一个表型养生为用于研究衰老的人类疾病基因牵连转基因小鼠

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Patterson, V. L., Thompson, B. S., Cherry, C., Wang, S. b., Chen, B., Hoh, J. A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging. J. Vis. Exp. (113), e54136, doi:10.3791/54136 (2016).

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Abstract

Introduction

年龄相关的疾病正在成为现代社会越来越普遍。随着医疗科学的进步和平均寿命的延长,人口不断老化和这些疾病负担的增加。有效的治疗是必要的,以减轻衰弱的状况的影响,但在许多情况下,仍然难以实现。只有了解的原因和与衰老相关的疾病病理上的科学家开始识别潜在的治疗目标和制定战略的干预。常见年龄相关病症包括神经变性疾病如帕金森氏病(PD)和年龄相关性黄斑变性(AMD)。 PD为在人类中引起的神经变性的最普遍的运动障碍。多数PD患者表现出症状,如后5​​0岁静止性震颤,运动迟缓和刚度。早发性也已病例的约10%观察到。

AMD是失明的主要原因老年人,逐渐损害感光体,并在眼睛的视网膜色素上皮细胞(RPE)。中央视力受损,但周边视力一般不受影响。有两种形式AMD的。在“干”的形式,被称为RPE和Bruch膜(BM)之间的玻璃膜疣形式外蛋白沉积,导致地理萎缩和中央视力模糊。更严重的“湿”的形式从新生血管形成的结果,从对面的BM脉络膜入RPE和光感受器层,并可能导致hamorrhaging导致视网膜组织永久损坏视网膜下方。全基因组关联研究先前已经确定了与增加的易感性相关的这种疾病,并确定感兴趣的两个区域的位点:1号染色体上和10q26基因座,其中,与年龄相关的黄斑病的易感性2(ARMS2)和补体因子H(CFH)高温需求因素A1(HTRA1)基因位于1-5 3-6的湿或干的形式被优先相关联。

CFH作为通过抑制C3的激活补体系统的替代途径(AP)的负调节物。单核苷酸多态性(SNP)已被链接到的AMD的增加的风险,导致外显子9与组氨酸酪氨酸402的交换,由于为T到C的取代1。在AMD据信该AP是由于CFH功能丧失,但是否与SNP起因果作用尚不清楚misregulated。一种假设是,带正电荷的组氨酸被认为是否定CFH结合至相互作用的蛋白质的C-反应蛋白和硫酸肝素1,7的能力。 CFH Y402H的体外研究提供相互矛盾的结果在变体之间的功能差异,并在体内工作<EM> CFH - / -表达人源化的CFH正在进行8只小鼠。 ARMS2位于灵长类基因组HTRA1的上游,尽管基因在小鼠中不存在。 HTRA1是丝氨酸蛋白酶,但ARMS2的特征较差。在AMD相关基因座的SNP之间的连锁不平衡使得难以确定在这个区域中的基因的单个突变的风险的贡献,但最近的工作已表明,它是HTRA1的过表达,而不是ARMS2,导致新血管形成和视网膜下蛋白沉积物9-11。然而,在该基因座的基因的紧密接近可允许不能使用随机插入转基因进行研究的相互作用。

除了AMD,丝氨酸蛋白酶将hTRA家族已经与许多人类疾病有关。所有将hTRA蛋白含有丝氨酸蛋白酶结构域,随后被至少一个C末端PDZ结构域。 HTRA1,HtrA3和HtrA4共享GReatest同源性,包括一个信号肽,胰岛素样生长因子结合结构域,Kazal蛋白酶抑制剂域,丝氨酸蛋白酶结构域和PDZ结构域的。 HtrA2的具有不同的N-末端,线粒体定位序列,跨膜结构域的组成和凋亡抑制结合结构域,随后通过蛋白酶和PDZ结构域12-16。哺乳动物HTRA1由底物诱导重构在其蛋白酶结构域17-20的活性位点调节,HtrA2的也可通过丝氨酸蛋白酶和PDZ结构域,抑制蛋白酶活性21之间的交互调制。有趣的是,PDZ结构域不会出现类似赋予调控HtrA3 16。将hTRA蛋白酶也可以由外在因素调节:它最近证实存在HTRA1之间调节相互作用和protoporphyrins 22和HtrA2的可通过磷酸化后的p38MAP激酶的激活来调节通路在一个PINK1依赖性23。将hTRA家族在小鼠的个别成员的缺失已经被记录在案,但机械效应大多不清楚部分是由于缺乏明显的表型。

HTRA1在蛋白质的质量控制的一个重要的功能和它的错误调节或突变已经与许多不同的人类疾病,包括关节炎,癌症和AMD 3,4,24-32的风险增加相关联。在神经组织HtrA2的功能的丧失已在人类和小鼠的PD表型相关联,而其从非神经组织的结果在加速损失老化33-37。 HtrA3失调已经与疾病,包括先兆子痫和某些类型的癌症38,39相关联。上调HtrA4已子痫前期患者,但敲除小鼠的胎盘被观察到不显示明显的表型40,41。在一些基因敲除小鼠中观察到的缺乏表型的已假定为的将hTRA家族成员之间的补偿的结果:它被认为是既HtrA4和HTRA1与TGF-β家族蛋白的相互作用,在HtrA4 41的缺失允许补偿由HTRA1。同样地,它被认为是由于HTRA1和HtrA3具有高度域同源性的,他们可能具有互补功能42。然而,已经提出,将hTRA蛋白可以具有部分拮抗作用,竞争来调节公共目标43。

为了进一步研究这些风险因素生成3人性化敲入鼠标线。在CFH TM1(CFH * 9)jhohCFH TM2(CFH * 9)jhoh,所述CFH基因的外显子9被替换为人类同源物的外显子9。CFH TM1(CFH * 9)jhoh编码非疾病相关的酪氨酸残基402位置,而CFH TM2(CFH * 9)jhoh携带Y402H,风险相关的SNP。在ARMS2 tm1jhoh人类ARMS2序列靶向HTRA1的上游的区域。放置在基因序列,但包括UBIC启动子的下游的上游A loxP的侧翼STOP序列通过杂交到OzCre小鼠,这表示ROSA26启动子的控制下Cre重组酶,如前所述34切除。除了 ​​这些敲入线,生成对CFHHTRA1(CFH tm1jhohHTRA1 tm1jhoh),以及其他已知的将hTRA家族成员条件性敲除等位基因:HtrA2的 (HtrA2的tm1jhoh),HtrA3(HtrA3 tm1jhoh)HtrA4( HtrA4 tm1jhoh)。外显子3,HTRA1;种系击倒了通过杂交OzCre小鼠动物改造以侧翼与loxP位点,使得缺失导致活性域(CFH的移码和/或缺失特定外显子的外显子在2-3,HtrA2的 :外显子2-4,HtrA3;外显子3,HtrA4;外显子4-6)34,41。 HtrA2的的神经缺失,使用下的巢蛋白启动子控制Cre重组酶删除(HtrA2的FLOX;的Tg(NES-CRE)1Kln / J),也被描述34。唯一欠缺的HtrA2的小鼠,无论是全身或神经组织,清晰的显示表型,与帕金森表型呈现。

由于一些感兴趣的这些基因都假定被定位于线粒体11,44-47,和产生HtrA2的缺失帕金森表型,具有线粒体和神经焦点的表型方案在此描述并提供从感兴趣的试验的代表性结果。为了检查产生的彻底调查人,年龄相关的疾病,系统建立的初始表型时间表遗传工程小鼠,由一系列的相关的两个主要的测试感兴趣的疾病:AMD和帕金森氏。

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Protocol

伦理学声明:涉及动物的研究均符合的指南在耶鲁大学护理和实验动物使用和动物管理和使用委员会(IACUC)的健康建议全国学院进行。

1.转基因小鼠的行为测试

注意:所有的小鼠应经受相同的测试方案,以习惯的差异限制为处理。测试应该在一天中的各个时间的同时进行。

  1. 新生儿后肢测试
    注:后肢测试是从出生后一天(P)4每天进行,以P10评价近端后肢肌肉力量,虚弱和疲劳。
    1. 交通运输小鼠试验区,并允许休息测试前30分钟。
    2. 通过清洗的50ml锥形管中,用70%的乙醇,推两(P4-P8)或一(P9-P10)棉球,将n的底部准备测试装置UBE并固定在垂直位置。
    3. 取下笼和记录重量的一种小狗。保持小狗在隔热垫保持托盘,只要不是测试。
    4. 轻轻暂停新生儿的后肢在锥形管的边,使得其朝下朝向棉球。伯爵制作拉尝试和措施延迟的数量用秒表下降。
    5. 重复一次,然后用标签标记的小狗。随后,由脚趾剪裁识别P6幼崽。轻轻用的床上用品从家里笼更换前擦幼仔。
    6. 擦拭用70%乙醇锥形管中。
    7. 重复测试旁边的小狗,直到整个垃圾已通过测试。
    8. 处置棉花球和锥形管。所有设备在70%乙醇。
  2. 刚断奶的试验观察
    注:断奶观测试验是由P19每天给予P21得分运动和一般的活动水平。
    1. 交通运输小鼠试验区ND允许休息测试前30分钟。
    2. 制备通过用70%乙醇清洗标明的基础上的2英寸的正方形6×6栅格有机玻璃测试盒。设置视频设备的侧面,使得整个盒子是在视场。保持设置及周边地区的每一天一样,以避免引入新意。
    3. 在干净的容纳杯取下笼代替一个断奶。记录体重。
    4. 通过拍摄测试身份证,鼠标的识别号码,年龄,检测日期开始视频录制。从保温杯到中心广场传输鼠标。时间为三分钟,计数在测试过程中通过鼠标的两个前爪走过的行数。
    5. 返回鼠标到一个干净的笼子,结束视频录制。
    6. 清洁用70%乙醇的试验装置。
    7. 重复,直到所有垃圾进行测试,然后返回所有幼崽的家笼。
    8. 清洗所有的检测设备,用70%的乙醇。
  3. 丝网握力测试
    注:握力测试是在P22和P26之间的隔日进行,以评估神经肌肉的力量。
    1. 交通运输小鼠试验区,并允许在笼休息测试前30分钟。
    2. 由清洗有机玻璃箱和网格,用70%的乙醇制备装置。将泡沫包装在盒子的底部和纸盖。
    3. 单独的小鼠分成三个组,在个别保温杯放置。
    4. 放置第一鼠标到丝网的中心,并慢慢倒转10-20厘米的软表面上方在有机玻璃箱的底部。测量潜伏期用秒表下降。终止检测后,如果鼠标没有60秒已经过去秋季。
    5. 返回鼠标保温杯,请用70%乙醇网格和更换纸张在泡沫包装。返回到第一前进行该组中剩余的两只小鼠的试验。重复,直到每个鼠标一共有三次被测试。
    6. 返回组到一个干净的笼子里,并继续剩余组。如果有比在任何一组三只老鼠少了,保证5分钟审间的恢复时间间隔是允许的。
    7. 返回所有小鼠家笼,用70%乙醇的纸和干净的测试设备处理。

2,视网膜结构检查

  1. 通过腹腔注射氯胺酮(100毫克/千克)和赛拉嗪(10毫克/千克)麻醉在P30-35动物。按捏脚垫评估麻醉深度和进行只在不存在的响应,在与IACUC准则线。用4%PFA / PBS中48灌注。
  2. 要去除眼睛,在切口SI清洁皮肤用70%乙醇TE时,在颅底通过皮肤切割前。剥离背部皮肤,以暴露颅骨和干净,用70%的乙醇。使用清洁工具,小心翼翼地颅骨切开到达眼窝并露出眼睛。切断视神经,轻轻地从插座上拔下的眼睛,在PBS冲洗。
  3. 瞩目在4%PFA / PBS中,在室温下10分钟。
  4. 将目光中含有PBS的小皮氏培养皿。请使用拆线剪刀角膜中心的小切口。通过切割角膜和巩膜之间的边缘除去角膜。使用镊子去除虹膜。最后,剥离的RPE层,而使视网膜完好和代替透镜。
    注:4%PFA / PBS中固定会导致视网膜色素上皮脱离,允许视网膜色素上皮易于从视网膜的外侧剥离。
  5. 重新修复在4%PFA / 30%蔗糖/ PBS中,在室温下15分钟的眼睛返回到含PBS的培养皿之前。拉出LENS使用镊子,使玻璃体与它一起。
  6. Cryoprotect在30%蔗糖过夜,在4℃。
  7. 外套眼最佳切削温度化合物(OCT),并转移到含有新鲜十月的嵌入模具。定向眼使得矢状面是与切割面平行,用尽可能少的动作尽可能和避免引入气泡。通过在干冰/乙醇浴中浸渍模具闪冻。存储块在-80℃。
  8. 使用低温恒温器,切割20微米的矢状切面和收集预清洗幻灯片。
  9. 染色切片与根据标准方法49苏木精和曙红。图片使用配备亮视野显微镜光学显微镜。

3.组织化学染色

  1. 样品制备
    1. 通过开放吸入一滴使用过量的异氟醚(丙二醇30%)在P30-35动物实施安乐死。通过停止评估安乐死呼吸,心跳和缺乏应对捏足垫。确认颈椎脱位和器官摘除,符合IACUC指导方针死亡。
    2. 以除去脑,清理在切口部位用70%乙醇的皮肤,在颅底通过皮肤切割前。剥离背部皮肤,以暴露颅骨和干净,用70%的乙醇。用干净的乐器,通过头骨小心切割,取出暴露大脑。取出膜,轻轻地从头骨腔内取出大脑。冲洗于PBS中。
    3. 大衣华侨城大脑,并转移到含有新鲜十月的嵌入模具。定向脑使得矢状面是与切割面平行,用尽可能少的动作尽可能和避免引入气泡。通过在-80℃下浸渍在干冰/乙醇浴中并存储在模具闪冻。
    4. 使用低温恒温器,切割10微米的矢状切面和收集预清洗幻灯片。
  2. <LI> NADH黄递酶染色
    1. 通过溶解5.72克的Tris-HCl中的1.66克Tris碱在1L去离子水制备的0.05M Tris缓冲液,pH值7.6。储存于4℃多达六个星期。
    2. 制备NADH溶液(2.25毫摩尔NADH在0.05M Tris缓冲液)。分装和储存在-20°C。
    3. 制备NBT溶液(2.5毫摩尔硝基蓝四氮唑在0.05M Tris缓冲液)。在玻璃瓶中储存于4℃多达六个星期。
    4. 结合的NADH溶液和NBT溶液等体积以使染色溶液和1ml添加​​到每个滑动。孵育在37℃下在湿润的腔室30分钟。
    5. 抽吸染色溶液中并用的dh 2 O洗涤三次
    6. 在上升和丙酮的递减浓度洗三次,每次/ DH 2 O(30%,60%,90%,60%,30%),在室温下2分钟。
    7. 在蒸馏水中2 O冲洗三次,并用含水介质装入部分。使用光学显微镜图像配明亮˚Field显微镜。蓝染色对应的酶活性。
  3. 琥珀酸脱氢酶组织化学染色
    1. 准备0.2M的磷酸二氢钠/ DH 2 O和0.2M钠磷酸氢二钠/ DH 2 O.
    2. 由3份磷酸二氢用20份氢二钠磷酸结合使0.2M磷酸缓冲液,pH 7.6。
    3. 制备染色溶液(0.1M琥珀酸钠,1.25M的NBT在0.2M磷酸缓冲液)和1ml添加​​到每个滑动。孵育在37℃下在湿润的腔室60分钟。
    4. 抽吸染色液并用蒸馏水2 O洗涤三次
    5. 升序洗三次,每次降丙酮浓度/ DH 2 O(30%,60%,90%,60%,30%),在室温下2分钟。
    6. 在蒸馏水中2 O冲洗三次,并用含水介质装入部分。图片使用配备亮视野显微镜光学显微镜。蓝染色相当于ENzymatic活动。

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Representative Results

本节描述了使用这些方法获得的结果的例子。在后肢试验,拉尝试次数所作和延迟落在相加超过每天两次连续测试。这种测试可用于比较基因不同的组来区分具有降低的神经肌肉强度HtrA2的tm1jhoh小鼠(HTRA2 KO)小鼠在图1A - B表明在拉和延迟的数量没有变化,从P4-6落入随后减小在P7-10神经肌肉强度,相比于同窝(HTRA2 WT)。随着年龄的强度的预期增加也是在野生型动物可观察到的。对于断奶观察试验,总活性可以通过所有事件求和进行评估(行走过,饲养和疏导事件),整个测试连续三天平均。可替代地,事件的每个特定类型可以是individuallÿ分析。在这里,代表结果呈现,这表明相比减少WT同窝HTRA2 KO小鼠的活动。这些数据表明,总活性可定量测定和各组( 图1C)进行比较。另外,也可以通过计算从每个测试日进行的三个重复的每日平均量化握力的差异。当HTRA2 KO小鼠进行比较,以同窝对照,减少在强度体现在一个较短的延迟下降( 图1D)。

视网膜的H&E染色生成其中视网膜结构可以被检查和进行比较( 图2)的图像。细胞类型的构成视网膜的层明确界定允许基因组间比较。这里,HtrA2的tm1jhoh'; HtrA3 tm1jhoh小鼠显示在视网膜结构没有变化,相比HtrA2的 tm1jhoh小鼠P35。最后,对于电子传递链复合物活性的组织化学染色可以用于识别在呼吸酶的功能的变化,并在染色强度反映增加的酶活性,如在小脑和HtrA2的纹状体中观察到的减少增加FLOX / FLOX;的Tg(NES当与WT相比同窝( 图3)-cre)1Kln / J(NesKO)大脑。

图1
图1:基因工程小鼠的行为表型 HtrA2的tm1jhoh(HTRA2 KO)小鼠进行的描述行为测试并与野生型(HTRA2 WT)同窝对照。 (A - B)从P4-P10 WT和KO新生儿进行后肢悬浮试验并演示神经肌肉的减少实力KO动物(WT:N = 28,KO:N = 19)。 (A)KO幼崽最初做出类似的尝试拉作为WT兄弟姐妹的数量,但显示在稍后的时间点作出努力的减少。 (B)KO新生儿“延迟回落也是正常的开始而是从P7开始下降。 ( )断奶观察总活动度评分在KO动物相比减少WT同窝,这些小鼠的活动减少是一致的(WT:N = 19,KO:N = 12)。 (D)KO动物也有一个减少延迟网格反演试验过程中出现回落,表明HTRA2 KO小鼠减少握力(WT:N = 17,KO:N = 9)。数据代表平均值±SEM(#0.1 <P <0.05,* P <0.05,** P <0.001,*** P <0.001通过独立t检验)。这个数字已经从帕特森等人修改。34 ,请点击这里查看一个更大的版本这个数字。

图2
2: 视网膜H&E染色用苏木伊红染色视网膜切片允许结构的检查,划定视网膜层。从P35 HtrA2的WT下面章节; HtrA3 tm1jhoh(A)HtrA2的tm1jhoh; HtrA3 tm1jhoh(B)显示正常的视网膜结构。 RPE:视网膜色素上皮细胞,OS:外段,方法是:内段,ONL:外核层,OPL:外网状层,INL:内核层,彩光:内网状层,GCL;神经节细胞层。比例尺= 1毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。


图3:;的Tg(NES-CRE)1Kln / J(NesKO)和呼吸复杂的活动组织化学染色NADH黄递酶(复合物I)和琥珀酸脱氢酶(复合物II)活性的P25 HtrA2的横向脑切片FLOX / FLOX执行HtrA2的+ / FLOX;的Tg(NES-CRE)1Kln / J(NesWT)窝。 NADH黄递酶活性小脑(CRBL,B)和纹状体相比NesWT对照组(A,C)NesKO(D)下降,但不是在大脑皮质(E - F)。 SDH活性在NesKO小鼠小脑和纹状体(1H,J)类似地减少相比NesWT对照(G,I),但有在大脑皮层没有变化(K - L)。比例尺= 200微米。这个数字已经从帕特森 34修改请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

强大的治疗是需要限制衰弱与人类老化条件的影响,但他们仍然是难以捉摸的许多条件。为了识别潜在的治疗目标和制定干预策略的原因和与衰老相关疾病的病理首先必须了解。不是所有的转基因小鼠立即表现为,与相关的所关注的疾病,即使那些基因先前已挂在人类研究中的条件明确​​表型。因此更系统的调查是必需的,转基因小鼠中应当进行适当的实验,以确定可能在人类中进行相关的相关的疾病表型。

无数的行为测试存在测定小鼠50,51神经功能。此概括的行为测试适合于基于人的调查结果和实际的表型的虚拟表型OBSERVED小鼠。此外,这些试验是简单的在与导电行为实验很少或者甚至没有经验的实验室进行。没有为精密的设备没有要求,但结果是有意义的,翔实的时候妥善收集,使它们可用作审查其预计将有神经肌肉缺陷的转基因小鼠的表型的第一步。然后将得到的数据可用于与更复杂的测试设备直接进一步测试的焦点,可能。

同样,在组织52评估呼吸功能存在许多技术。测量ATP合成,氧的消耗或线粒体膜电位的变化的速率是线粒体功能的重要读数,但他们可以是复杂的和耗时的执行,需要特殊试剂和设备52-55。此外,它们往往局限于所述和线粒体的电平RION或细胞,依靠培养的细胞,裂解物或孤立的线粒体。组织化学染色是确定线粒体功能障碍没有大投入的时间或资源有益的第一步。此外,染色的组织切片的能力适合于快速识别区域差异可能不是与其它技术如显而易见的,例如在HtrA2的缺陷脑电波中所见的酶染色的特定区域损失。虽然该技术在其测量呼吸能力倍数变化的能力有限,它映射出然后可以使用更复杂的方法来追求定义的大脑区域。

虽然这种表型时间表中提出的技术是简单进行,适当地执行某些步骤,是对实验的成功至关重要。对于行为表型,大必须小心,以确保测试的同时,并在同一位置的每一天被执行,以限制变异前奏按位置的新颖性或通过在昼夜节律的差du​​ced。设备应以同样的方式,每天被组织为类似的原因。房间组织是用于活性试验,其中,在新颖的微小变化可以大大地影响鼠标的活性尤为关键。当测量握力,调查应确定小鼠有反转之前的网格的适当持有。同样地,必须小心在后肢试验或测试结果释放之前适当暂停小狗将偏向一个较短的延迟下降。

对于组织分型,取得了良好的路段是至关重要的。视网膜的信息化染色取决于有效的固定前清扫或文物切片和解剖过程中会出现,扭曲的形态。组织化学染色需要大脑解剖后进行快速冷冻保存的酶的功能,但温育时间是类似critica升;在温度或时间长度的小波动可以引起在染色强度的差异。在可能的情况,样品应在同一时间进行处理,以允许组间比较。

这里用于研究预期显示与年龄有关的疾病,即AMD和PD相关联的细微的表现型的转基因小鼠中的测试方案,进行说明。此表型时间表可用于所关注的组织内识别在神经肌肉强度和活动障碍,以及确定的结构和功能的缺陷。此计划提供了在年轻,基因改造的小鼠表型早了系统的分析。在将来,这种方法可以应用到预期提呈具有AMD或PD相关表型的任何基因修饰小鼠,以及那些不明病因的出现公开正常。测试的简单允许测试,而不显著投资,而且可以被用来通知进更多的S案例研究。通过行为测试与细胞表型相结合,有可能限制所使用的小鼠的数目,并直接比较与生理条件动物的表现。此表型调度提供了可用于指导随后的研究的焦点的初步分析。

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Acknowledgments

资助这项研究来自Rosebay医学基金会和耶鲁大学医学院院长的研究基金(JH)。我们感谢克莱尔·柯尼希博士与行为实验的帮助。基因是在Ozgene的(澳大利亚珀斯)生成的工程小鼠线。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol Decon (Fisher Scientific) 435541
50 ml conical tube Fisher Scientific 1443222
cotton balls Walmart
heat mat Sunbeam 0000756-500-000
Holding tray (ice cube tray) Walmart
Electronic stopwatch GOGO PC396
Plexiglass box constructed in workshop 12" by 12" 
Vixia HF R400 Camcorder Canon 8155B004
9 oz Clear Cups Walmart
1/4 inch wire mesh Home Depot 204331884 (online) / 554219 (in store) 12" by 12" 
Bubble wrap VWR 470092-416
Straight specimen forceps VWR 82027-438
Fine-tip dissecting forceps VWR 82027-408
Fine scissors VWR 82027-578
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710
10x phosphate buffered saline pH 7.4 American Bioanalytical AB11072-04000
Sucrose JT Baker 4072-01
superfrost slides Fisher Scientific 12-550-15
Hematoxylin Stain Solution Fisher Scientific (Ricca) 353016
Eosin Y Stain Solution Fisher Scientific (Ricca) 2845-32
Tris hydrochloride Sigma T3253
Tris American Bioanalytical AB02000-01000
Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate Sigma N8129
Nitrotetrazolium Blue chloride Sigma N6876
Acetone JT Baker 9006-05
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma S9390
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma S2378
VectaMount aqueous mounting medium Vector Labs H-5501-60
Cover glass Fisher Scientific 12-545-M 60 mm x 24 mm
AxioImager A1 microscope Zeiss
Video camera tripod Amazon
Optimal Cutting Temperature (OCT) Fischer Scientific 23730571
Cryostat Sectioning  Machine Leica  CM1900 Discontinued but since replaced by CM1950

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References

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