인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발은 미세 중력 하에서 성장

Bioengineering

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Summary

3 차원 (3-D) 환경에서 성장하는 세포는 2-D 환경 (예 : 플라스크 또는 종) 세포 배양에 비해 현저한 개선을 나타낸다. 여기에서 우리는 회전 벽 혈관 (RWV) 생물 반응기에서 제공하는 미세 중력에서 배양 인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발을 설명합니다.

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Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity. J. Vis. Exp. (113), e54148, doi:10.3791/54148 (2016).

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Abstract

3 차원 (3-D) 환경에서 성장하는 세포는 다수의 2 차원 환경에서 세포 배양 간격 (예., 플라스크 또는 요리)을 해소 할 가능성이 있기 때문이다. 사실, 널리 접시 또는 플라스크에서 배양 세포 분화 디 그들이 유래 된 조​​직에서의 특화된 기능을 상실하는 경향이 인정된다. (a) 정적 모델 생물을 이용하여 (b) 모델 : 현재 원시 세포 외 기질 (ECM)을 흉내 낸 세포를 지지체로 시딩 3-D 배양 시스템의 두 종류가 주로 존재한다. 제 획기적인 정적 3-D 모델이었다. 이러한 회전 벽 혈관 등의 생물을 이용하여 3-D 모델 (RWV) 생물 반응기는 더 최근의 개발이다. RWV 생물 반응기의 원래 개념은 1990 년대 초에 NASA의 존슨 우주 센터에서 개발 및 저산소, 괴사 코어의 개발로 정적 모델의 한계를 극복 할 것으로 생각된다. RWV의 생물 반응기는 일을 피할 수 있습니다영양분과 산소의 효율적인 확산을 허용 유체 역학을 제공하여 문제가된다. 이 생물 반응 장치 지원 및 폭기 소스 유형에 따라 다릅니다 문화 선박의 두 가지 형식을 회전시키는 역할을 회 전자의 기본 구성 : 공동 축 중앙에 형산, 또는 (1) 느린 켜기 측면 용기 (STLVs) (2 평평한 실리콘 고무 가스 이송 멤브레인을 통해 산소와) 높은 화면 비율 용기 (HARVs). 거품 형성과 그에 따른 혼란을 피하면서이 선박은 효율적인 가스 전송을 할 수 있습니다. 이러한 조건은 모델 배양 용기 중의 중력 (무중력)를 감소 층류 최소 전단력 초래한다. 여기서 우리는 RWV 바이오 리액터에 의해 제공된 소장 상피 세포주 및 일차 인간 림프구 무중력 하에서 배양 된 내피 세포 및 섬유 아세포 이루어지는 인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발을 기술한다. </ P>

Introduction

과학자들은 다른 골격 유형 (예., 라미닌, 콜라겐 타입 I 콜라겐 IV 및 피브로넥틴) 및 개선하는 성장 인자의 칵테일을 조사하기 시작했을 때, 3-D 모델을 구축하는 제 침투는 1980 년대 초에보고 세포 간 및 "정적"3-D 모델 1-7의 ECM 상호 작용. 그 이후로,이 모델의 주요 문제는 매체 및 조직 구조 (8) 내에서 영양소의 전송 및 산소 제한하고있다. 혈관의 네트워크 주변에서 일정한 영양분 및 산소의 흐름을 수용하는 생체 환경에서 세포와 대조적으로,이 모델의 정적 특성은 세포로의 효과적인 분산을 방해한다. 예를 들어, 크기가 몇 mm를 초과 체외 정적 모델에서 생성 된 세포 집합체는 변함없이 저산소, 괴사 코어 (9)을 개발할 것입니다. RWV 생물 반응기는이 문제를 피할 수 있습니다영양분과 산소 10-12의 효율적인 확산을 허용 유체 역학을 제공하여. 그러나, 지금까지 RWV 생물 반응기를 사용하여 작업이 하나 또는 두 종류의 세포 13-17의 포함에 한정되었다. 또한, 대신에 기본 조직과 동일한 공간 배향, 이러한 세포는 세포 응집체를 형성했다. 이러한 제한에 대한 가장 큰 이유는 통합 된 방식으로 세포를 통합 할 수있는 발판의 부족이었다. 현재까지 RWV의 생물 반응기에 사용되는 지지체는 주로 합성 마이크로 비즈, 관 실린더 또는 작은 시트 13-15,19-23의, 몇 가지 예외를 제외하고 16 ~ 18으로 구성되어 있습니다. 이러한 조성 및 유연성 조작 할 수없고, 어떤 셀이 그 표면에 부착 된 강성 물질이다. 따라서, 이러한 모델은 통합 된 방식으로 평가하기 위해서는 시스템을 제공 할 가능성은, 다양한 세포와 같은 간질 세포와 같은 구성 요소 (예., 섬유 아세포, 내피 세포 및 면역) 즉이야hould 밀접하게 인간의 조직을 모방하는 발판 내에 분산 될 수있다.

여기서 우리는 장 상피 세포주 및 일차 인간 림프구, 내피 세포로 구성된 인간 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발을 기술하고, 섬유 아세포 (24). 이 세포는 미세 중력 하에서 RWV 생물 반응기 13,25-30에 의해 제공 배양 하였다. 우리의 3-D 모델에서 ECM 많은 별개 이러한 배지 유사한 삼투압 (예., 배양 중에 무시할 확산 감금) 세포 및 다른 중요한 세포 외 기질 단백질을 포함하는 능력과 같은 특성뿐만 아니라, 같은 보유 적절한 강성 생물 반응기 (24)에 사용될 수있다. 생물학적 시스템은 매우 복잡하고, 지난 몇 년간, isolatio 그들을 공부보다는 주변 환경과 세포의 상호 작용의 시험 향해 점막 연구의 초점의 변화가 있었다엔. 특히, 장 세포 생존 및 분화에 영향을 미치는 세포 - 세포 상호 작용의 중요성을 잘 31-34를 설명되어 있습니다. 구체적으로는, 상피 세포 및 그들의 틈새 사이의 통신은 상피 세포의 확장 및 분화 (35)에 큰 영향을 미친다. 실제로, 널리 사용되는 전용 세포 간뿐만 아니라, 세포 간 상호 작용 ECM 3-D 배양 모델에서 상피 세포의 유지와 분화에 중요하다. 이전의 연구는 콜라겐 I 24,36,37, 라미닌 (38) 및 피브로넥틴 (39)는 원래 점막과 유사한 공간 방향을 취득 장내 상피 세포에 영향을 미치는 수단이되기 때문에 그 직감 ECM 단백질을 증명하고있다. 연구자들은 복잡한 세포 및 구조 아키텍처를 다시하려는 경우 따라서, 새로운 기술의 개발은 우리의 3-D 모델 (24)처럼, 그 창자의 표현형의 다양성이 요구되는 모방 할 수그리고 장내 미세 환경의 기능. 이러한 모델은 새로운 경구 용 약물과 백신 후보들의 평가 및 개발에 중요한 수단을 나타낸다.

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Protocol

윤리 문 : 모든 혈액 표본이 프로토콜 번호 HP-00040025-1에 참여한 자원 봉사자들로부터 수집 하였다. 메릴랜드 임상 시험 심사위원회의 대학은이 프로토콜을 승인하고이 원고에 포함 된 연구를위한 건강한 지원자에서 혈액 표본의 수집을 승인했다. 이 연구의 목적은 자원 봉사자들에게 설명하고, 모든 자원 봉사자는 정보를 준, 혈액 그리기 전에 동의를 체결했다.

주 : 매체 보충 준비를 위해 표 1을 참조하십시오. 3-D 배양 배지의 제조 표 2 참조.

문화 선박 1. 준비

  1. 50 ML-용기의 충전 포트의 뚜껑을 풀고 무균 배지 50 ㎖ (예., RPMI)를 입력합니다. 층류 후드에서 무균 조건 하에서 모든 절차를 수행합니다.
  2. 뚜껑을 교체하고 70 % 에탄올로 어떤 표면에 어떤 유출 매체를 닦아냅니다.
  3. 선박이 incub 허용RT에서 O / N에 적어도 15 분 동안 먹었다.
  4. 배양액을 버리고 3-D 배지 30 ㎖를 추가 충전 포트를 사용한다.
  5. 70 % 에탄올로 어떤 표면에 어떤 유출 매체를 닦아주십시오.

세포의 제조 2

  1. 인간 상피 세포주 (HCT-8) 24,40.
    1. RPMI에서 배양 세포를 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 50 μg의 / ml의 겐타 마이신, 2 mM L- 글루타민이, 1 mM 피루브산 나트륨, 10 mM의 HEPES는 (버퍼 및 10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 FBS로 보충 ) (보충 1). 70 % 컨 플루 언시, 하나의 비율로 분할 셀 : 5이다.
  2. 인간 대장 섬유 아세포 (CCD-18Co 세포) 24,41.
    1. 보충 1 풍부 기저 이글 배지에서 배양 세포 포화 상태에서, 1의 비율로 분할 세포 :. 3.
  3. 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)
  4. 내피 기저 중간 (EBM)에서 배양 세포를 배지 100 μg의 / ㎖ 헤파린, 3 μg의 / ml의 내피 세포 성장 보충 (심전도)가 풍부하고, 1을 보충 70 % 컨 플루 1의 비율로 분할 세포에서 :. 2.
  • 림프구 / 단핵구
    1. 표준 기술 (43)을 사용하여 밀도 구배 원심 분리에 의해 혈액으로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리.
      1. 간략하게, 10 ml의 피펫을 사용하여 조심스럽게 희석 혈액 30 ㎖를 추가 (1 : 1 혈액 : 인산 완충 식염수 (PBS)) 밀도 원심 분리 배지 10ml를 함유 한 50㎖ 원추형 튜브에. 원심 분리 단계 후, 림프구 및 단핵구는 밀도 원심 분리 매체와 플라즈마 층 사이의 "화이트"레이어에있는 것입니다.
      2. 전송 피펫을 사용하여 백색 층을 수집합니다. 밀도 원심 분리 매체의 수집을 제한하여 과립구 오염을 방지. (43)를 세척 한 후, 유같은 자체 PBMC는 또는 액체 N 2 냉동 보관.
        참고 : PBMC 크게 수지상 세포와 다른 세포 유형의 작은 비율로, 림프구 및 단핵구로 구성되어 있음을 강조하는 것이 중요하다.
  • 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 표준 배양 조건에서 모든 셀을 성장한다.
  • 콜라겐 임베디드 세포의 3. 준비

    1. 인서트의 개수를 결정하는 것은 실험 조건의 수에 기초하여 필요가 셋업된다. 6 잘 판의 우물에 삽입 적절한 수를 놓습니다.
    2. HUVEC 및 섬유 아 세포의 현탁액을 준비합니다 :
      1. PBS 두 번 플라스크를 씻고 0.05 % 트립신 테트라 에틸렌 (트립신 - EDTA)와 트립신, 0.25 % (1 배)를 사용하여 세포를 분리. 세포 배양 면적의 전체를 커버하기에 충분한 트립신 용액을 첨가. 분리는 일반적으로 15 분에 5 내에서 발생
      2. 수집둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM) -30 % FBS 배지 30 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 튜브에서 분리 된 세포.
      3. 10 분 동안 500 XG에 튜브를 원심 분리기.
      4. DMEM-30 % FBS 배지 30 ㎖로 세포를 재현 탁.
      5. 트리 판 블루 염색 20 μL에 재현 탁 된 세포를 20 ㎕의 희석하여 생존 세포의 수를 계산. 세포 혼합물과 혈구를 넣습니다. 유력한 PBMC를 분명 흰색 될 것입니다; 생존 할 PBMC는 염료를 획득하고 파란색이 될 것입니다.
        1. 8 × 107 셀 ML - - (5)의 농도로 DMEM-30 % FBS 배지에서 각 세포 유형을 재현 탁 1.
    3. 세포 함유 콜라겐 젤을 준비
      참고 : 각 선박이 세포 함유 콜라겐 겔 ~ 5 ㎖의 준비가 필요합니다.
      1. 한 50㎖ 원추형 튜브를 50㎍ / ml의 겐타 마이신, 2 mM L- 글루타민 및 10 % 열 - inactivat 보충 한 X DMEM 배지를 첨가하여 콜라겐 혼합물을 제조에드 FBS 플러스 3 ㎎ / ㎖ 소 콜라겐 I, 10 μg의 / ㎖ 라미닌, 40 μg의 / ㎖ 콜라겐 IV, 10 μg의 / ㎖ 피브로넥틴, 2 μg의 / ㎖ 헤파린 황산 프로테오글리칸 15 mM의 수산화 나트륨 (생리적 산도에 도달하기 위해).
      2. 상기 튜브를 닫고, 혼합물을 완전히 균질화 될 때까지 수회 반전시켜 혼합한다. 거품 형성을 피할 것.
        중요 : 겔화를 방지하기 위해 얼음에 혼합 보관하십시오.
        1. 중요한 단계 : 혼합물을 산성 외관 (노란 색)을 전개하면, 혼합물을 중화 멸균 1 N NaOH를 몇 방울을 추가한다.
      3. 각각 농축 된 콜라겐 혼합물 (전술)에 2.0 × 106 세포 / ml - 1.2 1.5 - 1.0 밀도 농축 HUVEC 및 섬유 아세포를 추가한다. 튜브를 닫고, 혼합물을 완전히 균질화 될 때까지 수회 반전시켜 혼합한다. 거품 형성을 피할 것. 중요 : 겔화를 방지하기 위해 얼음에 혼합 보관하십시오.
      4. 셀 함유 콜라겐의 5 ml의 - 4 추가각 삽입에 젤, 이전에 6 잘 플레이트에로드하고, 1 시간 동안 거의 또는 전혀 운동과 후드에서 겔화하는 것을 허용했다.
      5. 2 개의 추가 시간 - 1 시간 후, 1 37 ° C, 5 % CO 2 배양기로 6 웰 플레이트를 전송할 수 있습니다.
      6. 후드에 6 웰 플레이트를 반환하고, 멸균 집게의 도움으로 무균 차단 메스 막을 막에서 세포 함유 겔을 분리 삽입에서. 작은 사각형으로 분리 된 겔 (~ 5 × 5mm)를 잘라.
      7. 충진 포트를 사용하여 50 mL의 HARV에 소세포 함유 사각형을 추가한다.
    4. HCT-8 상피 세포의 현탁액을 준비합니다 :
      1. PBS 두 번 플라스크를 세척하고 트​​립신 - EDTA 처리와 트립신, 0.25 % (1 배)를 사용하여 세포를 분리. 세포 배양 면적의 전체를 커버하기에 충분한 트립신 용액을 첨가. 분리는 일반적으로 10 ~ 15 분 이내에 발생합니다.
      2. DMEM-30 % FBS 배지 30 ㎖에서 분리 세포를 수집.
      3. Centrif10 분 동안 500 XG에 튜브를 함유 UGE DMEM-30 % FBS 배지.
      4. DMEM-30 % FBS 배지 30 ㎖로 세포를 재현 탁.
      5. 3.2.5에 기술 된 바와 같이 생존 세포의 총 수를 계산.
      6. 10 7 세포 ml의 농도로 DMEM-30 % FBS 배지에서 HCT-8 상피 세포를 재현 탁 - 1.
      7. 충진 포트를 사용하여 50 mL의 HARV로 농축 HCT-8 상피 세포에 1 ml의 추가.
    5. 선박이 거의 가득 찰 때까지 충진 포트를 사용하여 (~ 20 ml)에 추가로 3-D 배양 배지를 추가한다.
    6. 뚜껑을 교체하고 70 % 에탄올로 충전 포트의 입술을 닦아냅니다.
    7. RWV 각 주사기 포트 주사기 넣 장소 3 함유하는 5 ㎖ 주사기 - (4) 하나의 포트에서의 3-D 배양 배지 ㎖의 다른 포트에 5 ㎖ 빈 주사기.
    8. 매체의 거의 같은 볼륨이 다른 주사기 포트를 통해 주입하는 동안 빈 주사기로 당겨 눈에 보이는 거품을 제거합니다.
    9. VES 배치SELS 생물 반응기에서, 전원을 켜고 분당 약 13 ~ 14 회전에 속도를 설정합니다.
      주 : 긴급 단계 : 회전 속도하여 혈관 벽과의 접촉을 피하고, 상기 용기 내에 선회 세포를 유지하기 위해 실험 중에 몇 번 조정될 필요가있다.
    10. RWV 생물 반응기에서 제공하는 37 ° C, 미세 중력에서 5 % CO 2에서 배양 세포.
    11. 새로운 3-D 배양 배지에 약 30 mL로 대체하여 4 일 - 매 3 변경 배지.
    12. 사일 (± 1 일) 후, 생물 반응기에서 혈관을 제거하고 혈관 (× 10 7 / 용기 (2))에 림프구 / 단핵 세포를 추가합니다.
    13. 추가 오일 (± 1 일), 37 ° C, 5 % CO 2에서 다시 생물 반응기의 용기를 놓습니다.
    14. 추가 오일 (문화의 날 9) 한 후, 선박 (2 × 10 7 / 용기)에 림프구 / 단핵구를 추가하고 최대 12 개의 추가 일 동안 문화를 계속합니다. 새로운 3-D 배양 배지에 약 30 mL로 대체하여 4 일 - 매 3 변경 배지.

    조직학 4. 수확은 3-D 문화

    1. 10 % 포르말린 버퍼 10 ㎖를 포함하는 여섯 잘 플레이트로 전송 피펫 수확의 도움을 지금라는 각각의 작은 젤 조각, "건설,"와. 실온에서 3 시간 동안 떠나거나 12 - 4 ℃에서 16 시간.
    2. 라벨링 각 카세트에 생검 폼 패드의 두 부분을 추가함으로써, 조직 처리 및 매립 카세트를 준비한다.
    3. 10 % 포르말린 버퍼에 카세트를 담가.
    4. 집게의 도움으로 두 폼 패드 사이의 고정 구조를 배치합니다.
    5. 10 % 포르말린 버퍼에 카세트를 담가.
    6. , 내장 절편, 44를 염색에 대한 표준 절차를 진행합니다.

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    Representative Results

    이전에, 우리는 장 상피 세포주 및 일차 인간 림프구 무중력 상태 (24) (도 1)에서 배양 내피 세포 및 섬유 아세포 이루어진 인간 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델을 설계했다. 섬유 아 세포와 내피 세포는 내가 추가 장내 지하 막 단백질 45 (예., 라미닌, 콜라겐 IV, 피브로넥틴 및 헤파린 황산 프로테오글리칸) 풍부 행렬 콜라겐에 포함하고 생물 반응기를 RWV 추가되었습니다. 10 후 - 십오일 조직 학적 염색 분석은 구조의 융모와 같은 구조의 존재를 입증 하였다. 약 60 -이 상피 세포의 80 %는 잘 분화 된 세포 (그림 2)의 주요 특징 인 ECM, 근처의 기초 위치에있는 자신의 핵으로 편광 세포의 단일 층으로 구성되었다.

    1 "> :"유지 - together.within 페이지 = FO "천만에 그림 1
    그림 1 : 3-D 모델의 건설 다이어그램. 네 단계는 3-D 시스템을 구축하는 것이 필수적이다. 우선, 3-D 모델은 인간의 장내 enterocyte 상피 세포주 (HCT-8) 및 일차 인간 내피 세포 및 섬유 아세포는 2-D 융합 성 단층으로 성장을 생성하는 세포의 필요한 수를 얻었다. 둘째로, 구성되는 ECM 콜라겐-I 추가 직감 기저막 단백질 농축는 매트릭스 (예., 라미닌, 콜라겐 IV, 피브로넥틴 및 헤파린 설페이트 프로테오글리칸)를 제조한다. 셋째, 섬유 아 세포와 내피 세포는 콜라겐 I 혼합물에 포함하고, 또한 HCT-8 상피 세포 다음에 생물 반응기를 RWV에 추가됩니다. 넷째, 주요 림프구 일 4, 9 (± 1 일)에 문화에 추가됩니다.">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 2
    그림 2 : 일반 인간의 소장과의 Organotypic 모델 간의 비교. 헤 마톡 실린 및 3 차원 미세 중력 모델에서 배양 된 세포의 에오신 염색 : 조직 보라색 염색 및 발판 핑크 스테인드. 3-D 모델에서 세포 배양 하였다 (14) ( "A"와 "B") 및 20 일 (다). 스물 일 파종 한 후, 총 세포 수를 유지하고, 세포가 잘 분화를 보여주는 융모와 같은 기능을했다. 이미지는 100X에서 ( "A"와 "B")와 40 배 ( "C") 확대. 표시되는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.를

    상품명 PKG. 크기 재구성 작업 농도 저장
    섬유 아세포 성장 인자 - 기본 (bFGF를) 25 mg의 25 μg의 / ㎖ 주식 솔루션을 준비하려면, 무균 배지 1 ㎖ (RPMI 플러스 1 % FCS), 소용돌이, 용해 100 μL / 분취 량을 추가로 FGF 25 μg의 추가 5 NG / ㎖ 분말 -20 C, 작업 분취 -20 C O를 반복 동결을 방지 / 해동
    줄기 세포 인자 (SCF) 10 mg의 10 μg의 / ㎖ 주식 솔루션을 준비하려면, 무균 배지 1 ㎖ (RPMI 플러스 1 % FCS), 소용돌이, 용해 250 μL / 분취 량을 추가로 SCF의 10 μg의 추가 5 NG / ㎖ 분말 -20 C, 작업 분취 -20 C O를 반복 동결을 방지 / 해동
    간세포 성장 인자 (HGF) 5 mg의 5 μg의 / ㎖ 주식 솔루션을 준비하려면, 무균 배지 1 ㎖ (RPMI 플러스 1 % FCS), 소용돌이, 용해 200 μL / 분취 량을 추가로 HGF의 5 μg의 추가 2 NG / ㎖ 분말 -20 C, 작업 분취 -20 C O를 반복 동결을 방지 / 해동
    엔도 텔린 (3) 50 mg의 50 μg의 / ㎖ 주식 솔루션을 준비하려면, 무균 배지 1 ㎖ (RPMI 플러스 1 % FCS), 소용돌이, 용해 100 μL / 분취 량을 추가로 Endotelin의 50 μg의 추가 10 ng를 / ㎖ 분말 -20 C, 작업 분취 -20 C O를 반복 동결을 방지 / 해동
    라미닌 1 mg의 2에서 천천히 해동 - 8 O를 C, 소용돌이, 100 μL / 나누어지는 추가 10 ㎎ / ㎖ 액체 -20 O를 C는, 분취 -20 O를 C 작업, 반복 FRE을 피하기겔 / 해동
    혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 10 mg의 5 μg의 / ㎖ 주식 솔루션을 준비하려면, 멸균 2 ㎖로 VEGF의 10 μg의 추가, 소용돌이, 용해 100 μL / 나누어지는을 추가 1 NG / ㎖ 분말 -20 C, 작업 분취 -20 C O를 반복 동결을 방지 / 해동
    백혈병 억제 인자 (LIF) 50 mg의 20 μg의 / ㎖ 주식 솔루션을 준비하려면, 멸균 물 2.5 ml의에 LIF의 50 μg의 추가, 소용돌이, 용해 100 μL / 나누어지는을 추가 4 NG / ㎖ 분말 -20 C, 작업 분취 -20 C O를 반복 동결을 방지 / 해동
    아데닌 25g 0.18 M 스톡 용액을 제조하는 단계; 0.05 M 염산 50 ㎖) (물 50 ㎖로 37.1 %의 HCl 250 μL)로 121.5 mg을 og의 adedine을 추가, 소용돌이가 용해, 필터 소독 및1 ml에 추가 / 나누어지는 1.8 × 10 -3 M 분말 4 O를 C, 작업 분취 -20 O를 C, 반복 동결을 방지 / 해동
    인슐린 50 mg의 5 ㎎ / ㎖ 저장 용액을 제조하는 단계; ), 소용돌이, 용해 필터 소독 0.5 ml에 추가 (물 10ml에 5 μL 37.1 %의 염산) 0.005 M 염산 10 ㎖로 인슐린의 50mg을 추가 / 나누어지는 5 ㎎ / ㎖ 분말 -20 C, 작업 분취 -20 C O를 반복 동결을 방지 / 해동
    T3 100 mg의 2 × 10-8 M 스톡 용액을 제조하는 단계; 1 M NaOH를 25 ㎖로 T3 3.4 mg을 추가 PBS 9.9 ㎖ 중에,이 용액 0.1 mL로 희석 살균 소용돌이 용해하는 PBS 9.9 ㎖ 중에 다시이 용액 0.1 mL로 희석 필터 0.5ml를 추가 / 분취 2 × 10 -11 M 분말 -20 O를 C, 작업 분취 -20 <SUP> 오 C, 반복 동결을 방지 / 해동
    콜레라 독소 5 mg의 10 -7 M 주식 솔루션을 준비하려면, 5 ml의에 콜레라 독소의 5 mg의 추가 멸균 DDH 2 O (저장 -20 O C에서) 5 ML의 DDH 2 O에이 용액 50 μl를 희석, 소용돌이 균질화, 필터 소독 및 0.5 ㎖ / 나누어지는을 추가 10 -10 M 분말 4 - 8 O를 C, 작업 분취 -20 C를 반복 동결을 방지 / 해동
    피브로넥틴 1 mg의 1 ㎎ / ㎖ 저장 용액을 제조하는 단계; 멸균 distiled 물 1 ㎖에 피브로넥틴의 1 밀리그램을 추가합니다. 30 분을 허용합니다. 재료 솔루션으로 이동합니다. 선동 또는 SWIRL하지 마십시오. 100 μL / 나누어지는 추가 10 ㎎ / ㎖ 분말 4 - 8 O를 C, 작업 분취 -20 C를 반복 동결을 방지 / 해동
    아포 트랜스페린 100 mg의 (1000 배)을 5 ㎎ / ㎖ 저장 용액을 제조하는 단계; 용해 PBS 소용돌이 20 ㎖로 트랜스페린 100 mg의 추가, 필터는 살균 및 0.5 ㎖ / 나누어지는 추가 5 ㎎ / ㎖ 분말 -20 C, 작업 분취 -20 C O를 반복 동결을 방지 / 해동
    헤파린 50 KU (1000 배)를 50 ㎎ / ㎖ 저장 용액을 제조하는 단계; 용해 물 소용돌이 1 ㎖에 헤파린의 50 mg의 추가, 필터는 살균 및 1 ㎖ / 나누어지는 추가 0.1 ㎎ / ㎖ 분말 -20 C, 작업 분취 -20 C O를 반복 동결을 방지 / 해동
    헤파 란 황산 프로테오글리칸 1 mg의 0.1 ㎎ / ㎖ 저장 용액을 제조하는 단계; 용해 멸균 소용돌이 10 ㎖로 헤파 란 황산 1 mg의 추가, 0.2 ml의 추가 / 나누어지는 2 ㎎ / ㎖ 분말 -20 O를 C, 작업 분취 -20 C O를 피하기반복 동결 / 해동
    콜라겐 IV 5 mg의 2 ㎎ / ㎖ 스톡 solutin를 준비하려면 : 멸균 0.25 % 아세트산 2.5 ml의에 콜라겐 V의 2 mg을 추가합니다. 솔루션에 갈 재료 2 시간 더 dillution에 대한 소용돌이 - 1을 허용합니다.. 400 μL / 나누어지는 추가 80 ㎎ / ㎖ 분말 -20 C, 작업 분취 -20 C O를 반복 동결을 방지 / 해동

    표 1 : 정의 중간 보충 준비.

    F-12 중간 보충
    시약 원액 최종 솔루션
    소 태아 혈청 10 % 50 ㎖
    피루브산 나트륨 100 밀리미터 1 ㎜ 5 ml의
    L 글루타민 200 밀리미터 2 밀리미터 5 ml의
    헤 페스 1 M 10 mM의 5 ml의
    겐타 마이신 50 ㎎ / ㎖ 50 μg의 / ㎖ 500 μL
    페니실린 / 스트렙토 마이신 10,000 U / ㎖ / 10 ㎎ / ㎖ 100 U / ㎖ / 100 μg의 / ㎖ 5 ml의
    인슐린 5 ㎎ / ㎖ 5 μg의 / ㎖ 500 μL
    T3 2 × 10-8 M 2 × 10 -11 M 500 μL
    아데닌 1.8 × 10-1 M 1.8 × 10-3 M 5 ml의
    트랜스페린 5 μg의 / ㎖ 500 μL
    헤파린 50 ㎎ / ㎖ 0.1 ㎎ / ㎖ 1 ml의
    심전도 3 ㎎ / ㎖ 3 μg의 / ㎖ 5 ml의
    bFGF를 25 μg의 / ㎖ 5 NG / ㎖ 100 μL
    SCF 10 μg의 / ㎖ 5 NG / ㎖ 250 μL
    HGF 5 μg의 / ㎖ 2 NG / ㎖ 200 μL
    엔도 텔린 (3) 50 μg의 / ㎖ 10 ng를 / ㎖ 200 μL
    LIF 20 μg의 / ㎖ 4 NG / ㎖ 100 μL
    VEGF 5 μg의 / ㎖ 1 NG / ㎖ 100 μL
    Choleran 독소 10 -7 M 10 -10 M 500 μL </ TD>
    주 : 상기 언급 한 양의 3-D 배양 배지 500 ml를 준비한다. 미디어없이 2 주 이상 4 ° C에서 저장해야합니다

    표 2 : 3-D 문화 미디어의 준비.

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    Discussion

    이 논문에서는 일차 인간 림프구, 섬유 모세포, 및 내피 세포뿐만 아니라 소장 상피 세포주를 포함한 24 배수 종류의 세포로 구성된 인간 장 점막의 생체 공학 모델의 개발을 기술한다. 이 3-D 모델에서 세포는 미세 중력 상태 (24)에서 콜라겐이 풍부한 세포 외 기질 내에서 배양된다.

    전술 한 바와 같이,이 모델의 주요 기능은 다음과 같다 : (i) 상피 조직의 단층 조직을 모방하는 능력, 상피 세포 꽉 접합, 데즈 모섬 및 융모 적절한 극성 (II) 유도 (ⅲ) 장기 높은 차 세포의 생존 능력 (예., 섬유 아세포 및 내피 세포)와 장기 문화 (20 일), (ⅳ) 표현 villin, 사이토 케라틴, E-cadherin의 및 무 포함하여 조직 등의 분화 마커CIN, (ⅴ) 기능은 사이토 카인의 상당량을 제조하기위한 (예., IL-8) 및 알칼리 항원 자극시 포스파타제 (VI) 등의 포도당 양분 (예., disaccharidases의 발현 전송 및 당의 존재 운송) 및 (ⅶ) 장내 상피 세포 (예., 흡수 enterocyte, 불의 잔 및 M 세포) (24)의 멀티 혈통 차별화.

    그 좋은 세포 배양 가이드 라인 46-48을 준수해야 우리의 3-D 모델 연구자를 사용하여 재현 가능한 결과를 달성하기 위해 강조하는 것이 중요하다. 이 체계적 생존, 마이코 플라스마 오염 세포 성장 거동의 변화에​​ 대한 셀을 제어하는​​ 것이 중요하다. 문제가 확인되면, 처음에는 승인되지 않은 변경 사항이 프로토콜에 소개되지 않았는지 확인합니다. 문제가 지속되면, 다양한 매체 구성 요소 (포함 혈청) 및 / 새로운 배치로 전환또는 셀. 우리의 3-D 모델의 한계는 종양 HCT-8 상피 세포주를 사용하는 것이다. 그러나, HCT-8 라인의 존재는 시판되는 장점을 제공하는 것을 고려하는 것이 중요하다. 또한,이 상피 세포는 고전적인 또는 비 고전 중 하나 인간 백혈구 항원 (HLA)을 표현하지 않는 -class 나는 49,50을 분자. 따라서, 그들은 내가 상피 세포 PBMC의 alloreactivity의 부재 일배 체형 다른 HLA-클래스의 PBMC와 상피 세포의 배양을 할 수 있습니다. 이러한 장내 줄기 세포 organoids 51-53로 시스템과이 시스템을 비교했을 때 또한,이 모델은 많은 이점을 제공합니다. 장내 줄기 세포 organoids는 세포 생물학 및 장 분화 51-53에 대한 귀중한 정보를 제공하지만,이 모델은 영양분, 약물과 병원체에 직접 혀끝의 노출을 허용합니다. 이 모델은 또한 내강 내용 등 항균 펩티드 및 사이토 카인에 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 반대로 organoids 유엔 소형그 안쪽에 직면 내강 표면. 따라서, 54 organoid 내강 내에 도입 될 수있다 제품의 제한된 양이 존재한다.

    우리는 인간의 장 점막의 우리의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델은 병원균과의 상호 작용, 항원 인신 매매 및 염증 및 대사 (24) 처리를 포함하여 건강과 질병 모두에서 발견하기위한 도구로서 폭 넓은 가능성을 가지고 있다고 생각합니다. 마지막으로 인하여 우리의 3-D 모델의 다세포 특성상, 우리 모델은 생체 내에서 상피 세포 행동에 영향을 미칠 가능성이 면역 세포 유형을 사용하여 이득이 손실 및 연구를 가능하게 할 수있다.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor  Synthecon RCCs-4DQ For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.
    Disposable 50 ml-vessel Synthecon D-405 Box with 4 vessels
    HCT-8 epithelial cells  ATCC CCL-244
    CCD-18Co Fibroblasts  ATCC CRL-1459
    Human Umbilical Vein Endothelial Cells ATCC CRL-1730 HUVEC
    Fibroblast Growth Factor-Basic  Sigma F0291 bFGF
    Stem Cell Factor  Sigma S7901 SCF
    Hepatocyte Growth Factor  Sigma H1404 HGF
    Endothelin 3 Sigma E9137
    Laminin Sigma L2020 Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor
    Vascular Endothelial Growth Factor  Sigma V7259 VEGF
    Leukemia Inhibitory Factor  Santa Cruz sc-4377 (LIF
    Adenine Sigma A2786
    Insulin Sigma I-6634
    3,3',5-triiodo-L-thyronine  Sigma T-6397 T3
    Cholera Toxin Sigma C-8052
    Fibronectin BD 354008 Isolated from human plasma
    apo-Transferrin Sigma T-1147
    Heparin Sigma H3149
    Heparan sulfate  proteoglycan Sigma H4777 Isolated from basement membrane of mouse  Engelbreth-Holm-Swarm tumor
    Collagen IV Sigma C5533 Isolated from human placenta
    Heat-inactivated fetal bovine serum  Invitrogen 10437-028
    D-MEM, powder Invitrogen 12800-017
    10% formalin–PBS  Fisher Scientific SF100-4
    Bovine type I collagen  Invitrogen A1064401
    Trypsin-EDTA  Fisher Scientific MT25-052-CI
    Sodium pyruvate Invitrogen 11360-070
    Gentamicin  Invitrogen 15750-060
    Penicillin/streptomincin  Invitrogen 15140-122
    L-Glutamine Invitrogen 25030-081
    Hepes Invitrogen 15630-080
    Ham's F-12 Invitrogen 11765-054
    Basal Medium Eagle Invitrogen 21010-046 BME
    RPMI-1640 Invitrogen 11875-093
    Endothelial Basal Medium Lonza CC-3156 EBM-2
    Endothelial cell growth supplement Millipore 02-102 ECGS

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

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