Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

1Department of Chemistry and Interdisciplinary Program of Integrated Biotechnology, Sogang University
Published 6/23/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Lee, S., Jo, K. Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide. J. Vis. Exp. (112), e54141, doi:10.3791/54141 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Cam ya da topuk kısmı yüzeylerinde gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme DNA alt tabakası, 1,2 ve polimer fizik DNA-protein etkileşimleri, protein dinamiği araştırmak için kullanılmıştır. 3,4 tek gergin büyük DNA molekülleri için bir platform tat birkaç var avantajlar diğer DNA immobilizasyon yöntemlerine göre. 5 İlk olarak, yüzey üzerinde gergin büyük bir DNA molekülü bağlanma sitesi tanıyan bir DNA-bağlama proteini için kritik öneme sahip olan bir kesme akışı olmadan doğal rasgele sargı bir biçime sahiptir. İkinci olarak, bir akış odasının enzimatik reaksiyonlar için bir dizi DNA molekülüne kimyasal ortamı değiştirmek oldukça kolaydır. Üçüncü olarak, bir mikroakışkan kesme akımı alternatif DNA uzama kullanarak elde etmek çok zordur tam kontur uzunluğu,% 100 kadar uzanan moleküler DNA, yüzey immobilizasyon 6 ve nanochannel hapsi olarak yaklaşımları neden olur. 7 A stretche tamD bir DNA molekülü genomik haritada enzimatik hareketlerini izlemek için yararlı olabilir konumsal bilgi sağlar.

Bununla birlikte, DNA, bağlama yaklaşım, YOYO-1 genel olarak, bağlı DNA molekülleri kolaylıkla flüoresan uyarma ışık kırılması neden olduğu için bu araya eklenen boyanın önemli bir dezavantajı vardır. Genel olarak, büyük DNA moleküllerinin bir flüoresan mikroskobu altında görüntülenmesi için bir floresan boya ile boyanmış olması gerekir. Bu amaçla, YOYO-1, ya da diğer TOTO serisi boyalar da iki-şeritli DNA interkalasyon olduğunda bu boyalar, sadece floresan için öncelikle kullanılır. 8 Bununla birlikte, bis-araya eklenen boyanın ışık kaynaklı DNA verilmedi-bölünme için neden olduğu iyi bilinmektedir fluorophores ardalanması. 9 ayrıntılı bir yüzeyde gergin floresan lekeli DNA molekülleri kesme akımları serbestçe DNA moleküllerini hareketli kuvvetleri kırılma uygulamak beri daha kırılgandır. Bu nedenle, biz bir roman D olarak FP-DBP geliştirdiyüzey üzerinde gergin büyük DNA moleküllerini görüntülenmesi için NA-boyama Protein boya. AP-DBP kullanmanın avantajı, bunun bağlandığı DNA moleküllerinin verilmedi-bölünmesini neden olmasıdır. 10. Ayrıca bis-interkalasyon boyalar çevre uzunluğu artmakta, AP-DBP, DNA çevre uzunluğu artmaz yaklaşık% 33.

Bu video yöntemi PEG-biyotin yüzeye büyük DNA moleküllerini hayvan zinciri için deneysel bir yaklaşım getirmektedir. 1 küt uçlar ve yapışkan uçları ile DNA tethering farklı yaklaşımlar göstermektedir Şekil. Bu durumda, bu boyama yöntemi, DNA molekülünün her türlü uygulanabilir. 2 DNA moleküllerini germek için ve kimyasal ve enzimi yüklemek için kesme akışı üretmek üzere bir şırınga pompası ile kontrol edilebilir akış odası düzeneğinin şematik bir temsilini tasvir etmektedir çözümler. Şekil 3 PEGylat üzerinde gergin tamamen gerilmiş DNA moleküllerinin mikrograflarını gösteriyorEd yüzeyi 11 ve AP-DBP ile boyandı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. DNA Biyotinilasyon

  1. Terminal transferaz kullanılarak kör uçlu DNA biyotinilasyon (TdT)
    Not: künt uçlu DNA Kullan T4 DNA (166 kbp).
    1. 2.5 mM CoCl2, 10 x reaksiyon tamponu 5 ul 10 mM biyotin-11-dUTP ve 0.5 ul, terminal transferaz 0.5 ul (10 birim) ve T4 DNA 0.5 ul (0.5 ug / ul), 5 ul ekle reaksiyon karışımına. Su 38.5 ul ekleyerek 50 ul son hacim olması için yapın.
    2. 1 saat boyunca 37 ° C'de reaksiyon karışımı inkübe edin.
      Not: Genişletilmiş reaksiyon süresi, yani çift gergin DNA verebilir, biotins iki ucunda etiketlenmiş olması mümkündür.
    3. 0.5 M EDTA, pH 8 5 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun.
    4. 4 ° C'de tüp tutun.
  2. DNA ligazı kullanılarak yapışkan uçlu DNA biyotinlenmesi
    Not: Bir yapışkan uç DNA Kullan λ DNA (48.5 kbp). <ol>
  3. T4 DNA ligaz 1 ul 10 x ligasyon tampon maddesi 5 ul, 25 ng 1 ul ekle / λ faj DNA ul ve 50 ul bir son hacim yapmak için, su 43 ul ilave edin.
  4. 4 ° C'de tüp tutun.

2. İşlevsel yüzey türetilmesi

Not:. Şekil 1 'de gösterildiği şekilde, cam yüzey üzerinde bir DNA molekülünün bir son halata için, bir birincil amin grubu biyotin-PEG kaplama ardından bir lamel silanlı olan bu PEGilasyon prosesi, tek bir molekül, DNA görüntüleme için önemlidir çünkü o önemli ölçüde yüzeyde istenmeyen moleküllerin eki tarafından oluşturulan rastgele gürültüyü azaltabilir.

  1. piranha Temizleme
    Not: Piranha çözümleri bu nedenle uygun güvenlik yönergeleri izleyerek, dikkatle ele alınmalıdır, organik malzemelerle şiddetle tepki.
    1. Bir yerde bir politetrafloroetilen (PTFE) rafa lamelleri, b onları tutuny PTFE boyuna iplik mühür bandı, raf üzerinde yüzeylerin kenarında ve yarım yarım. sarma sonra, temizlik işlemi sırasında raf işlemek için bant uzun parçası (~ 5 cm) bırakın.
    2. SO, H2O 2 4 ve 150 ml davlumbaz pirana çözelti yapmak için H2, 350 ml 1 L cam beher. 2 saat pirana çözelti içinde raf yerleştirin.
    3. beher su pH kadar iyonu giderilmiş su ile iyice boş kaptan pirana çözeltisi ve durulama lamelleri nötr ulaşır. pH kağıdı şeritleri kullanın.
    4. 30 dakika süre ile, beher içeren su içinde kapak slipleri raflar sonikasyon. beher sadece amino silanizasyon önce boş su. cam yüzeylerin temizlenmesi ve türetmek için sonikasyon gücü 75 W kullanın.
  2. Cam Yüzeyinde Aminosilanization
    1. N 2 ml ilave edilir - [3- (trimetoksisilil) propil] etilendiamin ve 200 ml buzlu asetik asit 10 miaminosilanization çözeltisinin hazırlanması için temiz polipropilen kaba metil alkol.
    2. polipropilen kaba temizlenmiş lamelleri yerleştirin. 30 dakika boyunca 100 rpm'de ve oda ısısında çalkalanır.
    3. W, en az 30 dakika boyunca 100 rpm'de ve oda ısısında çalkalayın 75 ° C'da 15 dakika için türetilmiş kapak slipleri ile beher sonikasyon.
    4. etil alkol ile iki kez beher solüsyonun boşaltın ve metil alkol ile bir kez dikkatli bir şekilde lamelleri durulama ve. Mağaza etil alkolde lamelleri ve iki hafta içinde bunları kullanmak.
  3. Lamel PEGilasyon
    1. 0.1 M sodyum bikarbonat, 10 ml (NaHCO3) sağlayın. 0.22 um'lik bir şırınga filtresi ile filtre solüsyonu.
    2. Biyotin-PEG-süksinimidil karbonat (biyotin-PEG-SC) NaHCO 3 350 ul PEG-süksinimidil valerat 80 mg (mPEG-SVG) 2 mg eritin. hafif bir koruma tüpü kullanın.
    3. 1 için kuvvetli bir şekilde tüp vorteks0 sn ve santrifüj o 1 dk kabarcıklarını çıkarmak için 10.000 x g'de.
    4. etil alkol ile yıkama, ardından aseton ile, bir cam slayt, durulayın. havaya slayt tamamen kurumasını bekleyin.
    5. temiz bir cam slayt PEG çözeltisi bir damla (50 ul) yerleştirin. herhangi bir kabarcıklar oluşturmadan, bir amino Silanlanmış kapak kayma ile hafifçe damlacık örtün.
    6. 3 saat boyunca yer slaytlar gecede karanlıkta oda sıcaklığında nemli odasını iyi tesviye etmek. altta su ile oda olarak boş bir pipet ucu tutucu kullanın. tüp içinde kalan PEG çözeltisi kapatılır ve 4 ° C'de tutun.
    7. iyonu giderilmiş su ile iyice PEG'lenmiş lamel durulayın. kullanana kadar karanlık ve kuru bir yerde saklayın.

3. Bir akış odası Montaj

  1. . Şekil 2'deki gibi, bir delikli akrilik tutucu imal boru ucun çapı 0.762 mm olduğundan emin olun ve bir delikli bir giriş olduğu tayin ve diğeribir çıkış (Şekil 2).
  2. Herhangi bir kanal delik perturbing değil, bir giriş ve çıkış deliğine dik hizalama çift taraflı yapışkan bant şeritler akrilik tutucu (genişlik 5-6 mm) (Şekil 2), yerleştirin. Çok kanallı duvarları odaları yapmak için bu bant şeritlerini kullanın. Bir pipet ucu kullanılarak bandı fırçalayın.
  3. yüzükoyun PEG'lenmiş tarafı, akış odalarını yapmak için üstüne bir PEG'lenmiş lamel yerleştirin.
  4. sızıntı herhangi bir çözüm önlemek için, çift taraflı bantlar yerleştirilir alana bir lamel üstüne basın. Üst ve alt (Şekil 2'de sarı renk) de odacığın kenarlarını kapatma çabuk kuruyan epoksi yapıştırıcı ekleyin.
  5. Bir gaz geçirmeyen şırınga boru (dış çapı OD, 0.042 ") arasında kısa bir parça (2.5 cm) geç ve epoksi yapıştırıcı ile bağlantıyı tıkamak.
  6. şırınga ile bağlantılı boru ve epoksi yapıştırıcı ile ortak mühür: Uzun esnek borular (0.03 "OD) bağlayın.
  7. Tubi doldurunng DI su ile şırınga ile bağlantılı. hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun.
  8. epoksi yapıştırıcı ile kapatılmış akış odasının deliğe boru yerleştirin.
  9. bir rezervuar olarak diğer delik sarı ucu (200 ul ucu) yerleştirin.

Akış Odası içine 4. Numune Yükleme

Not: Neutravidin streptavidin gibi diğer avidin protein ile değiştirilebilir. Bu açıklanan sürece bütün tepkimeler, oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir. Sarı uç örnek çözümü almak ve akrilik tutucu (Şekil 2b) deliği üzerine solüsyonu ile ucu yükleyin.

  1. / Dakika, 50 ul şırınga pompa akış hızını ayarlayın. Yük avidin protein 20 ul (T50 çözeltisi içinde 25 ug / ml, 10 mM Tris, NaCl 50 mM, pH 8), 10 dakika için tutun.
  2. Yük 20 biyotinlenmiş oligodeoksinükleotidler ul (1 x TE 100 uM) ve 10 dakika için tutun. terminal transferaz kullanılırsa, yükleme atlamakoligodeoksinükleotidler evi.
  3. Yük 20 10 ul / dk'lık bir akış oranında akış odasına Kademe 1 DNA çözeltisi ul ve 30 dakika için tutun.
  4. 1 × TE ile akış odasına yıkayın ve FP-DBP 10 (~ 80 nM) 40 ul yükleyin.
  5. 60X objektif lens 1 × TE boyama moleküllerin sürekli akış ile floresan mikroskop altında DNA gözlemleyin. FP (eGFP) -DBP uyarılması için 488 nm katı hal lazer kullanın. DNA moleküllerinin tam germek için, kullanılan DNA uzunluklarına göre farklı akış oranlarına uygulanır. Örneğin, T4 DNA 166 kbp için λ DNA 48.5 kbp, ve 100 ul / dakika 50 ul / dak uygulanır.
    1. Akrilik tutucu geri dönüşümü için, bir deterjan çözeltisi 12 monte akış odaları ıslatın. tamamen çıkarmak için elleriyle bir jilet ve ovalayın kasetleri ve epoksi çıkarın. şırınga iğneleri ile delikleri unclog. sonraki kullanıma kadar deiyonize su içinde tutucular tutun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1, 1b, Şekil. Şekil 1a yapışkan uçlu DNA moleküllerinin avidin kaplı PEG yüzeyi üzerinde hareketsiz tamamlayıcı biyotinile oligonükleotid ile melezlenir verilmektedir. DNA molekülünün ucu yapısına bağlı olarak, iki farklı DNA bağlama yöntemleri gösterir eklenmesini gösterir biyotinile ddNTP veya terminal transferaz ile kör uçlu DNA 3 'hidroksil grubuna dNTP Bu DNA moleküllerinin yapıları ve biyotin arasındaki esnek bağlayıcılar ilave edildi. Bu 1c Şekil. Reaksiyonları için yeterli bir alan sağlamak için ligasyon ve avidin-biyotin bağlanmasını verimlilik artışı avidin kaplı PEG yüzeyi üzerinde, DNA bağlanması için genel şematik gösterilmiştir.

Şekil 2, bir akrilik tutucu ile birlikte akış odasının montajını göstermektedir. glas karşılaştırıldığındas / kuvars slayt gözlük, ısmarlama akrilik tutucu epi-floresan mikroskopi için akış odasının hazırlanmasını kolaylaştırır. 12 akış odası enzim reaksiyonlarının, 6 ve germe DNA molekülleri için tampon koşulları anında değişen sağlar.

Şekil 3, FP-DBP ile boyanmış tek gergin DNA T4 λDNA gösterir. Mikroakışkan kesme gibi 16.5 mm ve 56.4 mm (T4 DNA 0.34 nm x 166 kb) (48.5 kb λ DNA 0.34 nm x) tam kontur uzunlukları kadar uzatılmış tek bir DNA moleküllerini akar. Biz fotoğraf bölünme neden olmaz FP-DBP kullanılan beri, uzun bir süre (örneğin, yarım saat) sırasında DNA germe ve gevşeme birden çok kez tekrarlamak başardık.

Şekil 1
DNA tethering 1. şematik çizimini Şekil. a) lerticky uçlu DNA biyotinlenmiş tamamlayıcı oligonükleotid ile melezleştirilmiştir. Trietilen glikol oligonükleotid ve biotin. B) Biyotinile dNTP terminal transferaz ile, çift iplikli DNA bir kör ucuna eklenir arasında esnek bir bağlayıcıdır. Polikarbon boşluk (11-atomu) kovalent cam yüzeyine bağlı bir biyotinlenmiş PEG bağlanmış olan bir avidin protein ankrajlandığı dNTP ve biyotin c.) Biyotinile DNA arasında esnek bir bağlayıcıdır. Normal PEG biotinlenmiş PEG oranı. (01:40) 0.025 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
2. Akış odasına rakam. a) akrilik asit Reçine tutucu oluşan akış odası, çift taraflı bantlar ve PEG'lenmiş şeritleri kılıf. Boyutları 76 mm x 26 mm x 5 mm (U x G x Y) akrilik tutucu, lazer kesim ile imal edilmiştir b) Akış odasının yan görünüşü:. Delikler sarı ucu için yüklü olduğu bir giriş portu olan delikli bir tampon rezervuar ve bir şırınga pompa tarafından kontrol edilen bir boru bağlı bir çıkış noktası. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil FP-DBP ile boyanmış gerilmiş DNA moleküllerinin 3. Floresan mikroskobik görüntüler. a) bakteriyofaj λ DNA biotinlenmiş tamamlayıcı oligonükleotidler ile bağlandıktan sonra yüzeyde gergin (48.5 kbp). b) bakteriyofaj T4 DNA (166 kbp), terminal transferaz ile biotin ekledikten sonra yüzeyde gergin. Belirtilen oklar DNA Molekül göstermekes tam kontur uzunlukları T4 DNA için gibi λ DNA için 16.5 mm ve 56.4 mm kadar uzanıyordu. Ölçek çubukları:. 10 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada yüzeylerde ankraj için biyotinile uzun DNA moleküllerini görselleştirmek için bir platform sunuyoruz. Bu biyotinile sığır serum albümini ile bir avidin protein kaplı yüzey üzerine gergin DNA molekülleri için bir yaklaşım. 6. önceki yaklaşımda bildirmiştir, biz gergin DNA moleküllerini leke bis-interkalasyon boyalar neden olduğu DNA verilmedi-parçalanmasının önemli bir sorun bulduk yüzey. Bu sürekli heyecanlı fluorophores uyarma ışık güç foto-bölünme önlemek için minimize edilmesi gerekiyordu 9, bir DNA fosfat omurgası saldırmak için yüksek bir olasılık var gibi.

Bu sakıncanın giderilmesi için, genetik olarak verilmedi-bölünme olmadan boyama DNA, DNA-bağlama yeteneği (FP-DBP) floresan proteinleridir geliştirmiştir. 10 Biz avidin kaplı proteini yüzeylerinde güvenilir bir DNA boyama görülmektedir. Bununla birlikte, bu platform üzerinde floresan proteinleri istenmeyen agregasyon başka sorunu vardıyüzey proteini, arka plandaki gürültünün arttığı sonuçlanır. Arka plan DNA ve proteinlerin kontrastı arttırmak için tek-molekül DNA analizi için bu rasgele gürültüyü en aza indirmek için gereklidir. AP-DBP kullanımı, bu nedenle yüzeyi üzerinde içilmiş olmaktadır, floresan proteini önlemek için yüzey pasivasyonu gerektirir. PEG, bu amaç için güçlü bir aday olabilir. 12 Dolayısıyla, önemli ölçüde yüzeye gergin görüntüleme AP-DBP boyanmış DNA molekülleri için sinyal-gürültü oranı gelişmiş biyotinlenmiş-PEG kullanılmıştır.

yüksek verim için bu yöntem birçok kritik adımlar ve notlar vardır. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, bir cam yüzey üzerine bir DNA molekülünün bir son halata için, bir birincil amin grubu biyotin-PEG kaplama ardından bir lamel silanlı edilir. Bu yüzey pasivasyonu işlemi tek moleküllü bir DNA görüntüleme için önemlidir çünkü o önemli ölçüde yüzeylerde gürültü üreten rastgele adsorpsiyonu azaltabilir.Bu nedenle, bir gecede aminosilanization ve PEGilasyon önemle tavsiye edilir. Buna ek olarak, cam slayt yanı sıra piranha çözümü ile cam kapak temizleme ayrıca arka plan gürültüsünü azaltabilir.

Bir biyotinile oligonükleotid büyük DNA molekülünün hidroksil grubu 'ila 3 bağlamak amacıyla 5' ucuna bir fosfat grubuna sahip olmalıdır. biyotinlenmiş oligonükleotidin sekansı 5'-p-GGGCGGCGACCT-TEG-Biotin-3 'λ DNA bağlanması için olan. λ DNA solüsyonu λ DNA genellikle uzun süreli depolama konkatemerler meydana için, (1.1 'de tarif edilmiştir) λ DNA çözeltisi hazırlandıktan sonra kısa bir süre yüklenmesine sahiptir. T4 DNA gibi kör uçlu DNA için terminal transferaz herhangi bir özgüllüğü olmayan DNA her iki ucunda biyotinile dUTPs ekleyebilir. Bu durumda, terminal transferaz Reaksiyon süresi, aksi uzatılmış reaksiyonu (yani, her iki ucu biyotin ile etiketlenmiş), çift etiketli DNA verebilir, dikkatli bir şekilde bir saat ayarlanmalıdır. Eklenti olarakBu λ T4 gibi viral DNA ition, herhangi bir DNA tipleri bu platformda kullanılabilir. Bununla birlikte, SwaI ya Notl gibi nadir kesici sınır enzimleri ile sindirmeden sonra dev genomik DNA'dan fragmanlarının kullanılması tavsiye edilir.

Farklı akış hızları, DNA'nın farklı uzunlukları için uygulanmaktadır. Genellikle, uzun DNA molekülleri tamamen kesin kontur uzunluğu maç için, DNA moleküllerini germek için hızlı akış oranlarını gerektirir. Örneğin, λ DNA, 0.34 nm x 48.502 bp hesaplanan değere karşılık gelir, 16.5 um kadar esneyebilir.

Taze tüm malzemeleri, proteinler ve PEG özellikle tüm hazırlamak oldukça önemlidir. Örneğin, Neutravidin kolaylıkla bir seyreltilmiş çözelti halinde depolandığında biotins bağlama işlevini kaybetmektedir. PEG çözeltiler için pH birincil amin ve N-hidroksi-işlevsel grupları konjuge için çok önemlidir. Bu nedenle, taze en az haftada bir malzeme hazırlamak için önerilir.

yüzey üzerinde gergin büyük DNA moleküllerinin görselleştirilmesi, genomik, epigenomics, DNA ve protein etkileşimi için biyokimyasal çalışmalar, ve polimer fizik çalışmaları gibi çeşitli uygulamalar için uygulanması için çok yönlü bir platformdur. Bununla birlikte, bu yaklaşım, şu viral genom olarak nispeten basit ve iyi bilinen DNA molekülleri ile sistemleri modeli için sınırlıdır. İnsan genomu ve Epigenom kadar uzatılabilir için, pratik kullanım için sağlam, güvenilir ve basit bir platform kurmak için büyük önem taşımaktadır. ışık kaynaklı DNA fotoğraf bölünme aşılması ve yüzeyde floresan protein rastgele adsorpsiyonu önleyerek, bu platform, bu nedenle kesme akışları ile uzatılmış DNA için net ve yüksek kontrastlı görüntüler oluşturur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase New England Biolabs M0315S Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride
Biotin-11-dUTP Invitrogen R0081 Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA Nippon Gene 318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6758 EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA Bioneer D-2510 Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip Marienfeld-Superior 0101050 22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape Han Yang Chemical Co. Ltd. 3032292 Teflon™ tape
Sulfuric acid Jin Chemical Co. Ltd. S280823 H2SO4, 95% Purity
Hydrogen peroxide Jin Chemical Co. Ltd. H290423 H2O2, 35% in water
Sonicator Daihan Scientific Co. Ltd. WUC-A02H Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]
ethylenediamine
Sigma-Aldrich 104884
Glacial Acetic Acid Duksan Chemicals 414 99% Purity
Methyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. M300318 99.9% Purity
Polypropylene Container Qorpak PLC-04907
Ethyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. A300202 99.9% Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Syringe Filter Sartorius 16534----------K
Biotin-PEG-SC Laysan Bio Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG Laysan Bio MPEG-SVA-5000
Acetone Jin Chemical Co. Ltd. A300129 99% Purity
Microscope Slides Marienfeld-Superior 1000612 ~76 mm x 26 mm x 1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support Custom Fabrication
Double-sided Tape 3M Transparent type
Quick-dry Epoxy 3M
Polyethylene Tubing Cole-Parmer 06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe Hamilton 81165
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin Thermo Scientific 31000
Tris base Sigma-Aldrich T1503-5KG Trizma base
Microscope Olympus IX70
EMCCD Camera Q Imaging Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm) Oxxius LBX488
Alconox Alconox Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads. Science. 258, (5085), 1122-1126 (1992).
  2. Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase. Nature. 468, (7326), 983-987 (2010).
  3. Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. Dynamics of a tethered polymer in shear flow. Phys. Rev. Lett. 84, (20), 4769-4772 (2000).
  4. Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy. Science. 264, (5160), 822-826 (1994).
  5. Cai, W., et al. Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, (11), 5164-5168 (1995).
  6. Kim, Y., Jo, K. Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis. Chem. Comm. 47, (22), 6248-6250 (2011).
  7. Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab on a Chip. 11, (10), 1721-1729 (2011).
  8. Glazer, A. N., Rye, H. S. Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection. Nature. 359, (6398), 859-861 (1992).
  9. Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, (1), 292-299 (2006).
  10. Lee, S., et al. DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules. Nucleic Acids Res. (2015).
  11. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5, (6), 507-516 (2008).
  12. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. J. Vis. Exp. (86), e50549 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats