تطوير عضوي نموذج متعددة الخلايا ثلاثي الأبعاد من الأمعاء الغشاء المخاطي الإنسان نمت في ظل الجاذبية

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

خلايا تنمو في (3-D) بيئة ثلاثية الأبعاد تمثل تحسنا ملحوظا خلال زراعة الخلايا في بيئات 2-D (على سبيل المثال، قوارير أو أطباق). نحن هنا وصف تطوير نموذج عضوي النمط 3-D متعددة الخلايا في الغشاء المخاطي في الأمعاء البشرية المستزرعة في ظل انعدام الجاذبية التي تقدمها الدورية جدار الأوعية الدموية (RWV) المفاعلات الحيوية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity. J. Vis. Exp. (113), e54148, doi:10.3791/54148 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

لأن الخلايا التي تنمو في (3-D) بيئة ثلاثية الأبعاد لديها القدرة على سد العديد من الثغرات في زراعة الخلايا في بيئات 2-D (على سبيل المثال، قوارير أو أطباق). في الواقع، من المسلم به على نطاق واسع أن الخلايا المزروعة في قوارير أو أطباق تميل إلى التقليل من التمييز وفقدان الميزات المتخصصة التابعة للأنسجة التي تشتق منها. حاليا، هناك أساسا نوعان من نظم الاستزراع 3-D حيث هي المصنفة الخلايا في السقالات محاكاة المصفوفة خارج الخلية الأم (ECM): (أ) نماذج ثابتة ونماذج (ب) باستخدام المفاعلات الحيوية. كان الانطلاقة الأولى للساكنة نماذج 3-D. نماذج 3-D باستخدام المفاعلات الحيوية مثل الدورية جدار الأوعية الدموية (RWV) المفاعلات الحيوية هي تطور أكثر حداثة. تم تطوير المفهوم الأصلي للالمفاعلات الحيوية RWV في مركز جونسون للفضاء التابع لناسا في 1990s في وقت مبكر، ويعتقد أن التغلب على القيود المفروضة على نماذج ثابتة مثل تطوير ميتة، النوى الميتة. في المفاعلات الحيوية RWV قد تحايل عشرهو المشكلة عن طريق توفير ديناميات السوائل التي تسمح للنشر كفاءة من المواد المغذية والأكسجين. هذه المفاعلات الحيوية تتكون من قاعدة المدورة التي تعمل على دعم وتدوير شكلين مختلفين من السفن الثقافة التي تختلف من حيث النوع مصدر التهوية: (1) بطء تحول السفن الجانبي (STLVs) مع مكساج المشارك المحوري في المركز، أو (2 ) سفن ارتفاع نسبة الارتفاع (HARVs) مع الأوكسجين عبر، سيليكون المطاط غشاء نقل الغاز مسطح. هذه السفن تسمح نقل الغاز كفاءة مع تجنب تشكيل فقاعة ويترتب على ذلك الاضطراب. هذه الظروف تؤدي إلى تدفق الصفحي والحد الأدنى من قوة القص أن النماذج خفض الثقل (الجاذبية الصغرى) داخل سفينة الثقافة. نحن هنا وصف تطوير نموذج عضوي النمط 3-D متعددة الخلايا في الغشاء المخاطي المعوي البشري يتكون من خط الأمعاء الظهارية الخلايا والخلايا الليمفاوية الإنسان الأساسية، والخلايا البطانية والخلايا الليفية مثقف تحت الجاذبية الصغرى التي تقدمها مفاعل حيوي RWV. </ P>

Introduction

وذكرت تقارير ان الانطلاقة الأولى في بناء نموذج 3-D في وقت مبكر من 1980s عندما بدأ العلماء للتحقيق في أنواع مختلفة من سقالة (على سبيل المثال، laminin، نوع الكولاجين الأول، الكولاجين الرابع، والفيبرونكتين) والكوكتيلات من عوامل النمو لتحسين خلية الى خلية والتفاعلات ECM من "ثابت" نماذج 3-D 1-7. ومنذ ذلك الحين، كانت المشكلة الرئيسية مع هذه النماذج القيود في نقل المواد المغذية والأكسجين داخل المتوسطة والأنسجة يبني 8. وعلى النقيض من الخلايا في البيئة في الجسم الحي الذي يتلقى تدفق مستمر من المواد المغذية والأكسجين من المحيط شبكات الأوعية الدموية، وطبيعة ثابتة من هذه النماذج تعيق التوزيع الفعال منهم إلى الخلايا. على سبيل المثال، سوف المجاميع خلية ولدت في في المختبر النماذج الثابتة التي تتجاوز بضعة ملليمترات في حجم تتطور دائما ميتة، النوى الميتة 9. في المفاعلات الحيوية RWV قد تحايل على هذه المشكلةمن خلال توفير ديناميات السوائل التي تسمح للنشر أكفأ من المغذيات والأكسجين 10-12. ومع ذلك، حتى الآن، العمل باستخدام المفاعلات الحيوية RWV اقتصرت على إدراج واحد أو اثنين من أنواع الخلايا 13-17. وعلاوة على ذلك، بدلا من التوجه المكاني مماثلة لأنسجة الأم، تلك الخلايا شكلت المجاميع الخلية. وكان السبب الرئيسي لهذه القيود عدم وجود سقالة قادرة على دمج الخلايا بطريقة متكاملة. السقالات المستخدمة في المفاعلات الحيوية RWV حتى الآن تتكون، مع استثناءات قليلة 16-18، وذلك أساسا من ميكروبيدات الاصطناعية، واسطوانات أنبوبي أو ورقة صغيرة 13-15،19-23. هذه هي مواد شديدة تركيبتها والمرونة لا يمكن التلاعب بها، والتي تعلق الخلايا إلى سطحها. وبالتالي، فإنه من غير المحتمل أن هذه النماذج سيوفر النظام الذي لتقييم وبطريقة متكاملة، ومختلف مكونات الخلية مثل خلايا انسجة (على سبيل المثال، الخلايا الليفية، الخلايا المناعية والبطانية) أن لياليأن تفرق hould معها داخل سقالة لتقليد بشكل وثيق الأنسجة البشرية.

نحن هنا وصف تطوير نموذج عضوي النمط 3-D متعددة الخلايا في الغشاء المخاطي المعوي البشري يتكون من خط الأمعاء الظهارية الخلايا والخلايا الليمفاوية الإنسان الأساسية، والخلايا البطانية، والخلايا الليفية 24. وكانت هذه الخلايا المستزرعة تحت الجاذبية الصغرى تقدم من قبل مفاعل حيوي RWV 13،25-30. في نموذجنا 3-D، إدارة المحتوى في المؤسسة تمتلك العديد من الخصائص المتميزة، مثل الأسمولية مماثلة إلى مستنبت (على سبيل المثال، القيود الأنتشارى تذكر خلال ثقافة)، والقدرة على دمج الخلايا وغيرها من البروتينات المصفوفة خارج الخلية ذات الصلة، فضلا عن صلابة مناسبة لاستخدامها في المفاعلات الحيوية 24. النظم البيولوجية معقدة جدا، وعلى مدى السنوات القليلة الماضية، كان هناك تحول في التركيز على البحوث المخاطية نحو دراسة التفاعلات الخلية مع محيطهم بدلا من دراستها في isolatioن. على وجه الخصوص، على أهمية التفاعلات خلية خلية في التأثير على بقاء الخلية المعوية والتمايز موثق جيدا 31-34. على وجه التحديد، والاتصالات بين الخلايا الظهارية ومكانها المناسب له تأثير عميق على توسيع الخلايا الظهارية والتمايز 35. في الواقع، ومن المسلم به على نطاق واسع ليس فقط من خلية إلى خلية لكن أيضا التفاعلات الخلية الى ECM حاسمة لصيانة وتمايز الخلايا الظهارية في نماذج الثقافة 3-D. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن البروتينات الأمعاء ECM مثل الكولاجين أنا 24،36،37، laminin 38 و 39 الفيبرونكتين دور فعال في التأثير على الخلايا الظهارية في الأمعاء للحصول على التوجه المكاني على غرار الغشاء المخاطي الأصلي. وهكذا، وتطوير التكنولوجيات الجديدة، مثل لدينا نموذج 3-D 24، التي يمكن أن تحاكي مطلوب تنوع المظهري للامعاء إذا تنوي الباحثين لإعادة العمارة الخلوية والهيكلية المعقدةوظيفة المكروية القناة الهضمية. وتمثل هذه النماذج أداة هامة في تطوير وتقييم الأدوية عن طريق الفم الجديدة واللقاحات المرشحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان الأخلاق: جمعت جميع عينات الدم من المتطوعين الذين شاركوا في عدد بروتوكول HP-00040025-1. وافقت جامعة ميريلاند مجلس المراجعة المؤسسية هذا البروتوكول وأذن جمع عينات الدم من المتطوعين الأصحاء للدراسات المدرجة في هذه المخطوطة. وأوضح أن الغرض من هذه الدراسة للمتطوعين، وجميع المتطوعين أعطى علم، وقعت الموافقة قبل سحب الدم.

ملاحظة: انظر الجدول رقم 1 لإعداد ملحق المتوسط. انظر الجدول 2 لإعداد وسائل الإعلام والثقافة 3-D.

1. إعداد السفن الثقافة

  1. فك الغطاء من ميناء تعبئة من مل الأوعية الدموية 50 وملء مع 50 مل من مستنبت معقم (على سبيل المثال، RPMI). تنفيذ كافة الإجراءات تحت ظروف معقمة في غطاء الصفحي.
  2. استبدال الغطاء ومسح أي وسيط المسكوب على أي سطح مع 70٪ من الإيثانول.
  3. السماح للسفينة إلى incubأكل لمدة 15 دقيقة على الأقل إلى O / N في RT.
  4. استخدام منفذ التعبئة لتجاهل مستنبت وإضافة 30 مل من 3-D مستنبت.
  5. مسح أي وسيط المسكوب على أي سطح مع 70٪ من الإيثانول.

2. إعداد خلايا

  1. خط الظهاري البشري خلية (HCT-8) 24،40.
    1. ثقافة الخلايا في RPMI تستكمل مع 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، 2 مم L-الجلوتامين، 1 ملم البيروفات الصوديوم، و 10 ملي HEPES العازلة و 10٪ للحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS ) (ملحق 1). في 70٪ confluency، تقسيم الخلايا في نسبة 1: 5.
  2. الليفية القولون الإنسان (خلايا CCD-18Co) 24،41.
    1. ثقافة الخلايا في متوسطة بصل النسر المخصب مع الملحق 1 في confluency، تقسيم الخلايا في نسبة 1: 3.
  3. السري الإنسان الوريد غشائي (HUVEC) خلايا
  4. خلايا الثقافة في غشائي بصل متوسطة (EBM) إثراء المتوسطة مع 100 ميكروغرام / مل الهيبارين، 3 ميكروغرام / مل البطانية الملحق نمو الخلايا (رسم القلب)، وتكملة 1 في 70٪ confluency، تقسيم الخلايا في نسبة 1: 2.
  • اللمفاويات / وحيدات
    1. عزل الخلايا وحيدة النواة في الدم المحيطي (PBMC) من الدم عن طريق الطرد المركزي التدرج الكثافة باستخدام التقنيات القياسية 43.
      1. لفترة وجيزة، وذلك باستخدام 10 مل ماصة، إضافة بعناية 30 مل من الدم المخفف (1: 1 الدم: الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)) في أنبوب 50 مل مخروطي الشكل تحتوي على 10 مل من وسائل الاعلام الكثافة الطرد المركزي. بعد الخطوة الطرد المركزي، والخلايا الليمفاوية وحيدات يقيم في طبقة "البيضاء" بين وسائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي وطبقات البلازما.
      2. جمع الطبقة البيضاء باستخدام ماصة نقل. تجنب التلوث محببة عن طريق الحد من مجموعة من وسائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي. بعد غسل 43، شحد ذاته PBMC كما هي أو cryopreserved في السائل N 2.
        ملاحظة: من المهم تسليط الضوء على أن PBMC تتكون إلى حد كبير من الخلايا الليمفاوية وحيدات، مع نسبة ضئيلة من الخلايا الجذعية وأنواع الخلايا الأخرى.
  • تنمو كل الخلايا تحت ظروف التربية قياسية عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO 2.
  • 3. إعداد خلايا الكولاجين جزءا لا يتجزأ،

    1. تحديد عدد إدراج احتاج استنادا إلى أرقام من الظروف التجريبية ليتم انشاء. ضع العدد المناسب من يدخل في الآبار من لوحة 6 جيدا.
    2. إعداد تعليق HUVEC والخلايا الليفية:
      1. غسل القوارير مرتين في برنامج تلفزيوني وفصل الخلايا باستخدام التربسين، 0.25٪ (1X) مع ethylenediaminetetraacetate 0.05٪ التربسين- تيتراصوديوم (التربسين-EDTA). إضافة ما يكفي من حل التربسين لتغطية مجمل مساحة زراعة الخلايا. يحدث انفصال عادة في غضون 5 إلى 15 دقيقة
      2. جمعخلايا منفصلة في 50 مل أنبوب تحتوي على 30 مل من المتوسط ​​التعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM) -30٪ FBS المتوسطة.
      3. أنبوب الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 10 دقيقة.
      4. resuspend الخلايا في 30 مل من DMEM 30٪ FBS المتوسطة.
      5. عد العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة عن طريق تمييع 20 ميكرولتر من معلق الخلايا مع 20 ميكرولتر من التريبان صبغة زرقاء. تحميل عدادة الكريات مع خليط الخلية. سوف PBMCs قابلة للحياة تكون بيضاء واضحة. سوف nonviable PBMC اكتساب صبغة وأصبح الأزرق.
        1. resuspend كل نوع من الخلايا في DMEM 30٪ FBS المتوسطة بتركيز 5-8 × 10 7 خلايا مل - 1.
    3. إعداد المواد الهلامية الكولاجين التي تحتوي على خلية
      ملاحظة: كل سفينة يتطلب إعداد ~ 5 مل من هلام الكولاجين التي تحتوي على الخلية.
      1. في أنبوب 50 مل مخروطي تحضير الخليط الكولاجين عن طريق إضافة 1 وسائل الاعلام س DMEM، على أن تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، 2 مم L-الجلوتامين و 10٪ للحرارة inactivatإد FBS زائد 3 ملغ / مل البقري الكولاجين-I، 10 ميكروغرام / laminin مل و 40 ميكروغرام / مل الكولاجين الرابع، 10 ميكروغرام / مل فبرونيكتين، 2 ميكروغرام / مل الهيبارين بروتيوغليكان كبريتات و 15 ملي هيدروكسيد الصوديوم (للوصول إلى درجة الحموضة الفسيولوجية).
      2. إغلاق أنبوب وتخلط بواسطة قلب عدة مرات حتى يتم المتجانس الخليط تماما. تجنب تشكيل فقاعة.
        هام: حافظ على الخليط على الجليد لمنع gelification.
        1. خطوة حاسمة: إذا تطور خليط ظهور الحمضية (صفراء اللون)، إضافة بضع قطرات من معقم 1 N هيدروكسيد الصوديوم لتحييد الخليط.
      3. إضافة HUVEC المركز والخلايا الليفية في مناطق ذات كثافة من 1،0-1،2 و1،5-2،0 × 10 6 خلية / مل على التوالي إلى المخصب الكولاجين خليط (المذكورة أعلاه). إغلاق أنابيب وتخلط بواسطة قلب عدة مرات حتى يتم المتجانس الخليط تماما. تجنب تشكيل فقاعة. هام: حافظ على الخليط على الجليد لمنع gelification.
      4. إضافة 4-5 مل من الكولاجين التي تحتوي على خليةهلام إلى كل إدراج، وتحميلها من قبل في بئر لوحة 6، والسماح للgelify في غطاء محرك السيارة مع حركة قليلة أو معدومة لمدة 1 ساعة.
      5. بعد 1 ساعة، ونقل لوحة 6 جيدا إلى 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 حاضنة لل1-2 ساعات إضافية.
      6. العودة لوحة 6 جيدا لغطاء محرك السيارة، وبمساعدة ملقط معقم ومشرط قطع جو معقم و مطهر الغشاء من إدراج فصل الجل التي تحتوي على خلية من الغشاء. قطع هلام منفصلة إلى مربعات صغيرة (~ 5 × 5 مم).
      7. إضافة مربعات صغيرة تحتوي على الخلية في حارف 50 مل باستخدام منفذ التعبئة.
    4. إعداد تعليق كليات التقنية العليا-8 خلايا الظهارية:
      1. غسل القوارير مرتين في برنامج تلفزيوني وفصل الخلايا باستخدام التربسين، 0.25٪ (1X) مع العلاج التربسين-EDTA. إضافة ما يكفي من حل التربسين لتغطية مجمل مساحة زراعة الخلايا. يحدث انفصال عادة في غضون 10 إلى 15 دقيقة.
      2. جمع خلايا منفصلة في 30 مل من DMEM 30٪ FBS المتوسطة.
      3. Centrifأويغه DMEM 30٪ FBS المتوسطة التي تحتوي على أنبوب في 500 x ج لمدة 10 دقيقة.
      4. resuspend الخلايا في 30 مل من DMEM 30٪ FBS المتوسطة.
      5. عد العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة كما هو موضح في 3.2.5.
      6. Resuspend وكليات التقنية العليا-8 الخلايا الظهارية في DMEM 30٪ FBS المتوسطة بتركيز 10 7 خلايا مل - 1.
      7. إضافة 1 مل من كليات التقنية العليا-8 خلايا الظهارية المركزة في حارف 50 مل باستخدام منفذ التعبئة.
    5. باستخدام منفذ التعبئة، إضافة إضافي مستنبت 3-D حتى السفينة كاملة تقريبا (~ 20 مل).
    6. استبدال الغطاء ومسح الشفة من ميناء ملء مع 70٪ من الإيثانول.
    7. وضع حقنة في كل منفذ حقنة من RWV: وضع 5 مل حقنة تحتوي على 3-4 مل من 3-D مستنبت في منفذ واحد وحقنة 5 مل فارغة في منفذ آخر.
    8. إزالة أي فقاعات مرئية عن طريق سحب في حقنة فارغة في حين يتم حقن تقريبا نفس حجم المتوسط ​​عبر ميناء حقنة أخرى.
    9. ضع فيسSELS في مفاعل حيوي، تشغيل الطاقة وضبط سرعة إلى حوالي 13-14 التناوب في الدقيقة الواحدة.
      ملاحظة: خطوة حاسمة: قد تحتاج معدل دوران لتعديلها عدة مرات خلال تجربة للحفاظ على الخلايا التي تدور داخل السفينة، وبالتالي تجنب الاتصال مع جدران الأوعية.
    10. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 تحت الجاذبية الصغرى، التي تقدمها مفاعل حيوي RWV.
    11. تغيير الثقافة المتوسطة كل 3-4 أيام عن طريق استبدال حوالي 30 مل مع الطازجة مستنبت 3-D.
    12. بعد 4 أيام (± 1 يوم)، وإزالة السفن من مفاعل حيوي وإضافة الخلايا الليمفاوية / حيدات في الأوعية (2 × 10 7 / سفينة).
    13. وضع السفن مرة أخرى في مفاعل حيوي عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 5 أيام إضافية (± 1 يوم).
    14. بعد 5 أيام إضافية (يوم 9 من ثقافة)، إضافة اللمفاويات / حيدات في الأوعية (2 × 10 7 / سفينة) ومواصلة الثقافات لمدة تصل إلى 12 يوما إضافية. تغيير الثقافة المتوسطة كل 3-4 أيام عن طريق استبدال حوالي 30 مل مع الطازجة مستنبت 3-D.

    4. حصاد الثقافات 3-D للعلم الأنسجة

    1. مع المعونة من الحصاد ماصة نقل كل جزء هلام الصغيرة، التي تسمى الآن "بناء" في لوحة ستة جيدا تحتوي على 10 مل من العازلة الفورمالين 10٪. يترك لمدة 3 ساعة على RT أو 12-16 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    2. إعداد وتجهيز الأنسجة وأشرطة التضمين عن طريق وضع العلامات وإضافة قطعتين من منصات خزعة الرغوة في كل الكاسيت.
    3. تزج الأشرطة العازلة في الفورمالين 10٪.
    4. بمساعدة ملقط وضع بنيات-ثابت بين فوم اثنين.
    5. تزج الأشرطة العازلة في الفورمالين 10٪.
    6. السير في الإجراءات القياسية لالتضمين، باجتزاء، وتلطيخ 44.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    سابقا كنا المهندسة 3-D نموذج عضوي النمط متعددة الخلايا في الغشاء المخاطي المعوي البشري يتكون من خط الأمعاء الظهارية الخلايا والخلايا الليمفاوية الإنسان الأساسية، والخلايا البطانية والخلايا الليفية مثقف في ظل ظروف الجاذبية الصغرى 24 (الشكل 1). كانت جزءا لا يتجزأ الخلايا الليفية والخلايا البطانية في الكولاجين أنا المصفوفة المخصب مع إضافي الأمعاء الطابق السفلي بروتينات غشاء 45 (أي، laminin، الكولاجين الرابع، فبرونيكتين وكبريتات الهيبارين بروتيوغليكان) وتضاف إلى RWV المفاعلات الحيوية. بعد 10-15 يوما، أظهر تحليل تلطيخ النسيجي وجود هياكل تشبه زغابة في بنيات. ما يقرب من 60 - نظمت 80٪ من هذه الخلايا الظهارية كما أحادي الطبقة من الخلايا الاستقطاب مع النواة تقع في موقف القاعدية بالقرب من ECM، الذي هو سمة رئيسية من الخلايا المتمايزة جيدا (الشكل 2).

    والأنف والحنجرة "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> شكل 1
    الشكل 1: رسم تخطيطي لتشييد 3-D النموذجي. ضرورية لبناء نظام 3-D أربع خطوات. أولا، للحصول على العدد المطلوب من الخلايا لتوليد نموذج 3-D، خط البشري الأمعاء خلية خلية معوية الظهارية (HCT-8) وتزرع الخلايا البطانية الإنسان الأساسية والخلايا الليفية مثل الطبقات الوحيدة متكدسة 2-D. ثانيا، ECM تتألف من الكولاجين أنا المصفوفة المخصب مع بروتينات غشاء الأمعاء إضافية الطابق السفلي (أي، laminin، الكولاجين الرابع، فبرونيكتين والهيبارين كبريتات بروتيوغليكان) يتم إعدادها. ثالثا، هي جزء لا يتجزأ الخلايا الليفية والخلايا البطانية في خليط الكولاجين-I وتضاف إلى RWV المفاعلات الحيوية تليها كليات التقنية العليا-8 خلايا الظهارية الإضافة. رابعا، تضاف الخلايا الليمفاوية الأولية للثقافة في أيام 4 و 9 (± 1 يوم). "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل 2
    الشكل 2: مقارنة بين عادي الأمعاء الإنسان ونماذج عضوي النمط. الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ الخلايا المستزرعة في نموذج الجاذبية الصغرى 3-D: كانت ملطخة الأنسجة الأرجواني وسقالة ملطخة الوردي. وكانت الخلايا من نموذج 3-D تربيتها لمدة 14 ( "أ" و "ب") و 20 يوما (ج). بعد عشرين يوما البذر، يتم الاحتفاظ مجموع أعداد الخلايا، وكانت خلايا متباينة بشكل جيد الاداء ميزات مثل الزغب. يتم عرض الصور في 100X ( "أ" و "ب") و40X ( "ج") التكبير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    ithin الصفحات = "1">
    اسم المنتج PKG. حجم إعادة تركيز العمل تخزين
    الليفية عامل النمو الأساسي (bFGF) 25 ملغ لإعداد 25 ميكروغرام / مل حل الأسهم. إضافة 25 ميكروغرام من جمعية جيل المستقبل في 1 مل من المتوسط ​​العقيمة (RPMI زائد 1٪ FCS)، دوامة بحل، إضافة 100 ميكرولتر / قسامة 5 نانوغرام / مل مسحوق -20 درجة مئوية، قسامات العمل -20 درجة مئوية، وتجنب تكرار تجميد / الذوبان
    الجذعية عامل الخليوي (SCF) 10 ملغ لإعداد 10 ميكروغرام / مل حل الأسهم. إضافة 10 ميكروغرام من SCF إلى 1 مل من المتوسط ​​العقيمة (RPMI زائد 1٪ FCS)، دوامة بحل، إضافة 250 ميكرولتر / قسامة 5 نانوغرام / مل مسحوق -20 درجة مئوية، قسامات العمل -20 درجة مئوية، وتجنب تكرار تجميد / الذوبان
    عامل النمو الكبدية (HGF) 5 ملغ لإعداد 5 ميكروغرام / مل حل الأسهم. إضافة 5 ميكروغرام من HGF في 1 مل من المتوسط ​​العقيمة (RPMI زائد 1٪ FCS)، دوامة بحل، إضافة 200 ميكرولتر / قسامة 2 نانوغرام / مل مسحوق -20 درجة مئوية، قسامات العمل -20 درجة مئوية، وتجنب تكرار تجميد / الذوبان
    Endothelin 3 50 ملغ لإعداد 50 ميكروغرام / مل حل الأسهم. إضافة 50 ميكروغرام من Endotelin في 1 مل من المتوسط ​​العقيمة (RPMI زائد 1٪ FCS)، دوامة بحل، إضافة 100 ميكرولتر / قسامة 10 نانوغرام / مل مسحوق -20 درجة مئوية، قسامات العمل -20 درجة مئوية، وتجنب تكرار تجميد / الذوبان
    Laminin 1 ملغ ذوبان الجليد ببطء في 2-8 درجة مئوية، دوامة وإضافة 100 ميكرولتر / قسامة 10 ملغ / مل السائل -20 درجة مئوية، والعمل قسامات -20 درجة مئوية، وتجنب تكرار الصحائفإز / الذوبان
    الأوعية الدموية عامل النمو غشائي (VEGF) 10 ملغ لإعداد 5 ميكروغرام / مل حل الأسهم. إضافة 10 ميكروغرام من VEGF إلى 2 مل من الماء المعقم، دوامة بحل، إضافة 100 ميكرولتر / قسامة 1 نانوغرام / مل مسحوق -20 درجة مئوية، قسامات العمل -20 درجة مئوية، وتجنب تكرار تجميد / الذوبان
    سرطان الدم المثبط عامل (ليف) 50 ملغ لإعداد 20 ميكروغرام / مل حل الأسهم. إضافة 50 ميكروغرام من ليف إلى 2.5 مل من الماء المعقم، دوامة بحل، إضافة 100 ميكرولتر / قسامة 4 نانوغرام / مل مسحوق -20 درجة مئوية، قسامات العمل -20 درجة مئوية، وتجنب تكرار تجميد / الذوبان
    الأدينين 25 ز لإعداد 0.18 M حل الأوراق المالية، إضافة 121.5 ملغ أوغ adedine إلى 50 مل من حمض الهيدروكلوريك 0.05 م (250 ميكرولتر من 37.1٪ حمض الهيدروكلوريك إلى 50 مل من الماء))، دوامة بحل وتصفية تعقيم وإضافة 1 مل / قسامة 1.8 × 10 -3 م مسحوق 4 درجة مئوية، قسامات العمل -20 درجة مئوية، وتجنب تكرار تجميد / الذوبان
    الأنسولين 50 ملغ لإعداد 5 ملغ / مل محلول المخزون. إضافة 50 ملغ من الأنسولين إلى 10 مل من حمض الهيدروكلوريك 0.005 م (5 ميكرولتر من 37.1٪ حمض الهيدروكلوريك إلى 10 مل من الماء))، دوامة بحل وتصفية تعقيم وإضافة 0.5 مل / قسامة 5 ملغ / مل مسحوق -20 درجة مئوية، قسامات العمل -20 درجة مئوية، وتجنب تكرار تجميد / الذوبان
    T3 100 ملغ لإعداد 2 × 10 -8 M حل الأوراق المالية، إضافة 3.4 ملغ من T3 إلى 25 مل من 1 M هيدروكسيد الصوديوم، وتمييع 0.1 مل من هذا المحلول إلى 9.9 مل من برنامج تلفزيوني، ويخفف من جديد 0.1 مل من هذا المحلول إلى 9.9 مل من برنامج تلفزيوني، دوامة بحل وتصفية تعقيم وإضافة 0.5 مل / قسامة 2 × 10 -11 م مسحوق -20 درجة مئوية، قسامات العمل -20 <سوب> درجة مئوية، وتجنب تكرار تجميد / الذوبان
    الكوليرا السمية 5 ملغ لإعداد 10 -7 M حل الأوراق المالية، إضافة 5 ملغ من الكوليرا السم إلى 5 مل العقيمة O 2 DDH (مخزن في -20 درجة مئوية)؛ تمييع 50 ميكرولتر من هذا الحل إلى 5 مل ده 2 O، دوامة إلى التجانس، وتصفية تعقيم وإضافة 0.5 مل / قسامة 10 -10 م مسحوق 4-8 درجة مئوية، قسامات العمل -20 درجة مئوية، وتجنب تكرار تجميد / الذوبان
    الفيبرونكتين 1 ملغ لإعداد 1 ملغ / مل محلول المخزون. إضافة 1 ملغ من فبرونيكتين في 1 مل من الماء distiled العقيمة. سماح 30 دقيقة. للمواد للذهاب إلى حل. لا يثير انزعاج أو دوامة. إضافة 100 ميكرولتر / قسامة 10 ملغ / مل مسحوق 4-8 درجة مئوية، قسامات العمل -20 درجة مئوية، وتجنب تكرار تجميد / الذوبان
    APO-ترانسفيرين 100 ملغ لإعداد 5 ملغ / مل حل الأوراق المالية (1،000x)؛ إضافة 100 ملغ من ترانسفيرين إلى 20 مل من برنامج تلفزيوني دوامة بحل وتصفية تعقيم وإضافة 0.5 مل / قسامة 5 ملغ / مل مسحوق -20 درجة مئوية، قسامات العمل -20 درجة مئوية، وتجنب تكرار تجميد / الذوبان
    الهيبارين 50 KU لإعداد 50 ملغ / مل حل الأوراق المالية (1،000x)؛ إضافة 50 ملغ من الهيبارين في 1 مل من دوامة المياه بحل وتصفية تعقيم وإضافة 1 مل / قسامة 0.1 ملغ / مل مسحوق -20 درجة مئوية، قسامات العمل -20 درجة مئوية، وتجنب تكرار تجميد / الذوبان
    Heparan بروتيوغليكان كبريتات 1 ملغ لإعداد 0.1 ملغ / مل محلول المخزون. إضافة 1 ملغ من كبريتات heparan إلى 10 مل من دوامة مياه معقمة لحل وإضافة 0.2 مل / قسامة 2 ملغ / مل مسحوق -20 درجة مئوية، قسامات العمل -20 درجة مئوية، وتجنبتكرار تجميد / الذوبان
    الكولاجين الرابع 5 ملغ لإعداد 2 ملغ / مل solutin الأسهم: إضافة 2 ملغ من الكولاجين V إلى 2.5 مل من حمض الخليك العقيمة 0.25٪. السماح 1-2 ساعة لمادة أن يذهب إلى حل دوامة من أجل تحسين dillution. إضافة 400 ميكرولتر / قسامة 80 ملغ / مل مسحوق -20 درجة مئوية، قسامات العمل -20 درجة مئوية، وتجنب تكرار تجميد / الذوبان

    الجدول 1: يعرف متوسطة الملحق التحضير.

    F-12 متوسطة تستكمل مع
    كاشف حل الأسهم حل نهائي كمية
    مصل العجل الجنين 10٪ 50 مل
    البيروفات الصوديوم 100 ملي 1 ملم 5 مل
    L-الجلوتامين 200 ملي 2 مم 5 مل
    HEPES 1 M 10 ملي 5 مل
    جنتاميسين 50 ملغ / مل 50 ميكروغرام / مل 500 ميكرولتر
    البنسلين / الستربتومايسين 10،000 وحدة / مل / 10 ملغ / مل 100 U / مل / 100 ميكروغرام / مل 5 مل
    الأنسولين 5 ملغ / مل 5 ميكروغرام / مل 500 ميكرولتر
    T3 2 × 10-8 M 2 × 10 -11 م 500 ميكرولتر
    الأدينين 1.8 س 10-1 M 1.8 س 10-3 M 5 مل
    ترانسفيرين 5 ميكروغرام / مل 500 ميكرولتر
    الهيبارين 50 ملغ / مل 0.1 ملغ / مل 1 مل
    رسم القلب 3 ملغ / مل 3 ميكروغرام / مل 5 مل
    bFGF 25 ميكروغرام / مل 5 نانوغرام / مل 100 ميكرولتر
    SCF 10 ميكروغرام / مل 5 نانوغرام / مل 250 ميكرولتر
    HGF 5 ميكروغرام / مل 2 نانوغرام / مل 200 ميكرولتر
    Endothelin 3 50 ميكروغرام / مل 10 نانوغرام / مل 200 ميكرولتر
    LIF 20 ميكروغرام / مل 4 نانوغرام / مل 100 ميكرولتر
    VEGF 5 ميكروغرام / مل 1 نانوغرام / مل 100 ميكرولتر
    السم Choleran 10 -7 M 10 -10 م 500 ميكرولتر </ td>
    ملاحظة: المبلغ المذكور أعلاه هو لإعداد 500 مل من وسائل الاعلام والثقافة 3-D. يجب أن يتم تخزين وسائل الاعلام في 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 2 أسابيع

    الجدول 2: إعداد 3-D الثقافة وسائل الإعلام.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    في هذا المخطوط، وصفنا تطوير نموذج الهندسة البيولوجية من الغشاء المخاطي المعوي البشري يتكون من أنواع الخلايا مضاعفات بما في ذلك الخلايا الليمفاوية الإنسان الأساسية، الخلايا الليفية، والخلايا البطانية، وكذلك الأمعاء خطوط الخلايا الظهارية 24. في هذا النموذج 3-D، ومثقف خلايا داخل المصفوفة خارج الخلية الكولاجين الغنية في ظل ظروف الجاذبية الصغرى 24.

    كما هو موضح سابقا، وأبرز ملامح هذا النموذج هي: (أ) القدرة على تقليد تنظيم أحادي الطبقة الأنسجة الطلائية، (ب) تحريض القطبية المناسب من الخلايا الظهارية، منعطفات ضيقة، desmosomes والزغيبات الصغيرة، (ج) ومنذ فترة طويلة مصطلح الثقافة (تصل إلى 20 يوم) مع قابلية عالية من الخلايا الأولية (أي، الخلايا الليفية والخلايا البطانية)، (د) التعبير علامات التمايز مثل الأنسجة بما في ذلك villin، cytokeratin، كادهيرين E ومو[سن]، (ت) لديها القدرة على إنتاج كميات كبيرة من السيتوكينات (على سبيل المثال، IL-8) والفوسفاتيز القلوية على التحفيز الأنتيجين، (السادس) لنقل المواد الغذائية مثل الجلوكوز (أي، تعبيرا عن disaccharidases، وجود السكر ناقلات)، و (السابع) التفريق متعددة نسب الخلايا المعوية الظهارية (أي، خلية معوية الاستيعابية، globet والخلايا M) 24.

    ومن المهم التأكيد على أن تحقيق نتائج قابلة للتكرار استخدام لدينا نموذج 3-D المحقق يجب أن تلتزم المبادئ التوجيهية زراعة الخلايا جيدة 46-48. ومن الأهمية بمكان السيطرة بشكل منهجي الخلايا للبقاء، التلوث الميكوبلازما والتغييرات في السلوك نمو الخلايا. إذا تم التعرف على المشكلة، أولا التأكد من أن أي تغييرات غير مصرح بها وأدخلت على البروتوكول. إذا استمرت المشكلة، قم بالتبديل إلى دفعة جديدة من مختلف مكونات المتوسطة (بما في ذلك المصل) و /أو الخلايا. وجود قيود على نموذجنا 3-D هو استخدام مكون للأورام كليات التقنية العليا-8 خط الخلية الظهارية. ومع ذلك، فمن المهم أن نرى أن وجود كليات التقنية العليا-8 خط يوفر ميزة كونها متاحة تجاريا. وعلاوة على ذلك، وهذه الخلايا الظهارية لا تعبر عن أي الكلاسيكي أو غير الكلاسيكية مستضد الكريات البيض البشرية (HLA) من الدرجة أنا الجزيئات 49،50. وبالتالي، فإنها تسمح للثقافة الخلايا الظهارية مع PBMC مختلفة من الدرجة هلا أنا النسخ المتنوعة في غياب الظهارية alloreactivity خلية PBMC. وعلاوة على ذلك، عند مقارنة هذا النظام مع أنظمة مثل القناة الهضمية الخلايا الجذعية organoids 51-53، وهذا النموذج يقدم العديد من الفوائد. على الرغم من أن organoids الخلايا الجذعية الأمعاء توفر معلومات لا تقدر بثمن حول بيولوجيا الخلية والتمايز الأمعاء 51-53، يسمح هذا النموذج التعرض القمي مباشرة إلى المواد الغذائية والأدوية ومسببات الأمراض. يوفر هذا النموذج أيضا سهولة الوصول إلى محتويات اللمعية هذه الببتيدات المضادة للميكروبات والسيتوكينات. في المقابل، organoids يتم التعاقد الامم المتحدةمع سطح اللمعية التي تواجه الداخل. ونتيجة لذلك، هناك كمية محدودة من المنتجات التي يمكن إدخالها في عضي التجويف 54.

    ونحن نعتقد أن لدينا متعددة الخلايا 3-D نموذج عضوي النمط من الغشاء المخاطي المعوي البشري لديه واسعة النطاق إمكانات كأداة لاكتشاف في كل من الصحة والمرض، بما في ذلك التفاعل مع مسببات الأمراض، والاتجار مستضد، والتهابات وعمليات الأيض (24). وأخيرا، نظرا لطبيعة متعددة الخلايا من نموذجنا 3-D، يمكن أن نموذجنا تمكين دراسات فقدان gain- واستخدام أنواع الخلايا المناعية التي من المحتمل أن تؤثر على سلوك الخلايا الظهارية في الجسم الحي.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor  Synthecon RCCs-4DQ For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.
    Disposable 50 ml-vessel Synthecon D-405 Box with 4 vessels
    HCT-8 epithelial cells  ATCC CCL-244
    CCD-18Co Fibroblasts  ATCC CRL-1459
    Human Umbilical Vein Endothelial Cells ATCC CRL-1730 HUVEC
    Fibroblast Growth Factor-Basic  Sigma F0291 bFGF
    Stem Cell Factor  Sigma S7901 SCF
    Hepatocyte Growth Factor  Sigma H1404 HGF
    Endothelin 3 Sigma E9137
    Laminin Sigma L2020 Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor
    Vascular Endothelial Growth Factor  Sigma V7259 VEGF
    Leukemia Inhibitory Factor  Santa Cruz sc-4377 (LIF
    Adenine Sigma A2786
    Insulin Sigma I-6634
    3,3',5-triiodo-L-thyronine  Sigma T-6397 T3
    Cholera Toxin Sigma C-8052
    Fibronectin BD 354008 Isolated from human plasma
    apo-Transferrin Sigma T-1147
    Heparin Sigma H3149
    Heparan sulfate  proteoglycan Sigma H4777 Isolated from basement membrane of mouse  Engelbreth-Holm-Swarm tumor
    Collagen IV Sigma C5533 Isolated from human placenta
    Heat-inactivated fetal bovine serum  Invitrogen 10437-028
    D-MEM, powder Invitrogen 12800-017
    10% formalin–PBS  Fisher Scientific SF100-4
    Bovine type I collagen  Invitrogen A1064401
    Trypsin-EDTA  Fisher Scientific MT25-052-CI
    Sodium pyruvate Invitrogen 11360-070
    Gentamicin  Invitrogen 15750-060
    Penicillin/streptomincin  Invitrogen 15140-122
    L-Glutamine Invitrogen 25030-081
    Hepes Invitrogen 15630-080
    Ham's F-12 Invitrogen 11765-054
    Basal Medium Eagle Invitrogen 21010-046 BME
    RPMI-1640 Invitrogen 11875-093
    Endothelial Basal Medium Lonza CC-3156 EBM-2
    Endothelial cell growth supplement Millipore 02-102 ECGS

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Aumailley, M., Timpl, R. Attachment of cells to basement membrane collagen type IV. J Cell Biol. 103, 1569-1575 (1986).
    2. Buset, M., Winawer, S., Friedman, E. Defining conditions to promote the attachment of adult human colonic epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 23, 403-412 (1987).
    3. Fitzgerald, T. J., Repesh, L. A., Blanco, D. R., Miller, J. N. Attachment of Treponema pallidum to fibronectin, laminin, collagen IV, and collagen I, and blockage of attachment by immune rabbit IgG. Br J Vener Dis. 60, 357-363 (1984).
    4. Goetschy, J. F., Ulrich, G., Aunis, D., Ciesielski-Treska, J. Fibronectin and collagens modulate the proliferation and morphology of astroglial cells in culture. Int J Dev Neurosci. 5, 63-70 (1987).
    5. Paye, M., Lapiere, C. M. The lack of attachment of transformed embryonic lung epithelial cells to collagen I is corrected by fibronectin and FXIII. J Cell Sci. 86, 95-107 (1986).
    6. Pourreau-Schneider, N., et al. Estrogen response of MCF-7 cells grown on diverse substrates and in suspension culture: promotion of morphological heterogeneity, modulation of progestin receptor induction; cell-substrate interactions on collagen gels. J Steroid Biochem. 21, 763-771 (1984).
    7. Pratt, B. M., Harris, A. S., Morrow, J. S., Madri, J. A. Mechanisms of cytoskeletal regulation. Modulation of aortic endothelial cell spectrin by the extracellular matrix. Am J Pathol. 117, 349-354 (1984).
    8. Jessup, J. M., et al. Microgravity culture reduces apoptosis and increases the differentiation of a human colorectal carcinoma cell line. In vitro cellular & developmental biology - Animal. 36, 367-373 (2000).
    9. Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Res. 46, 5320-5329 (1986).
    10. Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat Med. 4, 901-907 (1998).
    11. Zwezdaryk, K. J., Warner, J. A., Machado, H. L., Morris, C. A., Honerzu Bentrup, K. Rotating cell culture systems for human cell culture: human trophoblast cells as a model. Journal of visualized experiments : JoVE. (2012).
    12. Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. Journal of visualized experiments : JoVE. (2012).
    13. Barrila, J., et al. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat Rev Microbiol. 8, 791-801 (2010).
    14. Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes and infection / Institut Pasteur. 8, 1813-1825 (2006).
    15. Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect Immun. 69, 7106-7120 (2001).
    16. Alcantara Warren, C., et al. Detection of epithelial-cell injury, and quantification of infection, in the HCT-8 organoid model of cryptosporidiosis. J Infect Dis. 198, 143-149 (2008).
    17. Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
    18. Lin, H. J., O'Shaughnessy, T. J., Kelly, J., Ma, W. Neural stem cell differentiation in a cell-collagen-bioreactor culture system. Brain Res. Dev Brain Res. 153, 163-173 (2004).
    19. He, L., et al. Increased proliferation and adhesion properties of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity. Intl Endo J. (2015).
    20. Straub, T. M., et al. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg Infect Dis. 13, 396-403 (2007).
    21. Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Lack of norovirus replication and histo-blood group antigen expression in 3-dimensional intestinal epithelial cells. Emerg Infect Dis. 19, 431-438 (2013).
    22. Goodwin, T. J., Schroeder, W. F., Wolf, D. A., Moyer, M. P. Rotating-wall vessel coculture of small intestine as a prelude to tissue modeling: aspects of simulated microgravity. Proc Soc Exp Biol Med. 202, 181-192 (1993).
    23. Goodwin, T. J., Jessup, J. M., Wolf, D. A. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol. 28, 47-60 (1992).
    24. Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Engineering of a multicellular organotypic model of the human intestinal mucosa. Gastroenterology. 141, 18-20 (2011).
    25. Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am J Physiol Renal Physiol. 281, 12-25 (2001).
    26. Cherry, R. S., Papoutsakis, E. T. Physical mechanisms of cell damage in microcarrier cell culture bioreactors. Biotech and Bioeng. 32, 1001-1014 (1988).
    27. Bergmann, S., Steinert, M. From Single Cells to Engineered and Explanted Tissues: New Perspectives in Bacterial Infection Biology. Int Rev Cell Mol Biol. 319, 1-44 (2015).
    28. Xu, B., et al. Simulated microgravity affects ciprofloxacin susceptibility and expression of acrAB-tolC genes in E. coli ATCC25922. Int J Clin Exp Pathol. 8, 7945-7952 (2015).
    29. Han, C., Jiang, C., Yu, C., Shen, H. Differentiation of transforming growth factor beta1-induced mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under simulated microgravity conditions. Cell Mol Biol (Noisy-le-Grand, France). 61, 50-55 (2015).
    30. Wang, C., et al. Microgravity activates p38 MAPK-C/EBPbeta pathway to regulate the expression of arginase and inflammatory cytokines in macrophages. Inflamm Res. 64, 303-311 (2015).
    31. Iliev, I. D., et al. Human intestinal epithelial cells promote the differentiation of tolerogenic dendritic cells. Gut. 58, 1481-1489 (2009).
    32. Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria. Science. 277, 949-952 (1997).
    33. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. (2010).
    34. Lei, N. Y., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support the growth of intestinal epithelial stem cells. PLoS One. 9, e84651 (2014).
    35. Voog, J., Jones, D. L. Stem cells and the niche: a dynamic duo. Cell Stem Cell. 6, 103-115 (2010).
    36. Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue Eng Part C Methods. 19, 961-969 (2013).
    37. Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9, e107814 (2014).
    38. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, 2354-2368 (2014).
    39. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med. 239, Maywood, N.J. 1124-1134 (2014).
    40. Tompkins, W. A., Watrach, A. M., Schmale, J. D., Schultz, R. M., Harris, J. A. Cultural and antigenic properties of newly established cell strains derived from adenocarcinomas of the human colon and rectum. J Natl Cancer Inst. 52, 1101-1110 (1974).
    41. Hinterleitner, T. A., Saada, J. I., Berschneider, H. M., Powell, D. W., Valentich, J. D. IL-1 stimulates intestinal myofibroblast COX gene expression and augments activation of Cl- secretion in T84 cells. Am J Physiol. 271, 1262-1268 (1996).
    42. Hoshi, H., McKeehan, W. L. Brain- and liver cell-derived factors are required for growth of human endothelial cells in serum-free culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 6413-6417 (1984).
    43. Salerno-Goncalves, R., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Characterization of CD8(+) Effector T Cell Responses in Volunteers Immunized with Salmonella enterica. Serovar Typhi Strain Ty21a Typhoid Vaccine. J Immunol. 169, 2196-2203 (2002).
    44. Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. e51064 (2014).
    45. Eastburn, D. J., Mostov, K. E. Laying the foundation for epithelia: insights into polarized basement membrane deposition. EMBO Rep. 11, 329-330 (2010).
    46. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. a report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Altern Lab Anim. 33, 261-287 (2005).
    47. Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111, 1021-1046 (2014).
    48. Hartung, T., et al. Good Cell Culture Practice. ECVAM Good Cell Culture Practice Task Force Report 1. Altern Lab Anim. 30, 407-414 (2002).
    49. Blanchet, O., et al. Altered binding of regulatory factors to HLA class I enhancer sequence in human tumor cell lines lacking class I antigen expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 3488-3492 (1992).
    50. Palmisano, G. L., et al. HLA-E surface expression is independent of the availability of HLA class I signal sequence-derived peptides in human tumor cell lines. Hum Immunol. 66, 1-12 (2005).
    51. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
    52. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
    53. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
    54. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. (2014).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics