El análisis fenotípico y funcional de las células reguladoras T activadas Aislado de la coriomeningitis linfocítica crónica por el virus ratones infectados

Immunology and Infection

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Park, H. J., Oh, J. H., Ha, S. J. Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice. J. Vis. Exp. (112), e54138, doi:10.3791/54138 (2016).

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Abstract

Células reguladoras T (T reg), que expresan Foxp3 como un factor de transcripción, son subconjuntos de células T CD4 +. Células T reg desempeñan papeles cruciales en la tolerancia inmune y el mantenimiento de la homeostasis mediante la regulación de la respuesta inmune. La función principal de las células T reg es la de suprimir la proliferación de células T efectoras T (FEP) y la producción de citoquinas tales como IFN-γ, TNF-α e IL-2. Se ha demostrado que la capacidad de las células T reg 'para inhibir la función de las células T eff es mayor durante la infección por patógenos persistente y el desarrollo del cáncer. Para aclarar la función de las células T reg en condiciones de reposo o inflamadas, una variedad de ensayos de supresión in vitro utilizando células de ratón o de reg T humanas se han ideado. El objetivo principal de este estudio es desarrollar un método para comparar las diferencias en el fenotipo y la función supresora de descanso entre y reg T activadasCélulas. Para aislar reg células T activadas, los ratones fueron infectados con el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) clon 13 (CL13), una cepa crónica de LCMV. Células T reg aisladas del bazo de ratones infectados por LCMV CL13 exhiben tanto el fenotipo activado y actividad supresora mejorada en comparación con las células en reposo T reg aisladas de ratones no tratados previamente. A continuación, se describe el protocolo básico para el análisis ex vivo fenotipo de distinguir reg células T activadas de descansar células T reg. Además, se describe un protocolo para la medición de la actividad supresora de las células T reg totalmente activadas.

Introduction

Células T reguladoras (Treg) expresan caja forkhead P3 (Foxp3) como un factor de transcripción para su desarrollo y función 1. Además, las células T reg expresan varias otras moléculas tales como CD25 2, el gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3) 3, inducida por glucocorticoides factor de necrosis tumoral receptor 4, y linfocitos T citotóxicos asociada a la proteína 4 (CTLA-4) 5 en su superficie o región intracelular. Durante la infección crónica con diversos tipos de agentes patógenos tales como virus, bacterias 6,7 8,9, y parásitos 10-12, o en el curso del desarrollo del cáncer de 13,14, las células T reg se diferencian en células activadas, se presentan función de supresión mejorada células de orientación efectora CD4 + y T CD8 +. Varios trabajos han sugerido que las células T reg expandidas y activadas contribuyen a los respons a alteraciones celulares T CD8 +e durante amigo retrovirus (FV), la infección 15-17. Células T reg inducidas-FV inhiben IFN-γ o expresión de granzima B y reactividad citotóxica de las células T CD8 + 15-17. Por otra parte, en un modelo de infección por el virus herpes simplex, se informó de que el agotamiento de células T CD4 + reg + CD25 resultó en la expansión de células T CD8 + específicos del virus y daños graves en los tejidos por la infiltración de células T CD4 + inmunopatogénicos 18-20.

Los ratones infectados crónicamente con la cepa clon 13 del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV CL13) 21 a 24 han sido ampliamente utilizados para caracterizar el fenotipo y la función de las células T efectoras (T eff) y células T reg durante la infección crónica por virus. Durante la infección por LCMV persistente, las células T eff específico del virus pierden progresivamente su función efectora y se convierten en células T agotados (T) exh. Por otra parte, Treg células refuerzan su capacidad para suprimir la respuesta de células T específica para el virus 25. La disminución de la capacidad de funcionamiento de las células T eff puede explicarse por varios factores tales como la regulación positiva de los receptores inhibidores sobre las células T eff, función alterada de las células presentadoras de antígeno, la producción de citocinas inmunorreguladoras, y aumento de la frecuencia o el incremento de la función de T reg 26 células. Entre los factores implicados en la supresión de células T, la muerte celular programada proteína-1 (PD-1) que expresan las células EXH T y las células T reg han sido ampliamente considerado como las características de persistencia de antígeno y el medio ambiente de supresión. Recientemente, se informó de que el bloqueo de la vía de PD-1 y la ablación de células T reg conducen a la función de células T mejorado y la disminución de la carga viral durante la infección crónica por LCMV 27. Además, las células T reg se activan durante la infección crónica de ratones con LCMV 23,25 25. PD-1 es altamente expresado en las células T reg así como las células T EXH, y el nivel de PD-1 expresada por las células T reg se correlaciona con la fuerza de su función supresora para inhibir la proliferación de células T 25.

A continuación, se describe un método para comparar las características de las células T reg activados aislados de ratones infectados con LCMV CL13 y reg células T en reposo aislados de ratones no tratados previamente. Por otra parte, explicamos una serie de procesos para separar las reg células T activadas y examinar su fenotipo ex vivo, así como medir su actividad supresora in vitro.

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Protocol

En este estudio, los ratones se mantuvieron en una instalación específica libre de patógenos del Centro de Investigación de Animales de Laboratorio de la Universidad de Yonsei de Yonsei. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de Corea Administración de Alimentos y Drogas utilizando los protocolos aprobados por el Comité Internacional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Investigación de Animales de Laboratorio de Yonsei en la Universidad de Yonsei.

1. Preparación de soluciones

  1. Preparar 2% de medio RPMI diluyendo suero bovino fetal (FBS) al 2% y penicilina-estreptomicina al 1% en RPMI
  2. Preparar medio RPMI completo. Para RPMI noticias agregar 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, 1% de L-glutamina, y 50 mM 2-mercaptoetanol.
  3. Prepare el buffer de fluorescencia de clasificación de células activadas (FACS). Para ello la solución salina es así, buffer fosfato suplemento (PBS) con 2% de FBS.
  4. Preparar tampón de aislamiento de células T. Para ello, complementar PBS con 2% de SFB y 2 mM ethylenediaminetetraaácido ascético.

2. Aislamiento de linfocitos del bazo

  1. Retire los bazos de los ratones no tratados previamente o infectados por el CL13 LCMV como se ha descrito previamente 19 y colocarlos en 60 mm x 15 mm placas de Petri que contenían 10 ml de 2% medio RPMI.
    NOTA: En estos experimentos de estudio, de 5 a 6 semanas de edad C57B1L / 6J hembra recibió 2 x 10 6 unidades formadoras de placa (pfu) de LCMV CL13 a través de una inyección intravenosa a través de la vena de la cola. Sacrificar los ratones en el día 16 después de la infección (16 d pi) 25. ratones ingenuos analizar emparejados-ge estaban en el mismo día.
  2. Colocar un filtro de células en un tubo de 50 ml y enjuague con 2 ml de 2% de medio RPMI. Coloque el bazo en el filtro de células 70 micras y se muelen usando el émbolo de una jeringa. Enjuague el filtro de células con 2 ml de 2% medio RPMI y sacarlo de tubo de 50 ml.
  3. Llenar el tubo con un 2% de medio RPMI y se centrifuga a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender elsedimento celular en 1 ml de tampón de lisis ACK. Se incuban las muestras a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
    Nota: El volumen de tampón de lisis ACK indicado arriba es para un bazo. Ampliar el volumen en consecuencia para las muestras de bazo agrupadas.
  4. Llenar el tubo con un 2% de medio RPMI y se centrifuga a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender las células a una densidad de 1 x 10 7 células / ml en medio RPMI completo.
    NOTA: Para el recuento de células vivas, células de tinción con azul de tripano y cuenta sólo las células vivas que no están teñidas utilizando hemocitómetro.

3. Fenotipificación de esplénica convencional T (T conv) Las células y las células T reg

NOTA: Antes de aislamiento de células T reg, examinar el fenotipo de linfocitos esplénicos aislados de los ratones no tratados previamente o infectados por tinción de las células con varios anticuerpos y análisis de los mismos por citometría de flujo.

  1. Transferencia de 50 l de las células(5 x 10 5 células) entre los linfocitos esplénicos totales en cada pocillo de una nueva placa de 96 pocillos de fondo en U y añadir 150 l de tampón FACS por pocillo. Centrifugar a 300 xg durante 2 minutos a 4 ° C.
  2. Descartar el sobrenadante. Agitar el sedimento de células y añadir 200 l de tampón de FACS por pocillo. Centrifugar a 300 xg durante 2 minutos a 4 ° C (2 veces).
  3. Preparar el cóctel de anticuerpos para marcadores de superficie celular de tinción en 50 l de tampón FACS por pocillo con los siguientes anticuerpos y reactivos. colorante Anti-CD4 violeta, colorante verde Anti-CD25, anti-PD-1 de colorante violeta, Anti-CD8-PerCP Cy5.5 reactivo de detección de tinte y la viabilidad celular en el infrarrojo cercano (IR) colorante reactivo fluorescente.
    NOTA: A fin de analizar el fenotipo de las células T reg activados, anti-CD103 23,25 se puede añadir para la tinción de la superficie celular marcador.
  4. Resuspender el sedimento celular con 50 l de cóctel de anticuerpo por pocillo. Incubar durante 20 minutos en la oscuridad a 4 ° C. Se lavan las células dos veces contampón FACS mediante centrifugación a 300 xg durante 2 minutos a 4 ° C.
  5. Después de la etapa de lavado final, se decanta el sobrenadante y fijar las células durante 20 min en la oscuridad a 4 ° C con 100 l de tampón de fijación preparados de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  6. Lavar las células dos veces con el tampón de lavado de permeabilización (preparado de acuerdo con el protocolo del fabricante) por centrifugación a 300 xg durante 2 minutos a 4 ° C.
  7. Preparar la solución de anticuerpos para la tinción intracelular Foxp3, y volver a suspender el sedimento celular con 50 l de solución de anticuerpo Anti-Foxp3.
    NOTA: Para analizar más a fondo los fenotipos de conv T y las células T reg, anti-CTLA se puede agregar en este paso.
  8. Incubar durante 20 minutos en la oscuridad a 4 ° C y repetir el paso 3.6. Después de la etapa de lavado final, resuspender el sedimento celular en 200 l de tampón de FACS y examinar el fenotipo de las células por citometría de flujo 25.
  9. Puerta de la población de células vivasción. Para el análisis de los fenotipos de las células T durante la infección conv LCMV CL13, examinar la frecuencia de Foxp3 - PD-1 + células entre las células CD4 + o T CD8 +.
    NOTA: En base a los resultados experimentales, el porcentaje de Foxp3 - PD-1 + es más del 50% en las poblaciones de células CD4 + y CD8 + a los 16 d pi con LCMV CL13.
    1. Para analizar la frecuencia y fenotipos de las células T reg, examinar las frecuencias de Foxp3 + o Foxp3 + PD-1 + células entre las células T CD4 +.
      NOTA: En base a los resultados experimentales, el porcentaje de Foxp3 + o células Foxp3 + PD-1 + es más de 20% en la población de células T CD4 +, respectivamente.

4. Aislamiento de células Treg CD4 + CD25 + T

NOTA: Los volúmenes de todos los reactivos indicados a continuación es para unaa partir del número de células de 1 x 10 7 esplenocitos totales.

  1. Preparar las células como se describe en la sección 2, utilizando ratones infectados crónicamente ingenuos y LCMV. Se lavan las células por adición de 10 ml de tampón de aislamiento de células T. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante por completo y volver a suspender el sedimento celular en 40 l de tampón.
  2. Para el enriquecimiento de células T CD4 + utilizando el sistema de separación celular magnética, añadir 10 l de cóctel de biotina-anticuerpo y mezclar bien. Incubar durante 10 minutos a 4 ° C.
  3. Añadir 30 l de tampón, 20 l de anti-biotina micro-perlas para el etiquetado de las células no CD4 + T y 10 l de anticuerpo CD25-PE para el etiquetado fluorescente de células CD25 +. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos en la oscuridad.
  4. Añadir 2 ml de tampón y pasar las células a través de un filtro de 40 micras de células en un nuevo tubo de 50 ml para eliminar los restos celulares. Se lavan las células por centrifugación a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.Eliminar el sobrenadante por completo y volver a suspender el sedimento celular en 500 l de tampón a una densidad de hasta 1,25 x 10 8 células.
  5. Aplicar las células en la columna y recoger las células no marcadas que pasan a través de la columna. Lavar la columna mediante la adición de 2 ml de tampón y se centrifuga a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante por completo y volver a suspender las células T CD4 + aisladas en 90 l de tampón.
  6. Para el marcaje magnético de células CD25 +, añadir 10 l de microperlas anti-PE, mezclar bien e incubar durante 15 minutos en la oscuridad a 4 ° C.
  7. Añadir 2 ml de tampón y se lavan las células por centrifugación a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante por completo y volver a suspender el sedimento celular en 500 l de tampón a una densidad de células de hasta 1 x 10 8.
  8. Para enriquecer los reg células T CD4 + CD25 +, aplique las células en la columna de selección positiva, y se lava la column mediante la adición de 2 ml de tampón. Repita el lavado tres veces.
  9. Cuando la columna está vacía después de la última etapa de lavado, añadir 1 ml de tampón en la columna, y expulsar el marcado magnéticamente CD4 + CD25 + células utilizando el émbolo.
  10. Repita los pasos 4.8 a 4.9 para mejorar la pureza de los aislados reg células CD4 + CD25 + T. Se lavan las células con tampón FACS mediante centrifugación a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células aisladas reg CD4 + CD25 + T en una concentración de 2 x 10 6 células / ml en medio RPMI completo.
  11. Para comprobar la pureza de las células T reg + aisladas-CD4 + CD25, utilizar 2 x 10 5 células de los totales reg células aisladas-CD4 + CD25 + T. Teñir las células con 50 l de tampón FACS que contiene anti-CD4 FITC y la viabilidad celular reactivo de detección de cerca-IR colorante reactivo fluorescente.
    NOTA: CD25 ya se marcó con PE durante el aislamiento.
  12. Incubar durante 20 minutos en la oscuridad a 4 ° C. Se lavan las células con tampón FACS mediante centrifugación a 300 xg durante 2 minutos a 4 ° C. Después del lavado, resuspender el sedimento celular en 100 l de tampón de FACS y comprobar la pureza por citometría de flujo.
  13. Puerta de la población de células vivas. Para analizar la pureza de las células T reg, confirmar el porcentaje de células CD4 + CD25 +.
    NOTA: En base a los resultados experimentales, el porcentaje de células CD4 + CD25 + entre las células purificadas es por encima de aproximadamente 80%.

5. Aislamiento de células T CD8 + y etiquetado de las células T CD8 +

NOTA: Los volúmenes de todos los reactivos se indican a continuación son para un número de células a partir de 1 x 10 7 esplenocitos totales.

  1. Preparar las células como se describe en la sección 2 utilizando ratones no tratados previamente. Se lavan las células mediante la adición de 10 ml de piel de ante de aislamiento de células Ter. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante por completo, y volver a suspender el sedimento celular en 40 l de tampón.
  2. Para el aislamiento de células T CD8 + usando el sistema de separación celular magnética, añadir 10 l de cóctel de biotina-anticuerpo para el etiquetado + T cell no CD8 y mezclar bien. Incubar durante 5 min a 4 ° C.
  3. Añadir 30 l de tampón y 20 l de microperlas anti-biotina. Mezclar bien e incubar durante 10 minutos a 4 ° C.
  4. Aplicar las células en la columna y recoger las células no marcadas que pasan a través de la columna. Lavar la columna mediante la adición de 2 ml de tampón tres veces.
  5. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante por completo y volver a suspender las células T CD8 + aisladas en 2 ml de tampón.
  6. Para comprobar la pureza de las células aisladas, preparar 50 l de solución de anticuerpo en tampón FACS. Volver a suspender las 2 x 10 5 células aisladas entre T CD8 + cells en 50 l de solución de anticuerpo.
    NOTA: Para preparar la solución de anticuerpo, añadir anti-CD8 FITC, y el reactivo de detección de la viabilidad celular (fluorescente cerca-IR colorante reactivo) en tampón de FACS.
  7. Incubar durante 20 minutos en la oscuridad a 4 ° C. Se lavan las células con tampón FACS mediante centrifugación a 300 xg durante 2 minutos a 4 ° C. Después del lavado, resuspender el sedimento celular en 100 l de tampón FACS, y comprobar la pureza de las células mediante citometría de flujo.
  8. Puerta de la población de células vivas. Para comprobar la pureza de las células T CD8 +, confirmar el porcentaje de células T CD8 +.
    NOTA: En base a los resultados experimentales, el porcentaje de células CD8 + entre las células purificadas es por encima de aproximadamente 90%.
  9. Añadir PBS a las células T CD8 + aisladas. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante. Resuspender las células T CD8 + aisladas a una concentración de 1 x 10 7 células / ml en PBS.
  10. Para etiquetar la ce T CD8 +LLS para el ensayo de supresión in vitro, diluir la proliferación de células de colorante de seguimiento violeta en PBS para obtener una concentración de 5 mM a temperatura ambiente.
    NOTA: Los excitación y de emisión aproximados picos de la proliferación celular colorante guía violeta utilizado en el estudio son 405 y 450 nm, respectivamente.
  11. Mezclar volúmenes iguales de bien la proliferación de células de colorante de seguimiento violeta (5 M) y la suspensión de células (1 x 10 7 células / ml de células T CD8 +) en un tubo de 15 ml, y se incuba a 20 min a 37 ° C. Vortex el tubo cada 10 min.
  12. Llenar el tubo con medio RPMI completo frío, y dejar el tubo durante 10 min a RT. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a TA. Eliminar el sobrenadante por completo, y volver a suspender las células a una concentración de 2 x 10 6 células / ml con medio RPMI precalentado completas. Se incuban las células durante 15 min a TA.

6. Configuración del ensayo de supresión in vitro utilizando células CD4 + CD25 + T <sub> Reg y células T CD8 +

  1. Para preparar anti-CD3 / CD28 perlas recubiertas de, transferir el volumen apropiado de perlas magnéticas a una 15 ml de tubo (2,5 l / 1 x 10 5 células). Añadir un volumen igual de PBS y mezclar. Lavar por centrifugación a 300 xg durante 2 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante. Diluir las perlas magnéticas en medio completo (50 l / pocillo).
  2. Alícuota de 50 l de reg células + T CD4 + CD25 por pocillo de placa de 96 pocillos de fondo en U (1 x 10 5 células / pocillo). Añadir 50 l de células T CD8 + como de respuesta T (T resp) células por pocillo (1 x 10 5 células / pocillo). Añadir 50 l de perlas de anti-CD3 / CD28 recubierto diluido en por pocillo.
    NOTA: En este paso, la etiqueta y configurar los pocillos de control de la siguiente manera: "Sólo no estimulada de células T CD8 +" sin perlas anti-CD3 / CD28-revestido; "Sólo las células T CD8 +" con anti-CD3 / CD28 perlas recubiertas con; Sólo "células T CD8 +"Con perlas de CD28 con recubrimiento anti-CD3 /;". Células T reg única "con-anti CD3 perlas / CD28 revestido con células T reg pueden diluirse por medio completo y co-cultivadas con células T resp en una proporción diferente de T resp células: las células T reg (1: 0,25-1: 1).
  3. Añadir 50 l o volumen apropiado de medios de comunicación en todos los pocillos hasta un volumen total de 200 l. Cubrir la placa con papel de aluminio y se incuba en un incubador de CO2 a 37 ° C durante 72 horas.

7. Análisis de las células CD8 + T de proliferación celular y la producción de citoquinas de las células T CD8 +

  1. Para el análisis de la producción de citoquinas, después de 3 días de cultivo, separar el sobrenadante de cada pocillo a otra placa y realizar ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
    NOTA: El sobrenadante puede alícuotas y se almacenó a -70 ° C. En este experimento, se utilizó la placa recubierta con anticuerpo anti-ratón de IFN-γ para detectar IFN-γ acuerdo produccióning el protocolo del fabricante s. Para determinar la producción de IFN-γ de la proliferación de células T CD8 + en un solo nivel celular, tinción intracelular de citoquinas se puede realizar.
  2. Después de separar el sobrenadante de cada pocillo, se lava la placa que contiene las células con tampón FACS y se centrifuga a 300 xg durante 2 minutos a 4 ° C (3 veces).
  3. Después del lavado, descartar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular con 50 l de cóctel de anticuerpos para la tinción de las células T CD8 + proliferado. Incubar durante 20 minutos en la oscuridad a 4 ° C.
    NOTA: Para preparar cóctel de anticuerpos, añadir anti-CD4 FITC, anti-CD8-PerCP Cy5.5, y el reactivo de detección de la viabilidad celular (fluorescente cerca-IR colorante reactivo) en tampón de FACS.
    NOTA: Los anticuerpos contra diversos marcadores tales como CD44 o CD69 se pueden combinar con otros anticuerpos para confirmar la activación de las células T CD8 +. Recuerde que las células T CD8 + que ya han sido etiquetados con la proliferación celular de seguimiento violet tinte en el Paso 5.10.
  4. Lavar dos veces por centrifugación a 300 xg durante 2 min a 4 ° C. Después de la etapa de lavado final, descartar el sobrenadante, y fijar las células durante 20 min en la oscuridad a 4 ° C con 100 l de tampón de fijación.
  5. Lavar dos veces por centrifugación a 300 xg durante 2 min a 4 ° C. Resuspender las células con 200 l de tampón de FACS y se mide la proliferación de las células T CD8 + marcados con colorante de seguimiento de violeta de proliferación celular por citometría de flujo.
    1. Puerta de la población de células T CD8 + entre las células vivas. Medir los porcentajes de células divididas y no divididas de acuerdo con la dilución de la proliferación de las células de colorante de seguimiento de violeta y la dilución de células T CD8 + de acuerdo con la siguiente ecuación. % De inhibición = [(% de células proliferadas T CD8 + en la ausencia de células T reg -% de las células T CD8 + proliferado en la presencia de células T reg) / (% de células T CD8 + proliferado enla ausencia de células T reg)] x 100. analizar más a fondo los datos mediante el uso de la citometría de flujo del software 25.

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Representative Results

Hemos generado ratones con infección por el virus persistente mediante la inyección de ellos con 2 x 10 6 pfu de LCMV CL13 por vía intravenosa. Para investigar los cambios fenotípicos en las células T reg y las células T durante la infección conv virus crónica, linfocitos esplénicos obtenidos de ratones no tratados previamente y infectadas se tiñeron con diversos anticuerpos y se analizaron por citometría de flujo. A los 16 d PI, PD-1 se regula positivamente tanto en Foxp3 - T CD4 + conv (Figura 1, panel superior) y Foxp3 - células T CD8 + conv (Figura 1B, panel superior). La frecuencia de células T reg Foxp3 + CD4 + era dos veces mayor en los ratones infectados con LCMV CL13 que en los ratones no tratados (figura 1A). En particular, la mayoría de las células Foxp3 + Treg CD4 + T muestran el fenotipo activado, que expresan altos niveles dePD-1 en este punto del tiempo (Figura 1A).

Para el ensayo de supresión in vitro, se requiere un número considerable de células T CD8 + CONV y reg células CD4 + T + CD25. Para obtener células T CD8 + marcados con colorante de seguimiento de la proliferación violeta 1 x 10 7 células, se agruparon los esplenocitos de dos bazos de ratones no tratados previamente. Para obtener 2 x 10 6 o 3 x 10 6 de reg células + T CD4 + CD25, al menos tres bazos de ratones ingenuos y infectadas con LCMV CL13, respectivamente, se agruparon. Células T CD8 + como las células T resp se separaron con éxito sin contaminación significativa con otras células inmunes (Figura 2A). Células T reg también podrían estar aislados, con una población dominante de las células T CD25 + CD4 + con más de 80% de pureza (Figura 2B).

Para comparar la función supresora de las células T reg ingenuos y crónicas, el aislado T reg y células resp T se incubaron juntos bajo la estimulación con perlas anti-CD3 / CD28-revestido a 37 ° C durante 3 días. % De inhibición de la proliferación de células T CD8 + resp se incrementó en una célula T reg éstos dependiente manera (Figura 3A). Cuando las células T CD8 + resp fueron co-cultivadas con células T reg crónicas en una proporción de 1: 1, la proliferación de las células T CD8 + resp se inhibió significativamente (Figura 3B). IFN-γ la producción por las células T CD8 + resp también fueron significativamente inhibido cuando las células T CD8 + resp fueron co-cultivadas con células T reg activados procedentes de ratones infectados de forma crónica en lugar de con descansando reg células T de ratones ingenuos en un T reg (Figura 3C).

Figura 1
Figura 1: Los fenotipos de las células CD4 + y T CD8 + en el bazo de los ratones no tratados previamente o ratones infectados con CL13 LCMV en 16 d pi (A) Expresión de PD-1 o CD25 en Foxp3 - T CD4 + conv y Foxp3 + CD4 + las células T reg. (B) La expresión de PD-1 o CD25 en Foxp3 - conv células T CD8 +. linfocitos esplénicos se tiñeron con anticuerpos contra CD4, CD8, CD25, PD-1, y Foxp3. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. El panel A se ha modificado a partir de 25 como referencia. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: purezas de células resp T aisladas de los ratones no tratados previamente y las células T reg aisladas de ratones no tratados previamente o infectados por LCMV CL13 (A) Porcentaje de células T CD8 + después del aislamiento.. (B) Porcentaje de reg células T CD4 + que expresan CD25-después del aislamiento. Cada cuadrante en (B) se determinó mediante los niveles de expresión de CD4 y CD25. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Efecto de las células T reg activado en respuesta de las células T CD8 + (A)% de inhibición de las células T CD8 + co-cultivadas con células T reg en una forma dependiente de la dosis de células T reg.. (B) La proliferación de células T CD8 + co-cultivadas con células T reg en 1: 1 de relación. (C) la producción de IFN-γ de células T CD8 + co-cultivadas con células T reg en una forma dependiente de la dosis de células T reg. La proliferación de células T CD8 + se midió por dilución de la proliferación celular de colorante de seguimiento violeta en las células T CD8 + proliferado y la secreción de IFN-γ se evaluó por ELISA. Células T CD8 + marcados con colorante de seguimiento de violeta de proliferación celular se estimularon con anti-CD3 / CD28 perlas recubiertos durante 3 días en la ausencia o presencia de T + co-cultivadas con y sin células T reg, respectivamente. Rellenos picos grises en el histograma indican la proliferación de las células T CD8 + co-cultivadas sin las células T reg. Cada grupo fue diseñado por triplicado. Las barras representan la media ± SEM. Esta cifra ha sido modificado a partir de 25 como referencia. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aunque existe sólo un pequeño número de células T reg en ratones y seres humanos, es importante para entender su función ya que desempeñan un papel crucial en la regulación de la respuesta inmune y el mantenimiento de la tolerancia inmune. El número y supresores funciones de T reg células aumenta durante una infección por el virus crónica 15-20, así como la progresión del cáncer 13,14. Esto es probablemente debido a la estimulación de antígeno continuado. Para evaluar la T reg células funcionan bajo persistencia de antígenos y desarrollo de la enfermedad, su actividad supresora necesita ser medida.

A continuación, se describe un protocolo para analizar el fenotipo ex vivo de las células T reg y medir su actividad supresora usando un sistema de co-cultivo in vitro de células T CD8 + y células T reg. Los pasos críticos en el protocolo actual son el análisis y el aislamiento de las células T reg. T en vivo y recién aisladas in vitro. También se examinaron los fenotipos de T conv y las células T reg durante una infección crónica por el virus. Células conv t, es decir, Foxp3 - células CD4 + y T CD8 + mostraron una disminución en la actividad celular después de la infección crónica por virus (Figura 1). La expresión de PD-1 se regula positivamente tanto en las poblaciones de células T conv. Aumenta el número de células T reg y sobre regulación de la expresión de PD-1 son las características de la respuesta inmune durante una infección por el virus crónica. Además, los anticuerpos para otros receptores inhibidores tales como TIM-3 y CTLA-4 se pueden utilizar en combinación con PD-1 para examinar el fenotipo de las células T por FACS después de la infección de virus choric.

Con el fin de investigar la actividad supresora, las células resp T y las células T reg fueron co-cultivadas en una proporción de 1 a 1. Co-cultivo con T reglas células de ratones infectados crónicamente redujeron significativamente la proliferación de células T CD8 + y la secreción de IFN-γ en comparación con las células T reg de ratones no tratados previamente. Esto implica que la producción de citoquinas y la proliferación de las células T CD8 + co-cultivadas con células T reg están inversamente relacionados con la función supresora de las células T reg. Aunque este protocolo recomienda el uso de un sistema de separación celular magnética para el aislamiento de células T reg, la contaminación con reg células no T no puede ser descartado. Las células T reg obtenidos de ratones reportero Foxp3-GFP 28-30 son mejores candidatos para investigar con precisión la función de las células T reg que el sistema de separación celular magnética, como CD25 a menudo se sobreexpresa en las células T reg T CD4 + conv así como activados.

La función supresora de las células T reg ha sido evaluada por varios in vitroLos ensayos de supresión 16,28,31-34. La ventaja del ensayo de supresión in vitro es que se evalúa el efecto directo de las células T reg en la inhibición de la respuesta de células T CD8 +, ya que sólo las células T son resp co-cultivadas con células T reg. Además de las células T CD8 +, la CD25 - células T CD4 + puede utilizarse en lugar de las células T resp 25. Los efectos de reg T o células T conv en las células inmunes, tales como células dendríticas o células asesinas naturales pueden ser evaluados mediante la variación de las condiciones experimentales.

Moléculas tales como el CD103 35, LAG-3 36, glicoproteína A repeticiones predominantes 37, CD43 38, CD11a 38, o de las células asesinas lectina-como subfamilia de receptores miembro de G 1 38 han sido utilizados como marcadores de reg células T activadas en enfermedades específicas. En este protocolo, se utilizó PD-1 como unaindicador para identificar activa las células T reg durante la infección crónica por el virus. Este protocolo se puede utilizar para el análisis multifacéticos (fenotípicas y funcionales) de las células T reg en condiciones específicas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
FITC Rat Anti-Mouse CD4 RM4-5 BD Biosciences 553047
Cytofix/Cytoperm BD Biosciences 554714
U-Bottom Tissue Culture Plates BD Biosciences 353077
Fixation buffer BD Biosciences 554655
FITC Rat Anti-Mouse CD25 7D4 BD Biosciences 553072
Cell strainer, 70 mm BD Biosciences 352350
Cell strainer, 40 mm BD Biosciences 352340
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) 29F.1A12 BioLegend 135217
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 RM4-5 Biolegend 100547
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3  FJK-16s eBioscience 17-5773
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set eBioscience 00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a 53-6.7 eBiosicence 45-0081
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA eBiosicence BMS606
RPMI 1640 GE Life Sciences SH30027
PBS (1x) GE Life Sciences SH30256
ACK Lysing Buffer Gibco A10492-01
L-Glutamine, 200 mM solution Gibco  25030
Penicillin-Streptomycin, 10,000 U/ml Gibco  10378-016
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Life technologies L-34975
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-104-075
CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-091-041
MACS Separation Columns, LD columns Miltenyibiotec 130-042-901
MACS Separation Columns, LS columns Miltenyibiotec 130-042-401
EDTA, 0.5 M (pH 8.0) Promega V4231
2-Mercaptoethanol Sigma Life Science M7522
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30919.03
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit Thermo Fisher Scientific C34557
BD Canto II flowcytometer BD Biosciences
Flowjo TreeStar
Hematocytomer Marienfeld superior

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References

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