التصور-المربوطة السطحية الكبيرة جزيئات الحمض النووي مع الحمض النووي البروتين الفلوري ملزم الببتيد

1Department of Chemistry and Interdisciplinary Program of Integrated Biotechnology, Sogang University
Published 6/23/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Lee, S., Jo, K. Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide. J. Vis. Exp. (112), e54141, doi:10.3791/54141 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

وقد استخدمت التصور من جزيئات الحمض النووي الكبيرة المربوطة على الزجاج أو حبة الأسطح للتحقيق في التفاعلات الحمض النووي والبروتينات، وديناميات البروتين على الصخور القائمة على الحمض النووي، 1،2 والفيزياء البوليمر. 3،4 منصة لاحد المربوطة جزيئات الحمض النووي كبيرة لديها عدد قليل متميزة المزايا بالمقارنة مع الطرق الحمض النووي تجميد الأخرى. 5 الأولى، وهو جزيء الحمض النووي كبير المربوطة على سطح يحتوي على التشكل العشوائي لفائف الطبيعية دون تدفق القص، والتي هي ذات أهمية حاسمة لبروتين الحمض النووي ملزم بالاعتراف الموقع الملزمة. ثانيا، فمن السهل جدا لتغيير البيئة الكيميائية حول جزيئات الحمض النووي لسلسلة من التفاعلات الإنزيمية في غرفة التدفق. ثالثا، تدفق القص ميكروفلويديك يدفع الحمض النووي الجزيئي تمتد ما يصل الى 100٪ من طول محيط كامل، والتي من الصعب جدا تحقيقه من خلال استخدام استطالة الحمض النووي بديلة النهج مثل تجميد سطح 6 و الحبس نانوية. 7 وstretche بالكاملويقدم د الحمض النووي جزيء أيضا المعلومات الموضعية التي يمكن أن تكون مفيدة لرصد تحركات الأنزيمية على خريطة الجينوم.

ومع ذلك، فإن نهج الحمض النووي الربط لديه عيب حرج في أن الصبغة الإقحام مثل يويو-1 يسبب عموما جزيئات الحمض النووي المربوطة لا بد من كسرها بسهولة بواسطة ضوء مضان الإثارة. عموما، جزيئات الحمض النووي كبيرة يجب أن تكون ملطخة صبغة الفلورسنت لرؤية تحت المجهر الفلورسنت. لهذا الغرض، يويو-1 أو غيرها من الأصباغ سلسلة توتو تستخدم في المقام الأول لأن هذه الأصباغ يتألق فقط عندما يقحم الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل. 8 ومع ذلك، فمن المعروف أن صبغ الإقحام مكرر يسبب الناجم عن ضوء الحمض النووي الصور الانقسام ل من إقحام من fluorophores 9 علاوة على ذلك، جزيئات الحمض النووي الملون fluorescently المربوطة على سطح أكثر هشاشة منذ التدفقات القص يمكن أن تمارس كسر القوات على التحرك بحرية جزيئات الحمض النووي. لذلك، قمنا بتطوير FP-DBP كرواية DNA-تلطيخ صبغ البروتين لتصوير جزيئات الحمض النووي الكبيرة المربوطة على السطح. وميزة استخدام FP-DBP هو أنه لا يسبب الصور انشقاق من جزيئات الحمض النووي التي فإنه يلزم 10 وبالإضافة إلى ذلك، FP-DBP لا يزيد طول كفاف من الحمض النووي، في حين الأصباغ الإقحام مكرر زيادة طول محيط بنحو 33٪.

هذه طريقة الفيديو يقدم المنهج التجريبي لالربط جزيئات الحمض النووي كبيرة على سطح PEG-البيوتين الشكل 1 يوضح نهج مختلفة من الربط الحمض النووي مع نهايات حادة ونهايات لزجة. وبالتالي، يمكن تطبيق هذه الطريقة تلطيخ إلى أي نوع من جزيء الحمض النووي الشكل 2 يصور التمثيل التخطيطي للجمعية غرفة التدفق التي يمكن السيطرة عليها من قبل ضخ حقنة لتوليد تدفقات القص لتمتد جزيئات الحمض النووي وكذلك لتحميل الكيميائية وانزيم الحلول. يوضح الشكل (3) الميكروسكوب من جزيئات الحمض النووي بكامل طاقتها المربوطة على PEGylatسطح الطبعة 11 وملطخة FP-DBP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الحمض النووي Biotinylation

  1. Biotinylation من الحمض النووي العضوية صريحا باستخدام محطة ترانسفراس (TDT)
    ملاحظة: استخدام T4 الحمض النووي (166 KBP)، وهو الحمض النووي العضوية حادة.
    1. إضافة 5 ميكرولتر من 2.5 ملي كوكلي 5 ميكرولتر من 10 × رد فعل العازلة، 0.5 ميكرولتر من 10 ملي البيوتين-11-dUTP، 0.5 ميكرولتر من ترانسفيراز الطرفي (10 وحدة)، و 0.5 ميكرولتر من T4 الحمض النووي (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى خليط التفاعل. جعل إلى وحدة تخزين النهائي من 50 ميكرولتر من خلال إضافة 38.5 ميكرولتر من المياه.
    2. احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: تمديد فترة رد الفعل قد تنتج الحمض النووي المزدوج المربوطة، أي أنه من الممكن أن biotins والموسومة عند كلا الطرفين.
    3. وقف رد فعل عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من 0.5 M EDTA، ودرجة الحموضة (8).
    4. الحفاظ على أنبوب في 4 درجات مئوية.
  2. Biotinylation من الحمض النووي العضوية لزجة عن طريق الحمض النووي يغاز
    ملاحظة: استخدام λ الحمض النووي (48.5 KBP)، وهو الحمض النووي لزجة نهاية. <رأ>
  3. إضافة 1 ميكرولتر من يغاز T4 DNA، 5 ميكرولتر من العازلة ربط 10 ×، 1 ميكرولتر من 25 نانوغرام / ميكرولتر الحمض النووي λ فج، وإضافة 43 ميكرولتر من الماء لجعل الحجم النهائي من 50 ميكرولتر.
  4. الحفاظ على أنبوب في 4 درجات مئوية.

2. Functionalized اشتقاق السطحية

ملاحظة: من أجل حبل حدا لجزيء الحمض النووي على سطح الزجاج، وsilanized مجموعة الأمينات الأولية على ساترة تليها البيوتين PEG الطلاء كما هو مبين في الشكل رقم 1 هذه العملية من مضاد مهمة لجزيء واحد التصوير الحمض النووي لأنه يمكن أن تقلل بشكل كبير من الضوضاء العشوائية التي تم إنشاؤها عن طريق الحجز من جزيئات غير مرغوب فيها على السطح.

  1. سمكة البيرانا تنظيف
    ملاحظة: الحلول سمكة البيرانا تتفاعل بقوة مع المواد العضوية، ولذلك يجب التعامل معها بحذر، بعد إرشادات السلامة المناسبة.
    1. مكان coverslips على (PTFE) رف تترافلوروإيثيلين، ويحملهم بذ PTFE موضوع ختم الشريط بالطول، نصف على حافة السطوح ونصف على الرف. بعد التفاف، وترك قطعة طويلة (~ 5 سم) من الشريط للتعامل مع رف أثناء إجراء التنظيف.
    2. ملء كوب زجاج 1 لتر مع 350 مل من H 2 SO 4 و 150 مل من H 2 O 2 لجعل الحل البيرانا في غطاء الدخان. وضع رف في حل سمكة البيرانا لمدة 2 ساعة.
    3. حل فارغة سمكة البيرانا من الدورق، وcoverslips شطف جيدا بالماء منزوع الأيونات حتى درجة حموضة الماء في الكأس يصل محايد. استخدام الشرائط ورقة الرقم الهيدروجيني.
    4. يصوتن رفوف من زلات غطاء في الماء دورق يحتوي على، لمدة 30 دقيقة. المياه الفارغة من الكأس قبل silanization الأمينية. استخدام 75 W السلطة صوتنة لتنظيف وderivatize ركائز الزجاج.
  2. Aminosilanization على سطح الزجاج
    1. إضافة 2 مل من N - [3- (trimethoxysilyl) بروبيل] الإيثيلين و 10 مل من حمض الخليك الجليدي إلى 200 ملمن ميثيل الكحول في وعاء البولي بروبلين نظيفة لإعداد الحل aminosilanization.
    2. ضع coverslips تنظيفها في حاوية البولي بروبلين. يهز لهم في 100 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    3. يصوتن الكأس مع زلات غطاء derivatized لمدة 15 دقيقة في 75 دبليو يهز لهم في 100 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    4. تفريغ الحل من الكأس، وشطف coverslips بعناية، مرة واحدة مع ميثيل الكحول، ومرتين مع الكحول الإيثيلي. متجر coverslips في الكحول الإيثيلي واستخدامها في غضون أسبوعين.
  3. من مضاد ساترة
    1. جعل 10 مل من 0.1 M بيكربونات الصوديوم (NaHCO 3). تصفية حل مع فلتر حقنة 0.22 ميكرون.
    2. حل 2 ملغ من كربونات البيوتين PEG-succinimidyl (البيوتين PEG-SC) و 80 ملغ من فاليرات PEG-succinimidyl (MPEG-SVG) في 350 ميكرولتر من NaHCO 3. استخدام أنبوب حماية خفيفة.
    3. دوامة أنبوب بقوة لمدة 10 ثانية، وأجهزة الطرد المركزي أنه في 10000 × ز لمدة 1 دقيقة لإزالة الفقاعات.
    4. شطف شريحة زجاجية مع الأسيتون، تليها الشطف مع الكحول الإيثيلي. تسمح الشريحة في الهواء تجف تماما.
    5. وضع قطرة (50 ميكرولتر) من حل PEG على شريحة زجاجية نظيفة. تغطية قطرات بلطف مع الأمينية silanized انزلاق الغطاء، دون إحداث أي فقاعات.
    6. مكان الشرائح لمدة 3 ساعة ليلة وضحاها في الظلام، و-جهت كذلك غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة. استخدام حامل ماصة فارغة بوصفها الدائرة، مع الماء في القاع. ختم حل PEG المتبقي في الأنبوب والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية.
    7. شطف ساترة مضاد للفيروسات جيدا بالماء منزوع الأيونات. تخزينها في مكان مظلم وجاف حتى الاستخدام.

3. تجميع الدائرة التدفق

  1. افتعال حامل الاكريليك لكمات، كما في الشكل (2). تأكد من أن قطر إدراج الأنابيب هو 0.762 ملم، وتعيين ثقب واحد هو مدخل والآخرمنفذ (الشكل 2).
  2. وضع الوجهين شرائط الشريط لزجة (عرض 5-6 ملم) على حامل الاكريليك (الشكل 2)، محاذاة عموديا إلى مدخل ومخرج حفرة، وليس تكدير أي ثقوب القناة. استخدام هذه الشرائط الشريط كما الجدران متعدد القنوات لجعل الدوائر. فرك الشريط باستخدام طرف الماصة.
  3. وضع ساترة مضاد للفيروسات على رأس لجعل غرف التدفق، مع الجانب مضاد للفيروسات لأسفل.
  4. لمنع أي حل من التسرب، اضغط على أعلى ساترة فوق المنطقة حيث يتم وضع الأشرطة على الوجهين. إضافة سريع الجافة الغراء الايبوكسي لإغلاق حواف الدائرة في أعلى وأسفل (اللون الأصفر في الشكل 2).
  5. قم بتوصيل قطعة قصيرة (2.5 سم) من أنابيب (القطر الخارجي، OD، 0.042 ") لحقنة الغاز محكم وختم مشترك مع الغراء الايبوكسي.
  6. توصيل أنابيب مرنة طويلة (OD: 0.03 ") إلى أنابيب مرتبطة حقنة وختم مشترك مع الغراء الايبوكسي.
  7. ملء TUBIترتبط نانوغرام إلى الحقنة بالماء DI. تأكد من وجود أي فقاعة الهواء.
  8. إدراج الأنابيب في الحفرة من غرفة التدفق مختومة مع الغراء الايبوكسي.
  9. وضع تلميح الأصفر (200 غيض ميكرولتر) على ثقب آخر كمستودع.

4. تحميل نموذج في غرفة تدفق

ملاحظة: يمكن استبدال Neutravidin مع البروتينات أفيدين أخرى مثل streptavidin. كل ردود الفعل لا يمكن أن يؤديها في درجة حرارة الغرفة، ما لم يتم ذكر ذلك. أخذ محلول العينة في تلميح الأصفر، وتثبيت طرف مع الحل على ثقب حامل الاكريليك (الشكل 2B).

  1. ضبط معدل تدفق ضخ حقنة في 50 ميكرولتر / دقيقة. تحميل 20 ميكرولتر من البروتين أفيدين (25 ميكروغرام / مل في حل T50، تريس 10 مم، كلوريد الصوديوم 50 ملي، ودرجة الحموضة 8)، والاحتفاظ بها لمدة 10 دقيقة.
  2. تحميل 20 ميكرولتر من oligodeoxynucleotides المعقدة البيروكسيديز (100 ميكرومتر في 1 × TE)، والاحتفاظ بها لمدة 10 دقيقة. إذا تم استخدام ترانسفيراز الطرفي، تخطي تحميلمن oligodeoxynucleotides.
  3. تحميل 20 ميكرولتر من محلول الحمض النووي من الخطوة 1 إلى غرفة التدفق بمعدل تدفق 10 ميكرولتر / دقيقة، والحفاظ عليه لمدة 30 دقيقة.
  4. غسل غرفة التدفق مع 1 × TE، وتحميل 40 ميكرولتر من FP-DBP 10 (~ 80 نانومتر).
  5. مراقبة الحمض النووي تحت المجهر الفلورسنت مع استمرار تدفق الجزيئات تلطيخ في 1 × TE على 60X عدسة الهدف. استخدام 488 نانومتر ليزر الحالة الصلبة لإثارة FP (EGFP) -DBP. على امتداد كامل من جزيئات الحمض النووي، وتطبيق معدلات تدفق مختلفة وفقا لأطوال الحمض النووي المستخدمة. على سبيل المثال، تطبيق 50 ميكرولتر / دقيقة 48.5 KBP من الحمض النووي λ، و 100 ميكرولتر / دقيقة 166 KBP من T4 DNA.
    1. لإعادة تدوير حامل الاكريليك، نقع غرف تدفق تجميعها في حل المنظفات المنزلية 12. إزالة الأشرطة والايبوكسي بشفرة حلاقة وفرك مع يد لنقلهم تماما. تنشيط ثقوب الإبر مع حقنة. إبقاء أصحاب في الماء منزوع الأيونات حتى استخدامها مرة أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1 طريقتين مختلفتين الحمض النووي الربط اعتمادا على هياكل محطة للجزيء الحمض النووي. ويوضح الشكل 1A كيفية تهجين جزيئات الحمض النووي العضوية لزجة مع [أليغنوكليوتيد المعقدة البيروكسيديز يكمل بعضها بعضا ثبتوا على سطح PEG المغلفة أفيدين. 1B الشكل يوضح إضافة البيروكسيديز ddNTP أو dNTP إلى مجموعة الهيدروكسيل من الحمض النووي العضوية حادة من قبل ترانسفيراز الطرفي 3 '. واضاف نحن linkers مرنة بين جزيئات الحمض النووي والبيوتين. وقد زاد هذا من ربط وأفيدين البيوتين كفاءة ملزمة لتوفير مساحة كافية لردود الفعل. الشكل 1C يدل على التمثيل التخطيطي الشامل للالربط الحمض النووي على سطح PEG المغلفة أفيدين.

الشكل 2 يصور تجميع غرفة تدفق جنبا إلى جنب مع حامل الاكريليك. بالمقارنة مع الزجاجق / الكوارتز نظارات الشرائح، حامل الاكريليك حسب الطلب يبسط إعداد غرفة التدفق للفحص المجهري برنامج التحصين الموسع الفلورسنت. 12 غرفة التدفق تمكن المتغيرة لحظة من الظروف عازلة للتفاعلات الأنزيمات و 6 و تمتد جزيئات الحمض النووي.

يوضح الشكل (3) DNA واحد المربوطة وT4 λDNA ملطخة FP-DBP. تدفق القص ميكروفلويديك ممدود جزيئات DNA واحدة تصل إلى أطوال كفاف كاملة مثل 16.5 ميكرون (48.5 كيلوبايت λ الحمض النووي س 0.34 نانومتر) ونسبة 56.4 ميكرون (166 كيلوبايت T4 DNA س 0.34 نانومتر). كنا قادرين على تكرار الحمض النووي تمتد والاسترخاء عدة مرات خلال فترة طويلة (على سبيل المثال، نصف ساعة)، لأننا تستخدم FP-DBP أن لا يسبب الصور الانقسام.

شكل 1
الشكل 1. توضيح تخطيطي من الربط الحمض النووي. أ) قوتهجين الحمض النووي العضوية ticky مع قليل النوكليوتيد مكملة المعقدة البيروكسيديز. ثلاثي جلايكول الإثيلين هو رابط مرن بين النوكليوتيد والبيوتين. ب) يضاف البيروكسيديز dNTP إلى نهاية حادة من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل، من خلال ترانسفيراز الطرفي. Polycarbon هل (11 الذرات) هو رابط مرن بين dNTP والبيوتين. ج) البيروكسيديز الحمض النووي يرتكز إلى البروتين أفيدين، الذي يرتبط إلى الربط المعقدة البيروكسيديز المستعبدين تساهميا على سطح الزجاج. كانت نسبة PEG البيروكسيديز إلى الربط العادي 0.025 (01:40). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. غرفة التدفق. أ) غرفة تدفق تتكون من حامل راتنج حمض الاكريليك، وشرائط من الأشرطة على الوجهين ومضاد للفيروسات وتغطي زلة. حامل الاكريليك ذات أبعاد 76 ملم × 26 ملم × 5 مم (ث ل س س ح)، كانت ملفقة مع القطع بالليزر ب) عرض جانب من الغرفة التدفق: لكمة ثقوب هي مدخل الميناء الذي تم تثبيت تلميح الأصفر ل خزان العازلة، ومنفذ منفذ متصل إلى الأنابيب التي تسيطر عليها حقنة مضخة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. الصور المجهرية الفلورسنت من جزيئات الحمض النووي امتدت ملطخة FP-DBP. أ) الجراثيم λ الحمض النووي (48.5 KBP) المربوطة على السطح بعد ربط مع أليغنوكليوتيد] تكميلية المعقدة البيروكسيديز. ب) الجراثيم T4 الحمض النووي (166 KBP) المربوطة على السطح بعد إضافة البيوتين مع ترانسفيراز الطرفي. وتشير السهام أشار molecul الحمض النوويامتدت فاق حتى أطوال كفاف الكاملة مثل 16.5 ميكرون لالحمض النووي λ و56،4 ميكرون لT4 DNA. أشرطة النطاق: 10 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا نقدم منبرا لتصور جزيئات الحمض النووي طويلة البيروكسيديز لترسيخ على الأسطح. لقد ذكرت هذا النهج لجزيئات الحمض النووي المربوطة على سطح البروتين أفيدين المغلفة مع المعقدة البيروكسيديز ألبومين المصل البقري. 6 في النهج السابق، وجدنا القضية الحاسمة من الحمض النووي الصور الانقسام الناجم عن الأصباغ مكرر إقحام أن وصمة عار جزيئات الحمض النووي المربوطة على سطح. ولما كانت هذه fluorophores متحمس باستمرار لديهم احتمال كبير للهجوم على العمود الفقري الحمض النووي الفوسفات، 9 كان قوة ضوء الإثارة إلى أن يكون الحد الأدنى لتجنب الصور الانقسام.

ومن أجل التغلب على هذا الإزعاج، قمنا بتطوير وراثيا البروتينات الفلورية مع القدرة على ربط الحمض النووي (FP-DBP) عن الحمض النووي تلطيخ دون الصور انشقاق 10 احظنا موثوق تلطيخ DNA على السطوح البروتين المغلفة أفيدين. ومع ذلك، كان هذا المنبر قضية أخرى التجميع غير مرغوب فيه من البروتينات الفلورية علىسطح البروتين، مما أدى إلى زيادة الضوضاء في الخلفية. فمن الضروري للحد من هذا الضجيج العشوائي لتحليل الحمض النووي جزيء واحد لتعزيز النقيض من الحمض النووي والبروتينات من الخلفية. وبالتالي فإن استخدام FP-DBP يتطلب التخميل السطح لمنع البروتين الفلوري من أن كثف على السطح. الربط يمكن أن يكون مرشحا قويا لهذا الغرض. 12 ومن هنا، كنا المعقدة البيروكسيديز-PEG، مما عزز بشكل كبير نسبة الإشارة إلى الضوضاء لجزيئات الحمض النووي التصوير FP-DBP الملون المربوطة على السطح.

هناك العديد من الخطوات والملاحظات الهامة في هذه الطريقة لزيادة الغلة. من أجل حبل حدا لجزيء الحمض النووي على سطح الزجاج، وsilanized مجموعة الأمينات الأولية على ساترة تليها البيوتين PEG الطلاء كما هو مبين في الشكل 1. هذه العملية التخميل السطح هو أمر حاسم لجزيء واحد التصوير الحمض النووي لأنه يمكن أن تقلل بشكل كبير الامتزاز العشوائي توليد الضجيج على السطوح.لذلك، ينصح بشدة aminosilanization بين عشية وضحاها ومن مضاد. وبالإضافة إلى ذلك، وتنظيف شريحة زجاجية وكذلك غطاء زجاجي مع حل سمكة البيرانا يمكن زيادة خفض الضوضاء في الخلفية.

يجب أن يكون قليل النوكليوتيد المعقدة البيروكسيديز مجموعة الفوسفات في 5 "نهاية لربطه 3" مجموعة الهيدروكسيل من جزيء الحمض النووي كبير. تسلسل قليل النوكليوتيد المعقدة البيروكسيديز هو 5'-ف-GGGCGGCGACCT TEG-البيوتين-3 "للالربط الحمض النووي λ. الحل λ الحمض النووي لابد من تحميلها بعد وقت قصير من إعداد محلول الحمض النووي λ (كما هو موضح في 1.1)، لأن λ الحمض النووي وغالبا ما يشكل concatemers مع تخزين لفترة طويلة. لالحمض النووي كليلة العضوية مثل T4 الحمض النووي، يمكن ترانسفيراز الطرفي إضافة dUTPs البيروكسيديز عند كلا الطرفين من الحمض النووي من دون أي خصوصية. وهكذا، محطة وقت رد الفعل ترانسفيراز لابد من تعديلها بعناية حوالي ساعة، وإلا رد فعل بمد قد تنتج الحمض النووي المزدوج المسمى (أي، وصفت كلا طرفي مع البيوتين). بالاضافةition إلى الحمض النووي الفيروسي مثل λ و T4، أي نوع من أنواع الحمض النووي يمكن استخدامها في هذا المنبر. ومع ذلك، فمن المستحسن استخدام أجزاء من الحمض النووي الجيني العملاق بعد عملية الهضم من خلال نادرة لقطع الانزيمات تقييد مثل صوي أو نوتي.

وتطبق معدلات تدفق مختلفة لفترات مختلفة من الحمض النووي. عادة، جزيئات الحمض النووي أطول تتطلب معدلات تدفق أسرع لتمتد بالكامل جزيئات الحمض النووي، لتتناسب مع طول كفاف المحدد. على سبيل المثال، يمكن أن λ الحمض النووي تمتد ما يصل الى 16.5 ميكرون، والتي تتطابق مع القيمة المحسوبة 0.34 نانومتر س 48502 سنة مضت.

من المهم جدا لإعداد الطازج كل المواد، وخاصة كل من البروتينات وأوتاد. على سبيل المثال، Neutravidin يفقد بسهولة وظيفتها من biotins ملزمة إذا تم تخزينها كما محلول مخفف. عن حلول الربط، ودرجة الحموضة أمر بالغ الأهمية لتصريف المجموعات الوظيفية لأمين الابتدائية ون hydroxysuccinimide. ولذلك، فمن المستحسن أن يعد حديثا جميع المواد على الأقل كل أسبوع.

التصور من جزيئات الحمض النووي الكبيرة المربوطة على السطح هو منصة متعددة ليتم تطبيقها لمجموعة متنوعة من التطبيقات مثل علم الجينوم، epigenomics والدراسات البيوكيميائية لالحمض النووي وتفاعل البروتين، ودراسات الفيزياء البوليمر. ومع ذلك، يقتصر هذا النهج حاليا فقط لنموذج النظم التي تستخدم جزيئات الحمض النووي بسيطة نسبيا ومعروفة مثل الجينوم الفيروسي. أن تمتد إلى الجينوم البشري وepigenome، فمن الأهمية بمكان لتأسيس منصة قوية وموثوقة، وسهلة للاستخدام العملي. عن طريق التغلب الناجم عن ضوء الحمض النووي الصور الانقسام ومنع امتصاص عشوائية من البروتين الفلوري على السطح، وهذه المنصة بالتالي يوفر صورا واضحة وعالية التباين عن الحمض النووي ممدود مع التدفقات القص.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase New England Biolabs M0315S Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride
Biotin-11-dUTP Invitrogen R0081 Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA Nippon Gene 318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6758 EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA Bioneer D-2510 Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip Marienfeld-Superior 0101050 22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape Han Yang Chemical Co. Ltd. 3032292 Teflon™ tape
Sulfuric acid Jin Chemical Co. Ltd. S280823 H2SO4, 95% Purity
Hydrogen peroxide Jin Chemical Co. Ltd. H290423 H2O2, 35% in water
Sonicator Daihan Scientific Co. Ltd. WUC-A02H Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]
ethylenediamine
Sigma-Aldrich 104884
Glacial Acetic Acid Duksan Chemicals 414 99% Purity
Methyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. M300318 99.9% Purity
Polypropylene Container Qorpak PLC-04907
Ethyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. A300202 99.9% Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Syringe Filter Sartorius 16534----------K
Biotin-PEG-SC Laysan Bio Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG Laysan Bio MPEG-SVA-5000
Acetone Jin Chemical Co. Ltd. A300129 99% Purity
Microscope Slides Marienfeld-Superior 1000612 ~76 mm x 26 mm x 1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support Custom Fabrication
Double-sided Tape 3M Transparent type
Quick-dry Epoxy 3M
Polyethylene Tubing Cole-Parmer 06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe Hamilton 81165
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin Thermo Scientific 31000
Tris base Sigma-Aldrich T1503-5KG Trizma base
Microscope Olympus IX70
EMCCD Camera Q Imaging Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm) Oxxius LBX488
Alconox Alconox Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads. Science. 258, (5085), 1122-1126 (1992).
  2. Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase. Nature. 468, (7326), 983-987 (2010).
  3. Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. Dynamics of a tethered polymer in shear flow. Phys. Rev. Lett. 84, (20), 4769-4772 (2000).
  4. Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy. Science. 264, (5160), 822-826 (1994).
  5. Cai, W., et al. Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, (11), 5164-5168 (1995).
  6. Kim, Y., Jo, K. Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis. Chem. Comm. 47, (22), 6248-6250 (2011).
  7. Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab on a Chip. 11, (10), 1721-1729 (2011).
  8. Glazer, A. N., Rye, H. S. Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection. Nature. 359, (6398), 859-861 (1992).
  9. Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, (1), 292-299 (2006).
  10. Lee, S., et al. DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules. Nucleic Acids Res. (2015).
  11. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5, (6), 507-516 (2008).
  12. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. J. Vis. Exp. (86), e50549 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats