativ överlevnad på Y-axeln och tid på x-axeln. Detta är den vanligaste representation av överlevnadsdata. Använd icke-parametrisk log-rank test (även kallad Mantel-Cox-test) för statistisk jämförelse av överlevnadstiden 34. Log-rank test ingår också i andra statistiska standard paket såsom JMP och R.
    Obs: Använd inte t-test eller variansanalys (ANOVA) följt av parametrisk multipeljämförelse eftersom normalfördelning är oftast inte uppfylls av överlevnadsdata 35. Även dessa metods tar inte Censored individer med i beräkningen. Mann-Whitney U-test kan användas om det inte finns någon censurerade data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results


Figur 1 visar representativa överlevnadskurvorna av dåligt synkroniserade populationer (av två replikat). I detta experiment, hjuldjur var antingen utfodras varje dag [ad libitum (AL) grupp] eller varannan dag (IF grupp). Medianöverlevnaden var 13 och 18 dagar i AL och IF grupper, respektive. Även om det är välkänt att IF förlänger livslängden på hjuldjur, detta experiment misslyckades att detektera en statistiskt signifikant skillnad mellan livstider på den AL och IF grupper. Empiriskt otillräckliga synkroniseringsresulterar i tidig dödlighet och gradvisa nedgång i överlevnad som observerats i detta experiment. Skador på hjuldjur som orsakas av olämplig behandling eller låg vattenkvalitet för delpopulation tenderar att ge liknande resultat.

När hjuldjur förhållandena är optimala och väl synkroniserade, är tidig dödlighet knappast observeras och accordingly hjuldjur tenderar att dö på ett synkroniserat sätt under den senare fasen av experimentet (Figur 2). Medianöverlevnaden var 13 och 20 dagar i AL och IF grupper, respektive. Fastän färre djur användes än experimentet i figur 1, var skillnaden i livslängd mellan dessa grupper statistiskt signifikant. Detta är de representativa resultat från mer än fem experiment som tidigare 22 har publicerats.

Figur 1
Figur 1:. Kaplan-Meier kurvor för dåligt synkroniserade personer utsätts för intermittent fasta (IF) AL-grupp matades ad libitum under hela försöket, medan IF gruppen matades varannan dag. N = 11 och N = 12 för AL och IF grupper, respektive (N avser antal enskilda användes i experimentet). Experimentet utför litenMed vid 25 ° C. Ingen signifikant skillnad i livslängd upptäcktes när log-rank-testet användes (P = 0,1207). Emellertid är dessa data svåra att tolka på grund log-rank test inte bör användas för att jämföra två korsningsöverlevnadskurvor även om testet är känt för att vara robust 36. Inga etablerade metoder är för närvarande tillgängliga för att passera överlevnadskurvorna med censurerade data. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2:. Kaplan-Meier kurvor för synkroniserade personer utsätts för om rotifer kohorten, som erhållits genom förodling, utsattes för samma IF schema (matas varannan dag). N = 6 och N = 8 för AL och IF grupper, respektive. Experimentet utfördes vid 25 ° C. Logga-rank test, P = 0,0057. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det nuvarande protokollet beskriver en metod för mätning av överlevnadstiden i Brachionus hjuldjur. Det kritiska steget är synkronisering av hjuldjur förhållanden under flera generationer. Om undersökningshjuldjur är väl synkroniserade, är en typisk typ I överlevnadskurva observerades med mycket lite tidig mortalitet som rapporterats i flera tidigare studier 18,24,37,38. Standardavvikelser för deras överlevnadstiden blir därför mindre jämfört med dåligt synkroniserade hjuldjur, vilket resulterar i hög statistisk styrka. Synkronisering väntas också öka reproducerbarhet överlevnadstiden mätningar - eftersom mödrar odlas under optimala förhållanden, kompenserar det nuvarande protokollet eventuella skadliga effekterna av moderns generationer. Om tidig dödlighet är fortfarande observeras efter noggrann synkronisering, överväga att använda nyligen beredd odlingsmedier, ett annat parti mata alger, eller ett nyetablerat experimentell kohort (dvs.börja från protokoll 3,1).

En begränsning av detta protokoll är att de väl synkroniserade hjuldjur är potentiellt överkänsligt. Till exempel, vid screening av kemikalier som sträcker sig livslängd, kan vissa kemikalier som kontrolleras av detta protokoll inte upptäcker betydande effekter på livslängd av dåligt synkroniserade hjuldjur (t.ex. personer från vilda och batch-odlade populationer). Sålunda bör resultaten av sådana experiment tolkas med försiktighet.

Effekten av moderns ålder på avkomma överlevnadstiden har också rapporterats i andra ryggradslösa modeller inklusive bananflugan Drosophila melanogaster och nematoden Caenorhabditis elegans 39,40. Även om det är mer tidskrävande i dessa långlivade modeller skulle synkroniseringsproceduren över flera generationer vara användbara för dessa djur för att minska experimentella variationer vid mätning av överlevnadstiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Vi är tacksamma till George Jarvis, Martha Bock, och Bette Hecox-Lea, marinbiologiska laboratorium, för deras hjälp i inspelningen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Wako 190-13921
Magnesium chloride Wako 136-03995
Magnesium sulfate Wako 131-00427
Potassium chloride Wako 168-22111
Calcium chloride Wako 035-00455
Sodium bicarbonate Wako 199-05985
Sodium bromide Wako 190-01515
Membrane filter (0.45 µm pore size) Millipore HAWP04700
Culture plate, 6-well, non-treated Thomas Scientific 6902D01 Flat bottom
Culture plate, 48-well, non-treated Thomas Scientific 6902D07 Flat bottom
Tetraselmis, Living Carolina Biological Supply Company 152610
PRISM 6 GraphPad Software Version 6.0d

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallace, R. L., Snell, T. W., Ricci, C., Nogrady, T. Rotifera Vol.1: Biology, ecology and systematics. 2nd edn, SPB Academic Publishing. (2006).
  2. Segers, H. Annotated checklist of the rotifers (Phylum Rotifera), with notes on nomenclature, taxonomy and distribution. Magnolia Press. Auckland. (2007).
  3. Mark Welch, D. B., Meselson, M. Evidence for the evolution of bdelloid rotifers without sexual reproduction or genetic exchange. Science. 288, (5469), 1211-1215 (2000).
  4. Suga, K., Mark Welch, D., Tanaka, Y., Sakakura, Y., Hagiwara, A. Analysis of expressed sequence tags of the cyclically parthenogenetic rotifer Brachionus plicatilis. PLoS ONE. 2, e671 (2007).
  5. Denekamp, N. Y., et al. Discovering genes associated with dormancy in the monogonont rotifer Brachionus plicatilis. BMC Genomics. 10, 108 (2009).
  6. Lee, J. -S., et al. Sequence analysis of genomic DNA (680 Mb) by GS-FLX-Titanium sequencer in the monogonont rotifer, Brachionus ibericus. Hydrobiologia. 662, (1), 65-75 (2010).
  7. Flot, J. -F., et al. Genomic evidence for ameiotic evolution in the bdelloid rotifer Adineta vaga. Nature. 500, (7463), 453-457 (2013).
  8. Dunn, C. W., et al. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life. Nature. 452, (7188), 745-749 (2008).
  9. Yoshinaga, T., Kaneko, G., Kinoshita, S., Tsukamoto, K., Watabe, S. The molecular mechanisms of life history alterations in a rotifer: a novel approach in population dynamics. Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 136, (4), 715-722 (2003).
  10. Dahms, H. -U., Hagiwara, A., Lee, J. -S. Ecotoxicology, ecophysiology, and mechanistic studies with rotifers. Aquat. Toxicol. 101, (1), 1-12 (2011).
  11. Snell, T. W. Rotifers as models for the biology of aging. Int. Rev. Hydrobiol. 99, (1-2), 84-95 (2014).
  12. Snell, T. W., Johnston, R. K., Gribble, K. E., Mark Welch, D. B. Rotifers as experimental tools for investigating aging. Invertebr. Reprod. Dev. 59, Suppl 1. 5-10 (2015).
  13. Kaneko, G., et al. Molecular characterization of Mn-superoxide dismutase and gene expression studies in dietary restricted Brachionus plicatilis rotifers. Hydrobiologia. 546, 117-123 (2005).
  14. Yoshinaga, T., et al. Insulin-like growth factor signaling pathway involved in regulating longevity of rotifers. Hydrobiologia. 546, 347-352 (2005).
  15. Ozaki, Y., Kaneko, G., Yanagawa, Y., Watabe, S. Calorie restriction in the rotifer Brachionus plicatilis enhances hypoxia tolerance in association with the increased mRNA levels of glycolytic enzymes. Hydrobiologia. 649, (1), 267-277 (2010).
  16. Kailasam, M., et al. Effects of calorie restriction on the expression of manganese superoxide dismutase and catalase under oxidative stress conditions in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 77, (3), 403-409 (2011).
  17. Garcìa-Garcìa, G., Sarma, S., Núñez-Orti, A. R., Nandini, S. Effects of the mixture of two endocrine disruptors (ethinylestradiol and levonorgestrel) on selected ecological endpoints of Anuraeopsis fissa and Brachionus calyciflorus (Rotifera). Int. Rev. Hydrobiol. 99, (1-2), 166-172 (2014).
  18. Yang, J., Mu, Y., Dong, S., Jiang, Q., Yang, J. Changes in the expression of four heat shock proteins during the aging process in Brachionus calyciflorus (rotifera). Cell Stress Chaperones. 19, (1), 33-52 (2014).
  19. Han, J., et al. Sublethal gamma irradiation affects reproductive impairment and elevates antioxidant enzyme and DNA repair activities in the monogonont rotifer Brachionus koreanus. Aquat. Toxicol. 155, 101-109 (2014).
  20. Gribble, K. E., Jarvis, G., Bock, M., Mark Welch, D. B. Maternal caloric restriction partially rescues the deleterious effects of advanced maternal age on offspring. Aging Cell. 13, (4), 623-630 (2014).
  21. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the survival of offspring in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 67, (2), 373-374 (2001).
  22. Kaneko, G., et al. Calorie restriction-induced maternal longevity is transmitted to their daughters in a rotifer. Funct. Ecol. 25, (1), 209-216 (2011).
  23. Lansing, A. I. A transmissible, cumulative, and reversible factor in aging. J. Gerontol. 2, (3), 228-239 (1947).
  24. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the life history of Brachionus plicatilis O. F. Müller (Rotifera): a possible strategy for population stability. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 253, (2), 253-260 (2000).
  25. Gribble, K. E., Kaido, O., Jarvis, G., Mark Welch, D. B. Patterns of intraspecific variability in the response to caloric restriction. Exp. Gerontol. 51, 28-37 (2014).
  26. Snell, T. W., Johnston, R. K. Glycerol extends lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera) and protects against stressors. Exp. Gerontol. 57, 47-56 (2014).
  27. Kim, H. -J., Hagiwara, A. Effect of female aging on the morphology and hatchability of resting eggs in the rotifer Brachionus plicatilis Müller. Hydrobiologia. 662, (1), 107-111 (2011).
  28. Kim, H. -J., et al. Light-dependent transcriptional events during resting egg hatching of the rotifer Brachionus manjavacas. Mar. Genomics. 20, 25-31 (2015).
  29. Gribble, K. E., Welch, D. B. M. Life-span extension by caloric restriction is determined by type and level of food reduction and by reproductive mode in Brachionus manjavacas (Rotifera). J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68, (4), 349-358 (2013).
  30. Kaneko, G., Kinoshita, S., Yoshinaga, T., Tsukamoto, K., Watabe, S. Changes in expression patterns of stress protein genes during population growth of the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 68, (6), 1317-1323 (2002).
  31. Kim, H. J., Sawada, C., Hagiwara, A. Behavior and reproduction of the rotifer Brachionus plicatilis species complex under different light wavelengths and intensities. Int. Rev. Hydrobiol. 99, (1-2), 151-156 (2014).
  32. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of conditioned media on the asexual reproduction of the monogonont rotifer Brachionus plicatilis O. F. Müller. Hydrobiologia. 412, 103-110 (1999).
  33. Ohmori, F., Kaneko, G., Saito, T., Watabe, S. A novel growth-promoting protein in the conditioned media from the rotifer Brachionus plicatilis at an early exponential growth phase. Hydrobiologia. 667, (1), 101-117 (2011).
  34. GraphPad Statistics Guide. Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/statistics/ (2015).
  35. Collet, D. Modelling Survival Data in Medical Research. 2nd edn, Chapman & Hall/CRC. 151-193 (1993).
  36. Bouliotis, G., Billingham, L. Crossing survival curves: alternatives to the log-rank test. Trials. 12, Suppl 1. A137 (2011).
  37. Yang, J., et al. Changes in expression of manganese superoxide dismutase, copper and zinc superoxide dismutase and catalase in Brachionus calyciflorus during the aging process. PloS ONE. 8, (2), e57186 (2013).
  38. Snell, T. W., Johnston, R. K., Rabeneck, B., Zipperer, C., Teat, S. Joint inhibition of TOR and JNK pathways interacts to extend the lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera). Exp. Gerontol. 52, 55-69 (2014).
  39. Klass, M. R. Aging in nematode Caenorhabditis-elegans - major biological and environmental-factors influencing life-span. Mech. Ageing Dev. 6, (6), 413-429 (1977).
  40. Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. L. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56, (5), 927-935 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics