A phénotypage Regimen pour des souris génétiquement modifiées utilisées pour étudier les gènes impliqués dans les maladies humaines du vieillissement

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Patterson, V. L., Thompson, B. S., Cherry, C., Wang, S. b., Chen, B., Hoh, J. A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging. J. Vis. Exp. (113), e54136, doi:10.3791/54136 (2016).

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Abstract

Introduction

les maladies liées à l'âge sont de plus en plus répandue dans la société moderne. Comme la science médicale améliore et l'espérance de vie augmente, la population continue de vieillir et le fardeau de ces maladies augmente. Des traitements efficaces sont nécessaires pour réduire l'impact des conditions débilitantes, mais restent difficiles dans de nombreux cas. Seule la compréhension des causes et de la pathologie des maladies associées au vieillissement scientifiques peuvent commencer à identifier des cibles thérapeutiques potentielles et élaborer des stratégies d'intervention. des conditions liées à l'âge communs comprennent des troubles neurodégénératifs tels que la maladie de Parkinson (PD) et la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA). PD est trouble du mouvement le plus courant causé par la neurodégénérescence chez les humains. La plupart des patients parkinsoniens présentent des symptômes tels que tremblements de repos, bradykinésie et la rigidité après 50 ans. L'apparition précoce a également été observée dans environ 10% des cas.

La DMLA est la principale cause de cécité dansles photorécepteurs, les personnes âgées endommageant progressivement et l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dans l'oeil. La vision centrale est altérée, mais la vision périphérique est généralement affectée. Il existe deux formes de DMLA. Dans la forme «sèche», les dépôts de protéines extracellulaires connus sous forme de drusen entre l'EPR et la membrane de Bruch (BM), conduisant à une atrophie géographique et le flou de la vision centrale. Les "humides" plus sévères forment les résultats de néovascularisation de la choroïde à travers BM dans les couches de l'EPR et de photorécepteurs et peuvent conduire à des hamorrhaging sous la rétine qui provoque des dommages permanents au tissu rétinien. Le génome des études d'association de large ont déjà identifié des loci qui sont associés à une susceptibilité accrue à la maladie et a identifié deux régions d'intérêt: le facteur H du complément (CFH) sur le chromosome 1 et le locus 10q26, où liée à l'âge maculopathie susceptibilité 2 (ARMS2) et à haute température facteur de condition A1 (HtrA1) gènes sont situés 1-5 3-6.

CFH agit comme un régulateur négatif de la voie alternative (AP) du système du complément en inhibant l'activation de C3. Un polymorphisme nucléotidique simple (SNP) a été liée à un risque accru d'AMD, ce qui provoque l' échange de la tyrosine 402 dans l' exon 9 avec histidine en raison d'un T à C substitution 1. Dans la DMLA on pense que le PA est misregulated en raison d'une perte de fonction de CFH, mais si le SNP joue un rôle causal est peu claire. Une hypothèse est que l'histidine chargée positivement est pensé à nier la capacité de CFH à se lier à l' interaction des protéines C-réactive protéine et du sulfate d'héparine 1,7. Des études in vitro de CFH Y402H fournissent des résultats contradictoires sur les différences fonctionnelles entre les variantes, et vivo travail <em> Cfh - / - souris exprimant humanisé CFH est en cours 8. ARMS2 est situé en amont HtrA1 dans le génome des primates, bien que le gène est absent chez la souris. HtrA1 est une sérine-protéase, mais ARMS2 est mal caractérisée. Le déséquilibre de liaison entre les SNP dans le locus AMD associée a rendu difficile de déterminer les contributions au risque de mutations individuelles des gènes dans cette région, mais des travaux récents ont suggéré qu'il est surexpression de HtrA1 plutôt que ARMS2 qui mène à la néovascularisation et dépôts de protéines sous - rétiniens 9-11. Toutefois, la proximité des gènes de ce locus peut permettre des interactions qui ne peuvent pas être étudiés en utilisant des transgènes insérés au hasard.

En plus de la DMLA, la famille HtrA de sérine-protéases ont été associées à de nombreuses maladies humaines. Toutes les protéines HtrA contiennent un domaine de sérine-protéase suivi d'au moins un domaine PDZ C-terminale. HtrA1, HtrA3 et HtrA4 partagent le grmanges d'homologie, se composant d'un domaine de peptide signal, de liaison du facteur ressemblant à l'insuline de croissance, un domaine inhibiteur de protéase Kazal, le domaine de la sérine protéase et un domaine PDZ. HtrA2 a une extrémité N-terminale différente, composée d'une séquence de localisation mitochondriale, un domaine transmembranaire et un inhibiteur de domaine de liaison à l' apoptose suivie par la protéase et les domaines PDZ 12-16. HtrA1 chez les mammifères est régulée par le remodelage induit par le substrat dans le site actif de son domaine de protéase 17-20 et HtrA2 peut aussi être modulée par l' interaction entre la sérine protéase et les domaines PDZ qui supprime l' activité de protease 21. Fait intéressant, le domaine PDZ ne semble pas conférer une réglementation similaire à HtrA3 16. Les protéases HtrA peuvent également être réglementées par des facteurs extrinsèques: il a été récemment démontré qu'il existe une interaction réglementaire entre HtrA1 et protoporphyrines 22 et HtrA2 peuvent être régulées par la phosphorylation lors de l' activation de la kinase MAP p38la voie d'une manière dépendante PINK1 23. La suppression des membres individuels de la famille HtrA chez la souris a été documentée, mais les effets mécanistes sont pour la plupart peu claire en partie à cause du manque de phénotypes visibles.

HtrA1 joue un rôle important dans le contrôle de la qualité de la protéine et de sa mauvaise régulation ou la mutation a été associée à de nombreuses maladies humaines différentes , y compris l' arthrite, le cancer et un risque accru de DMLA 3,4,24-32. Perte de la fonction HtrA2 dans les tissus neuronaux ont été associés à des phénotypes parkinsoniens chez les humains et les souris, tandis que sa perte de tissus non neuraux entraîne un vieillissement accéléré 33-37. HtrA3 dysrégulation a été associée à des maladies telles que la pré - éclampsie et certains types de cancer 38,39. Up-régulation de HtrA4 a été observée dans les placentas de patients atteints de prééclampsie , mais les souris knock - out ne pas afficher un phénotype manifeste 40,41. Le manque de phénotypes observés chez certaines souris knock-out a étépostulé pour être le résultat d' une compensation entre le membre de la famille HtrA: on pense que les deux HtrA4 et HtrA1 interagissent avec la famille des protéines TGF-B, ce qui permet une compensation par HtrA1 sur la suppression de HtrA4 41. De même, on pense que depuis HtrA1 et HtrA3 ont un degré élevé d'homologies de domaine qu'ils peuvent avoir des fonctions complémentaires 42. Cependant, il a été suggéré que les protéines HtrA peuvent avoir un rôle partiellement antagonistes, en concurrence pour réguler 43 cibles communes.

Pour approfondir ces facteurs de risque trois lignées de souris knock-in humanisés ont été générés. Dans Cfh TM1 (CFH * 9) jhoh et Cfh TM2 (CFH * 9) jhoh, exon 9 du gène CFH remplacé par exon 9 de l'homologue humain. Cfh TM1 (CFH * 9) jhoh code pour la non-maladie associée tyrosine résidu en position 402, tandis que Cfh tM2 (CFH * 9) jhoh porte le Y402H, SNP de risque associé. DansARMS2 tm1jhoh la séquence ARMS2 humaine a été la cible d'une région en amont de HtrA1. Une séquence d'arrêt loxP flanquée placé en amont de la séquence du gène , mais en aval du promoteur inclus UBIC a été excisé par croisement des souris OzCre, qui expriment la recombinase Cre sous le contrôle du promoteur Rosa26, 34 comme décrit précédemment. En plus de ces knock-in lignes, allèles knock - out conditionnel pour Cfh et HtrA1 (Cfh tm1jhoh et HtrA1 tm1jhoh), ainsi que les autres membres connus de la famille HtrA ont été générés: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) et HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). Les KO lignée germinale ont été créés par le croisement des souris OzCre aux animaux conçus pour flanquer exons spécifiques avec des sites loxP, tels que la suppression provoque un décalage du cadre et / ou suppression du domaine actif (Cfh; exon 3, HtrA1; exons 2-3, HtrA2: exons 2-4, HtrA3; ' exon 3, HtrA4; exons 4-6) 34,41. Une délétion neuronal de HtrA2, supprimé en utilisant Cre recombinase sous le contrôle du promoteur de la nestine (HtrA2 flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J), a également été décrite 34. Seules les souris dépourvues de HtrA2, soit systémique ou dans les tissus neuronaux, affichés phénotypes clairs, présentant des phénotypes parkinsoniens.

Comme certains de ces gènes d'intérêt sont posés à être localisées aux mitochondries 11,44-47, et la suppression de HtrA2 généré phénotypes parkinsoniens, un régime de phénotypage avec un accent mitochondrial et neurologique est décrit ici et des résultats représentatifs des tests d'intérêt sont fournis . Afin d'examiner des souris génétiquement modifiées produites pour enquêter sur l'homme, la maladie liée à l'âge à fond et systématiquement un calendrier de phénotypage initial a été créé, composé d'une série de tests relatifs aux deux principauxmaladies d'intérêt: AMD et de Parkinson.

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Protocol

Ethique Déclaration: Les études portant sur des animaux ont été menées en conformité avec les instituts nationaux de recommandations de santé dans le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Commission (IACUC) à l'Université de Yale.

1. Test du comportement des souris génétiquement modifiées

Remarque: Toutes les souris doivent être soumis au même régime de tests pour limiter les différences de habituation à la manipulation. Les essais doivent être effectués à la même heure chaque fois.

  1. Neonatal Hind Limb test
    Note: Le test de membre postérieur est effectué tous les jours de jour postnatal (P) 4 à P10 pour évaluer proximale force musculaire des membres postérieurs, la faiblesse et la fatigue.
    1. souris de transport vers la zone d'essai et laisser reposer pendant 30 minutes avant le test.
    2. Préparer un appareil d'essai par un nettoyage 50 ml tube conique de 70% d'éthanol, en poussant deux (P4-P8) ou un (P9-P10) des boules de coton au fond du tUbe et la fixation dans une position verticale.
    3. Retirer un chiot à partir du poids de la cage et enregistrer. Gardez chiot dans la tenue plateau sur coussin chauffant chaque fois pas tester.
    4. suspendre doucement les membres postérieurs du nouveau-né sur le rebord du tube conique, de telle sorte qu'il est orienté vers le bas vers les boules de coton. Comptez le nombre de tentatives de traction faites et mesure la latence de tomber à l'aide d'un chronomètre.
    5. Répéter une fois de plus, puis étiqueter le chiot avec le marqueur. Ensuite, identifier les chiots P6 par orteil écrêtage. Frottez doucement les chiots avec une literie de cage avant de remplacer.
    6. Essuyez tube conique avec 70% d'éthanol.
    7. Répétez le test sur le prochain chiot jusqu'à ce que toute la litière a été testée.
    8. Jeter boule de coton et d'un tube conique. Nettoyer tout l'équipement avec 70% d'éthanol.
  2. Weanling test Observation
    Note: Le test d'observation de sevrage est administré tous les jours de P19 à P21 pour marquer les niveaux de mouvement et d'activité générale.
    1. souris de transport vers la zone d'essai d'unnd laisser reposer pendant 30 minutes avant le test.
    2. Boîte de test en plexiglas marqué d'une grille de 6x6 de 2 pouces carrés sur la base d'un nettoyage avec 70% d'éthanol préparer. Mettre en place un équipement vidéo sur le côté de telle sorte que toute la boîte est dans le champ de vision. Gardez le mettre en place et alentours de la même chaque jour pour éviter l'introduction de la nouveauté.
    3. Retirer un weanling de la cage et placer dans une tasse de maintien propre. poids Record.
    4. Commencez l'enregistrement vidéo en filmant la carte d'identification de test, avec le numéro d'identification de la souris, l'âge et la date de l'essai. Transférer la souris de tenir tasse à la place du centre. Le temps de trois minutes, en comptant le nombre de lignes parcourues par les deux pattes avant de la souris lors de l'essai.
    5. Retour à la souris un enregistrement vidéo de la cage et l'extrémité propre.
    6. Nettoyer l'appareil d'essai avec 70% d'éthanol.
    7. Répétez jusqu'à ce que tous les déchets est testé, puis retourner tous les chiots à la cage.
    8. Nettoyer tous les équipements de test avec 70% d'éthanol.
  3. Grillage Grip Test de résistance
    Note: Le test de la force de préhension est réalisée sur deux jours entre P22 et P26, pour évaluer la force neuromusculaire.
    1. souris de transport vers la zone d'essai et permettent de se reposer en cage pendant 30 minutes avant le test.
    2. Préparer l'appareil par le nettoyage d'une boîte et maille grille Plexiglas avec 70% d'éthanol. Placez le film à bulles dans le fond de la boîte et couvrir avec du papier.
    3. souris séparés en groupes de trois, en plaçant dans chaque coupelles de retenue.
    4. Placez la première souris sur le centre du treillis métallique et inverser lentement 10-20 cm au-dessus de la surface molle dans le fond de la boîte en plexiglas. Mesurer la latence de tomber à l'aide d'un chronomètre. Terminate test après 60 secondes se sont écoulées si la souris ne fonctionne pastomber.
    5. souris Retour à la tasse de maintien, lingette engrener avec 70% d'éthanol et remplacer le papier sur le film à bulles. Effectuer le test sur les deux souris restantes dans le groupe avant de revenir à la première. Répétez jusqu'à ce que chaque souris a été testé un total de trois fois.
    6. Retour du groupe à une cage propre et continuer avec les groupes restants. S'il y a moins de trois souris dans un groupe quelconque, veiller à ce qu'un 5 min entre les essais intervalle de récupération est autorisé.
    7. Retour toutes les souris à la cage, disposer de papier et de l'équipement d'essai propre avec 70% d'éthanol.

2. Examen de la structure rétinienne

  1. Anesthésier les animaux à P30-35 par injection intraperitoneale de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg). Évaluer la profondeur de l'anesthésie en pinçant la patte et procéder uniquement en l'absence d'une réponse, conformément aux directives du IACUC. Perfuser avec 4% PFA / PBS 48.
  2. Pour supprimer les yeux, nettoyer la peau au si l'incisionTE avec 70% d'éthanol, avant de couper à travers la peau à la base du crâne. Peler la peau pour exposer le crâne et propre avec 70% d'éthanol. Utilisation d'instruments propres, couper soigneusement à travers le crâne pour atteindre les orbites et d'exposer les yeux. Sever le nerf optique, retirez délicatement l'œil de la prise et rincer dans du PBS.
  3. Fixer les yeux dans 4% de PFA / PBS pendant 10 min à température ambiante.
  4. Placez les yeux dans une petite boîte de Pétri contenant du PBS. Faire une petite incision dans le centre de la cornée en utilisant le point de ciseaux d'enlèvement. Retirer la cornée en coupant l'arête entre la cornée et la sclérotique. Utilisez une pince pour enlever l'iris. Enfin, décoller les couches de l'EPR, en laissant intacte la rétine et la lentille en place.
    Note: Les 4% de PFA / PBS fixation va provoquer un détachement RPE permettant l'EPR d'être facilement détachée de l'extérieur de la rétine.
  5. Nouveau fix dans 4% de PFA / 30% de saccharose / PBS pendant 15 min à température ambiante avant de retourner l'oeil à une boîte de Petri contenant du PBS. Retirez le lens en utilisant une pince, ce qui porte le corps vitré avec elle.
  6. Cryoprotect dans 30% de saccharose pendant une nuit à 4 ° C.
  7. yeux Coat dans Optimum composé de coupe de température (OCT) et transfert à un moule enrobage contenant frais octobre. Orienter l'oeil de telle sorte que le plan sagittal est parallèle à la face de coupe, en utilisant le moins de mouvements possibles et d'éviter l'introduction de bulles d'air. gel Flash en immergeant le moule dans un bain de glace / éthanol sec. blocs de conserver à -80 ° C.
  8. L'utilisation d'un cryostat, couper 20 um sections sagittal et de recueillir sur des lames préalablement nettoyées.
  9. Sections Stain avec hématoxyline et éosine selon des protocoles standards 49. L'image à l'aide d'un microscope optique équipé pour la microscopie en champ clair.

3. histochimique Coloration

  1. La préparation des échantillons
    1. Euthanasier animaux à P30-35 utilisant overdose isoflurane (30% dans du propylène glycol) par inhalation de chute libre. Évaluer l'euthanasie par la cessationde la respiration, le rythme cardiaque et l'absence de réponse à pincer la patte. Confirmer la mort par dislocation cervicale et le prélèvement d'organes, conformément aux directives du IACUC.
    2. Pour supprimer le cerveau, nettoyer la peau au niveau du site d'incision avec 70% d'éthanol, avant de couper à travers la peau à la base du crâne. Peler la peau pour exposer le crâne et propre avec 70% d'éthanol. Utilisation d'instruments propres, soigneusement coupés à travers le crâne et enlever pour exposer le cerveau. Retirer les membranes, et retirez délicatement le cerveau de la cavité du crâne. Rincer dans du PBS.
    3. Enduire le cerveau dans l'OCT et le transfert à un moule enrobage contenant frais octobre Orienter le cerveau de telle sorte que le plan sagittal est parallèle à la face de coupe, en utilisant le moins de mouvements possibles et d'éviter l'introduction de bulles d'air. gel Flash en immergeant le moule dans un bain de glace / éthanol sec et conserver à -80 ° C.
    4. L'utilisation d'un cryostat, couper 10 um sections sagittal et de recueillir sur des lames préalablement nettoyées.
  2. <li> NADH diaphorase Coloration
    1. Préparer tampon Tris 0,05 M, à pH 7,6 par dissolution de 5,72 g de Tris-HCl et 1,66 g de Tris base dans de l'eau déminéralisée-1L. Conserver à 4 ° C pendant jusqu'à six semaines.
    2. Préparer la solution de NADH (mM NADH 2,25 dans un tampon Tris 0,05 M). Aliquoter et conserver à -20 ° C.
    3. Préparer une solution NBT (2,5 mM Nitro-Blue tétrazolium dans un tampon Tris 0,05 M). Conserver à 4 ° C pendant jusqu'à six semaines dans une bouteille en verre.
    4. Combiner des volumes égaux de solution NADH et une solution NBT pour faire solution de coloration et ajouter 1 ml à chaque diapositive. Incuber à 37 ° C dans une chambre humidifiée pendant 30 minutes.
    5. Solution de coloration Aspirer et laver trois fois avec dH 2 O.
    6. Laver trois fois chacun dans l' ordre croissant et décroissant des concentrations d'acétone / dH 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) pendant 2 minutes à la température ambiante.
    7. Rincer trois fois en dH 2 O et monter des sections avec un milieu aqueux. L'image à l'aide d'un microscope optique équipé pour lumineux fmicroscopie ield. Coloration au bleu correspond à l'activité enzymatique.
  3. Succinate déshydrogénase histochimique Coloration
    1. Préparer 0,2 M monosodique / phosphate dH 2 O et 0,2 M de phosphate de sodium dibasique / dH 2 O.
    2. Faire 0,2 M de tampon phosphate, pH 7,6, en combinant 3 parties de phosphate monobasique avec 20 parties de phosphate de sodium dibasique.
    3. Préparer une solution de coloration (0,1 M de succinate de sodium, 1,25 M dans un tampon de NBT phosphate 0,2 M) et ajouter 1 ml à chaque diapositive. Incuber à 37 ° C dans une chambre humidifiée pendant 60 min.
    4. Solution de coloration Aspirer et laver trois fois en dH 2 O.
    5. Laver trois fois chacun dans ascendantes et descendantes des concentrations d'acétone / dH 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) pendant 2 minutes à la température ambiante.
    6. Rincer trois fois en dH 2 O et monter des sections avec un milieu aqueux. L'image à l'aide d'un microscope optique équipé pour la microscopie en champ clair. Coloration au bleu correspond enactivité zymatic.

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Representative Results

Cette section décrit des exemples de résultats obtenus en utilisant ces méthodes. Dans le test de membre postérieur, le nombre d'essais de traction réalisés et le temps d'attente de tomber sont additionnés sur deux essais consécutifs pour chaque jour. Ce test peut être utilisé pour comparer génétiquement différents groupes de distinguer les souris avec une réduction de force neuromusculaire HtrA2 tm1jhoh (HTRA2 KO) de souris dans la Figure 1A -. B démontrent aucun changement dans le nombre de tractions et de latence tomber de P4-6 suivie d'une réduction la force neuromusculaire P7-10, par rapport à la même portée (HTRA2 WT). L'augmentation prévue de la force avec l'âge est également observable chez les animaux de type sauvage. Pour le test d'observation de sevrage, l'activité totale peut être évaluée en additionnant tous les événements (lignes parcourues, l'élevage et les événements de toilettage), en moyenne sur les trois jours consécutifs de tests. En variante, chaque type spécifique d'événement peut être individually analysée. les résultats sont présentés ici représentatifs, ce qui démontre une activité réduite de HtrA2 souris KO par rapport à littermates WT. Ces données démontrent que l' activité totale peut être quantitativement mesurée et comparée entre les groupes (figure 1c). Il est également possible de quantifier les différences de force de préhension en calculant une moyenne journalière des trois répétitions effectuées chaque jour d'essai. Lorsque les souris KO HTRA2 sont comparés à des contrôles de la même portée, réductions de la résistance manifeste dans une latence plus courte à l' automne (figure 1D).

Coloration H & E de la rétine génère des images dans lesquelles la structure de la rétine peut être examiné et comparé (Figure 2). Les couches de types de cellules qui composent la rétine sont clairement définies permettant une comparaison entre les groupes génétiques. Ici, HtrA2 tm1jhoh '; les souris HtrA3 de montrer aucun changement dans la structure de la rétine, par rapport à HtrA2 de HtrA3 au P35. Enfin, la coloration histochimique pour la chaîne de transport d'électrons activité complexe peut être utilisé pour identifier des changements dans les fonctions des enzymes respiratoires, avec une augmentation de l'intensité de coloration reflète l' activité de l' enzyme augmente, telles que la réduction observée dans le cervelet et le striatum de HtrA2 flox / flox; Tg (Nes -cre) 1Kln / J (Nesko) cerveau par rapport à littermates WT (figure 3).

Figure 1
Figure 1:. Phénotypage comportemental des souris génétiquement modifiées HtrA2 tm1jhoh (HTRA2 KO) chez la souris ont été soumises à des tests de comportement décrit et par rapport au type sauvage (WT) HTRA2 contrôles de même portée. (A - B) Le test membre de suspension arrière a été réalisée sur WT et KO nés de P4-P10 et démontre une réduction neuromusculairela résistance chez les animaux KO (WT: n = 28, KO: n = 19). Chiots (A) KO initialement faire un nombre similaire de tentatives de traction que les frères et sœurs WT, mais montrent une diminution des tentatives faites à des points de temps plus tard. La latence de nouveau - nés (B) KO à tomber est d' abord normal , mais diminue de P7 partir. (C) L'observation de weanling score d'activité totale a été réduite chez les animaux KO par rapport à littermates WT, compatibles avec une activité réduite de ces souris (WT: n = 19, KO: n = 12). Animaux (D) KO ont également eu une latence réduite à tomber lors de l'essai d'inversion de maillage, ce qui démontre la force de préhension réduite de souris KO HTRA2 (WT: n = 17, KO: n = 9). Les données représentent la moyenne ± ETM (# 0.1 <p <0,05, * p <0,05, ** p <0,001, *** p <0,001 par des tests t indépendants). Ce chiffre a été modifié depuis Patterson et al. 34 S'il vous plaît cliquez ici pour voirune version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2:. Coloration H & E de la rétine sections rétiniennes Coloration hématoxyline et éosine permet l' examen de la structure, délimitant les couches de la rétine. Voici les sections de P35 HtrA2 WT; HtrA3 tm1jhoh (A) et HtrA2 tm1jhoh; HtrA3 tm1jhoh (B) affichage de la structure rétinienne normale. RPE: épithélium pigmentaire rétinien, OS: segments extérieurs, IS: segments intérieurs, ONL: couche externe nucléaire, OPL: couche plexiforme externe, INL: couche nucléaire interne, IPL: couche plexiforme interne, GCL; la couche de cellules ganglionnaires. Barre d' échelle = 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


. Figure 3: activité complexe respiratoire histochimique coloration pour NADH diaphorase (I complexe) et succinate déshydrogénase (complexe II) l' activité a été réalisée sur des coupes de cerveau transversales de P25 HtrA2 flox / flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J (Nesko) et HtrA2 + / flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J (NesWT) littermates. L' activité NADH enzyme diaphorase est diminuée dans le cervelet (Crbl, B) et le striatum (D) du cerveau Nesko par rapport aux témoins NesWT (A, C), mais pas dans le cortex cérébral (E - F). L' activité de SDH est réduit de façon similaire dans le cervelet et le striatum de souris Nesko (H, J) par rapport aux témoins NesWT (G, I) , mais il n'y a pas de changement dans le cortex cérébral (K - L). Barre d'échelle = 200 um. Cechiffre a été modifié à partir de Patterson et al. 34 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

traitements robustes sont nécessaires pour limiter l'impact des conditions liées au vieillissement humain débilitante, mais ils restent hors de portée pour de nombreuses conditions. Pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles et élaborer des stratégies d'intervention, les causes et la pathologie des maladies associées au vieillissement doivent d'abord être compris. Toutes les souris génétiquement modifiées immédiatement présentes avec des phénotypes clairs qui sont liés à la maladie d'intérêt, même si ces gènes ont déjà été liés à la condition dans les études humaines. Par conséquent plus d'enquêtes systématiques sont nécessaires et des souris génétiquement modifiées doivent être soumis à des expériences appropriées pour identifier les phénotypes qui peuvent être liés aux maladies associées chez l'homme.

Tests comportementaux Myriad existent pour doser la fonction neurologique chez les souris 50,51. Les tests comportementaux décrits ici sont adaptés aux phénotypes hypothétiques basées sur les résultats humains et les phénotypes réels observed chez la souris. En outre, ces tests sont simples à réaliser en laboratoire avec peu ou pas d'expérience dans la conduite des expériences comportementales. Il n'y a pas besoin de matériel sophistiqué, mais les résultats sont significatifs et instructifs lorsqu'ils sont correctement recueillies, ce qui les rend utiles comme une première étape dans l'examen du phénotype des souris génétiquement modifiées qui sont susceptibles d'avoir des défauts neuromusculaires. Les données résultantes peuvent ensuite être utilisés pour diriger l'objet de tests supplémentaires, éventuellement avec un appareil d'essai plus sophistiqué.

De même, de nombreuses techniques existent pour évaluer la fonction respiratoire dans les tissus 52. Mesurer le taux de synthèse d'ATP, la consommation d'oxygène ou de changements dans le potentiel de membrane mitochondrial sont des affichages importants de la fonction mitochondriale , mais ils peuvent être compliquées et longues à exécuter, ce qui nécessite des réactifs et de l' équipement spécifique 52-55. En outre, ils sont souvent limités au niveau de la mitochondrion ou de la cellule, en se fondant sur des cellules en culture, des lysats ou des mitochondries isolées. La coloration histochimique est une première étape utile pour identifier un dysfonctionnement mitochondrial sans un grand investissement de temps ou de ressources. En outre, la capacité à colorer des coupes de tissus se prête à identifier rapidement les différences régionales qui pourraient ne pas être aussi évident avec d'autres techniques, par exemple la perte de coloration enzymatique observée dans HtrA2 déficient cerveau spécifique à la zone. Bien que la technique est limitée dans sa capacité à mesurer les changements de pliage de la capacité respiratoire, il trace les régions du cerveau définies qui pourraient alors être poursuivis en utilisant des méthodes plus complexes.

Alors que les techniques présentées dans ce calendrier de phénotypage sont simples à effectuer, l'exécution de certaines étapes correctement est essentiel à la réussite des expériences. Pour le phénotypage comportemental, un grand soin doit être pris pour assurer les tests sont effectués en même temps et au même endroit chaque jour pour limiter la variation introductionproduit par la nouveauté de l'emplacement ou de la différence dans le rythme circadien. L'équipement doit être organisé de la même façon chaque jour pour des raisons similaires. L'organisation de la chambre est particulièrement critique pour le test d'activité, où de petits changements dans la nouveauté peuvent grandement influencer l'activité de la souris. Lors de la mesure la force de préhension, les enquêteurs doivent vérifier que les souris ont une prise adéquate de la maille avant l'inversion. De même, il faut prendre soin de suspendre correctement le chiot avant de le relâcher dans le test des membres postérieurs ou les résultats des tests seront biaisés vers une latence plus courte à l'automne.

Pour le phénotypage des tissus, l'obtention de bonnes sections est vital. coloration informative de la rétine dépend de la fixation effective avant la dissection ou des artefacts se poseront pendant la coupe et la dissection et de fausser la morphologie. La coloration histochimique exige des cerveaux à congeler rapidement après la dissection afin de préserver la fonction enzymatique, mais le temps d'incubation est similaire critical; de faibles fluctuations de la température ou de la durée du temps peut provoquer des différences dans l'intensité de coloration. Lorsque cela est possible, les échantillons doivent être traités en même temps, pour permettre une comparaison entre les groupes.

Voici un schéma de test utilisé pour étudier des souris génétiquement modifiées devraient afficher les phénotypes subtiles associées à des maladies liées à l'âge, à savoir AMD et PD, est décrite. Ce calendrier de phénotypage peut être utilisé pour identifier les déficits de la résistance et de l'activité neuro-musculaire, ainsi que d'identifier les défauts structurels et fonctionnels à l'intérieur des tissus d'intérêt. Ce programme fournit une analyse systématique des premiers phénotypes chez les jeunes souris, génétiquement modifiées. Dans l'avenir, cette méthode peut être appliquée à toutes les souris génétiquement modifiées devrait présenter à un phénotype AMD ou PD liés, ainsi que ceux d'étiologie inconnue qui apparaît ouvertement normale. La simplicité des essais permet de tester sans investissement important, mais peut être utilisé pour informer les autres sTUDES. En combinant les tests comportementaux avec le phénotypage cellulaire, il est possible de limiter le nombre de souris utilisées et de comparer directement les performances des animaux à l'état physiologique. Ce calendrier de phénotypage établit une première analyse qui peut être utilisé pour diriger l'objet d'études ultérieures.

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Acknowledgments

Le financement de cette recherche provient du Fonds de recherche du doyen Yale Medical School (JH) Foundation et médicale Rosebay. Nous remercions le Dr Claire Koenig pour l'aide avec des expériences comportementales. Génétiquement lignées de souris Engineered ont été générés à Ozgene (Perth, Australie).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol Decon (Fisher Scientific) 435541
50 ml conical tube Fisher Scientific 1443222
cotton balls Walmart
heat mat Sunbeam 0000756-500-000
Holding tray (ice cube tray) Walmart
Electronic stopwatch GOGO PC396
Plexiglass box constructed in workshop 12" by 12" 
Vixia HF R400 Camcorder Canon 8155B004
9 oz Clear Cups Walmart
1/4 inch wire mesh Home Depot 204331884 (online) / 554219 (in store) 12" by 12" 
Bubble wrap VWR 470092-416
Straight specimen forceps VWR 82027-438
Fine-tip dissecting forceps VWR 82027-408
Fine scissors VWR 82027-578
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710
10x phosphate buffered saline pH 7.4 American Bioanalytical AB11072-04000
Sucrose JT Baker 4072-01
superfrost slides Fisher Scientific 12-550-15
Hematoxylin Stain Solution Fisher Scientific (Ricca) 353016
Eosin Y Stain Solution Fisher Scientific (Ricca) 2845-32
Tris hydrochloride Sigma T3253
Tris American Bioanalytical AB02000-01000
Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate Sigma N8129
Nitrotetrazolium Blue chloride Sigma N6876
Acetone JT Baker 9006-05
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma S9390
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma S2378
VectaMount aqueous mounting medium Vector Labs H-5501-60
Cover glass Fisher Scientific 12-545-M 60 mm x 24 mm
AxioImager A1 microscope Zeiss
Video camera tripod Amazon
Optimal Cutting Temperature (OCT) Fischer Scientific 23730571
Cryostat Sectioning  Machine Leica  CM1900 Discontinued but since replaced by CM1950

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