生长在微重力人体肠道黏膜的多细胞三维器官模型的建立

Bioengineering

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Summary

细胞在三维(3-D)的环境中生长代表的2-D的环境中( 例如 ,瓶或菜)在细胞培养的显着改进。这里,我们描述根据通过旋转壁上容器(RWV)生物反应器提供微重力培养人肠粘膜的多细胞三维器官模型的发展。

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Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity. J. Vis. Exp. (113), e54148, doi:10.3791/54148 (2016).

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Abstract

因为在一个三维(3-D)的环境中生长的细胞具有弥合的2-D的环境中的细胞培养的许多间隙( 例如 ,瓶或碗碟)的潜力。事实上,人们普遍认识到,在烧瓶或菜肴生长细胞倾向于去分化并失去其最初来源的组织的专门特征。目前,主要有两种类型的3-D培养系统的模拟天然细胞外基质(ECM),其中将细胞接种到支架:(一)静态模型和使用生物反应器(B)中的模型。第一个突破是静态的三维模型。使用生物反应器,如旋转壁上容器3-D模型(RWV)生物反应器是一个较新的发展。在RWV生物反应器的原始概念是美国宇航局约翰逊航天中心在90年代初开发的,被认为是克服静态模型的局限性,如缺氧,坏死核心的发展。该RWV生物反应器可以规避日是通过提供流体动力学,允许营养物和氧的高效的扩散问题。这些生物反应器组成,其用于支持和旋转培养容器的两个不同的格式,可以通过通气源类型而不同的转子碱:(1)缓慢车削外侧容器(STLVs)与在中心同轴氧合器,或(2通过一台,硅橡胶气体转移膜)高宽比容器(HARVs)与充氧。这些血管允许有效的气体传递,同时避免气泡形成和随之而来的湍流。这些条件导致在层流和最小的剪切力模型降低了培养容器内的重力(失重)。在这里,我们描述由RWV生物反应器提供了一种肠上皮细胞系和原代人淋巴细胞,微重​​力下培养的内皮细胞和成纤维细胞构成的人体肠道黏膜的多细胞三维器官模型的发展。</ P>

Introduction

在构建三维模型首次突破据报道,在80年代初,当科学家们开始研究不同类型的支架( 例如 ,层粘连蛋白,胶原蛋白I型,Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白)和生长因子鸡尾酒改善细胞-细胞和的“静态”3-D模型1-7的ECM相互作用。此后,随着这些模型的主要问题一直是在营养物质的传递和氧的介质和组织构建8内的限制。在对比中,其接收从周围的血管网络的营养素的稳定流量和氧的体内环境的细胞,这些模型的静态性质阻碍他们的向细胞的有效分配。例如,在体外静态模型生成大小超过几毫米细胞聚集体将总是开发缺氧,坏死芯件9。该RWV生物反应器可以解决这个问题通过提供流体动力学,允许营养物和氧10-12的有效扩散。然而,到目前为止,使用RWV生物反应器的工作已被限制为包含一种或两种的细胞类型13-17。此外,代替类似于天然组织的空间取向,这些细胞形成细胞聚集体。这些限制的主要原因是缺乏能够把电池于一体的综合时尚支架。在RWV生物反应器迄今所使用的支架组成,除了少数例外16-18,主要用于合成微珠,管状圆筒或小片13-15,19-23的。这些是刚性的材料,其组成和灵活性不能被操纵,并且其中细胞附着到其表面上。因此,这是不可能的,这些模型将提供在其中评估系统,以综合的方式,( 例如 ,成纤维细胞,免疫细胞和内皮细胞)的各种细胞成分如基质细胞那个SHOULD被支架内分散地模拟人体组织。

在这里,我们描述了一种肠上皮细胞系和原代人淋巴细胞,内皮细胞构成的人体肠道黏膜的多细胞三维器官模型的开发,和成纤维细胞24。这些细胞培养微重力下的生物反应器RWV提供13,25-30。在我们的3-D模型,则ECM具有许多不同的特性,例如类似培养基的重量摩尔渗透压浓度( 例如 ,在培养过程中可以忽略的扩散限制),并掺入细胞和其它相关的细胞外基质蛋白的能力,以及在在生物反应器24中使用适当的刚度。生物系统是非常复杂的,而且在过去的几年里,一直在研究黏膜对与周围环境细胞的相互作用的考试的重点的转变,而不是隔离和研究它们ñ。特别是,细胞-细胞相互作用的影响肠细胞的存活和分化的重要性是有据可查的31-34。具体来说,上皮细胞和自己的优势之间的交流对上皮细胞扩增和分化35深远的影响。事实上,它已被广泛接受,不仅细胞 - 细胞,而且细胞 - 细胞外基质相互作用是上皮细胞中的3-D培养模型的维持和分化至关重要。以前的研究已经表明,肠ECM蛋白如胶原蛋白I 24,36,37,层粘连蛋白38和纤连蛋白39在影响肠上皮细胞获得类似于天然粘膜空间定向工具。因此,新技术的发展,象我们的3-D模型24,可以模仿所需肠道的表型多样性如果研究人员打算重新创建复杂的细胞和结构建筑和肠道微环境的功能。这些模型表示在新的口服药物和疫苗候选的开发和评估的一个重要工具。

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Protocol

伦理声明:从参与协议号HP-00040025-1志愿者收集的所有血液样本。马里兰机构审查委员会的批准大学的这个协议和授权的血液样本的收集从包括在这个手稿研究健康志愿者。这项研究的目的是解释志愿者,以及所有的志愿者给予知情,抽血前签署同意书。

注:请参阅表1为中补充的准备。 见表2为三维培养基的制备。

1.培养容器的制备

  1. 旋50毫升容器的填充口的盖子,并用50毫升无菌培养基( 例如 ,RPMI)填充。执行层流罩无菌条件下的所有程序。
  2. 更换帽和擦拭溅出的培养基用70%乙醇在任何表面上。
  3. 允许在容器到incub吃了至少15分钟,O / N在室温。
  4. 使用填充端口丢弃培养基并加入30×3-D培养基。
  5. 请用70%乙醇的任何表面上溅出的网上平台。

2.细胞的制备

  1. 人类上皮细胞株(HCT-8)24,40。
    1. 在RPMI培养细胞补充有100U / ml青霉素,100微克/ ml链霉素,50μg/ ml的庆大霉素,2mM的L-谷氨酰胺,1mM丙酮酸钠,10毫米的HEPES缓冲液和10%热灭活的小牛血清(FBS )( 补充1)。在70%汇合,分裂细胞以1:5的比例。
  2. 人类结肠成纤维细胞(CCD-18Co细胞 )24,41。
    1. 培养的细胞在与补充1富集的基础的Eagle培养基在汇合,分裂细胞以1:1的比例:3。
  3. 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞
  4. 在内皮基础培养基(EBM)培养细胞培养基富含100微克/毫升肝素,3微克/毫升内皮细胞生长补充剂(ECGS),并补充1在70%汇合,分裂细胞以1:1的比例:2。
  • 淋巴细胞/单核细胞
    1. 通过使用标准技术43密度梯度离心分离从血液的外周血单核细胞(PBMC)。
      1. 简要地说,用10毫升移液管,小心地加入30毫升稀释血(1:1血液:磷酸盐缓冲盐水(PBS)中)到含有10ml密度离心培养基的50ml圆锥形管中。离心步骤后,淋巴细胞和单核细胞将驻留在密度离心介质和等离子体层之间的“白”层。
      2. 收集用移液管白层。通过限制密度离心媒体的集合避免粒污染。洗完后43,U本身作为PBMC或者是在液态氮冷冻保存。
        注意:以突出的PBMC大体上是由淋巴细胞和单核细胞的,树突状细胞和其他细胞类型的一小部分是很重要的。
  • 成长标准培养条件下的所有细胞在37℃下在5%CO 2的气氛中。
  • 3.胶原包埋细胞的制备

    1. 确定插入物的数量根据实验条件的号码需要加以设定。放置插入适当数量的成6孔板的孔中。
    2. 制成悬浮液HUVEC和成纤维细胞的:
      1. 在PBS中洗烧瓶两次,并使用胰蛋白酶,0.25%(1×)用0.05%胰蛋白酶乙二胺四乙酸四(胰蛋白酶-EDTA)分离细胞。添加足够的胰蛋白酶溶液,以覆盖细胞培养表面面积的全部。支队通常在5发生15分钟
      2. 搜集分离的细胞在装有30ml Dulbecco改良的Eagle氏培养基(DMEM)30%FBS培养基的50毫升管。
      3. 离心管中,在500×g离心10分钟。
      4. 悬浮细胞在30ml的DMEM-30%FBS的培养基中。
      5. 通过稀释20微升悬浮细胞与20微升台盼蓝染料的计数存活细胞的总数。负载细胞混合物的血细胞计数器。可行的外周血单个核细胞将白清晰;没有自生能力PBMC将收购染料变成蓝色。
        1. 8×10 7个细胞毫升- -以5的浓度悬浮在DMEM-30%FBS培养基中的细胞类型1。
    3. 制备含细胞胶原凝胶
      注意:每个容器将需要约5毫升含细胞的胶原凝胶的制备。
      1. 在一个50毫升锥形管中加入1×DMEM培养基,补充有50微克/ ml庆大霉素,2mM的L-谷氨酰胺和10%热inactivat制备胶原混合物编FBS加3毫克/毫升的牛Ⅰ型胶原,10μg/ ml的层粘连蛋白,40微克/毫升IV型胶原,10μg/ ml的纤连蛋白,2微克/毫升硫酸肝素蛋白聚糖和15mM的NaOH(达到生理pH)。
      2. 关闭该管并且颠倒几次,直至混合物完全均匀混合。避免泡沫形成。
        重要提示:保持冰混合物,以防止凝胶化。
        1. 关键的步骤:如果混合物开发的酸性外观(淡黄色),添加无菌的1N NaOH几滴以中和该混合物。
      3. 加浓的HUVEC和成纤维细胞以1.0的密度- 1.2和1.5 - 2.0×10 6个细胞/ ml,分别向富含胶原混合物(如上所述)。关闭管和颠倒几次,直至混合物完全均匀混合。避免泡沫形成。重要提示:保持冰混合物,以防止凝胶化。
      4. 添加4 - 所述含细胞胶原5毫升凝胶每个插入,预先装入6孔板,并使其在通风橱中,很少或没有运动,以凝胶化1小时。
      5. 1小时后,在6孔板转移到37℃,5%CO 2培养箱1 - 2小时。
      6. 返回6孔板的罩,并且用无菌镊子的帮助下,并从插入件分离从膜的含细胞​​凝胶手术刀无菌地切断该膜。切胶脱落成小方块(约5×5毫米)。
      7. 添加小含细胞平方到使用填充口的50ml HARV。
    4. 制备悬浮液HCT-8的上皮细胞:
      1. 在PBS中洗烧瓶两次,并使用胰蛋白酶,0.25%(1×)用胰蛋白酶-EDTA处理分离细胞。添加足够的胰蛋白酶溶液,以覆盖细胞培养表面面积的全部。脱离通常为10至15分钟内发生。
      2. 收集分离的细胞在30毫升的DMEM-30%FBS的培养基中。
      3. CentrifUGE DMEM-30%FBS含管在500 XG 10分钟网上平台。
      4. 悬浮细胞在30ml的DMEM-30%FBS的培养基中。
      5. 如3.2.5所述计数存活细胞的总数。
      6. 重悬在DMEM-30%FBS的培养基中的HCT-8的上皮细胞以10 7个细胞ml的浓度- 1。
      7. 加入1毫升浓HCT-8上皮细胞进50毫升HARV使用填充口。
    5. 通过使用填充口,添加额外的3-D培养基直到容器几乎满(约20毫升)中。
    6. 更换盖和擦拭用70%乙醇的填充口的唇缘。
    7. 放置一个注射器中的RWV的每个注射器端口:地方含有3 5ml的注射器 - 在一个端口4×3-D培养基,并在另一端口5ml的空注射器。
    8. 通过拉入空注射器而大致介质的相同体积通过其它注射器口喷射除去任何可见的气泡。
    9. 放置VESSELS在生物反应器中,打开电源,速度设定为每分钟约13至14转。
      注:关键步骤:旋转速率可能需要在实验期间进行调整几次,以保持在容器内旋转,从而避免了与该容器壁接触的细胞。
    10. 培养细胞在37℃,微重力下,5%CO 2,由RWV生物反应器提供。
    11. 改变培养基,每3 - 第4天用新鲜的3-D培养基更换约30毫升
    12. 经过4天(±1天),请从生物反应器的船只,并添加淋巴细胞/单核细胞向血管(2×10 7 /船)。
    13. 放置血管回生物反应器中,在37℃,5%CO 2的额外5天(±1天)。
    14. (培养第9天)的另外5天后,添加淋巴细胞/单核细胞的容器(2×10 7 /容器),并继续额外长达12天的培养物。 改变培养基,每3 - 第4天用新鲜的3-D培养基更换约30毫升

    为组织学4.收获3-D培养

    1. 用移液管收获的援助每个小凝胶片段,现在称为“构建体,”到含有10ml的10%福尔马林缓冲液中的六孔板中。在RT留3小时或12 - 在4℃下16小时。
    2. 用标签和加入活检泡沫垫两块到每个磁带准备组织处理和嵌入录像带。
    3. 沉浸在10%福尔马林缓冲液卡匣。
    4. 用钳子的帮助放置两个泡沫垫之间的固定结构。
    5. 沉浸在10%福尔马林缓冲液卡匣。
    6. 与嵌入,切片,染色和44标准程序进行。

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    Representative Results

    先前我们已经设计了人肠黏膜包括肠上皮细胞系和原代人淋巴细胞,微重力条件下24( 图1)下培养的内皮细胞和成纤维细胞的多细胞三维器官模型。成纤维细胞和内皮细胞包埋在我矩阵附加肠基底膜蛋白45( ,层粘连蛋白,胶原蛋白IV,纤连蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖)富含胶原,并加入到RWV生物反应器。经过10 - 15天,组织染色分析表明绒毛样结构中的构建体的存在。约60 -这些上皮细胞的80%被组织成极化的细胞与位于在ECM,它是分化良好的细胞( 图2)的一大特征附近的基底位置的核的一个单层。

    ENT“FO: - together.within页保留=”1“> 图1
    图1:3-D模型的构建图 。四个步骤是需要建立的3-D系统。首先,为了得到所需数量的细胞来产生3-D模型,人肠肠上皮细胞系(HCT-8)和原代人内皮细胞和成纤维细胞生长为2-D汇合单层。第二,构成的ECM胶原I矩阵具有附加肠基底膜蛋白富集的( ,层粘连蛋白,胶原蛋白IV,纤连蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖)的制备。第三,成纤维细胞和内皮细胞被包埋在胶原I的混合物,并加入到RWV生物反应器,随后加入HCT-8上皮细胞。第四,主淋​​巴细胞在天4和9(±1天)加入到培养。“>请点击此处查看该图的放大版本。

    图2
    图2: 正常人体肠道和器官车型进行比较 。苏木精和在3-D微重力模型培养细胞的曙红染色:组织进行染色紫色和脚手架染色粉红色。从3-D模型细胞培养14(“A”“b”)和20天(C)。播种20天后,总细胞数目都维持,细胞分化良好表现绒毛样的功能。图像在显示100X(“A”和“B”)和40X(“C”)的放大倍率。 请点击此处查看该图的放大版本。

    产品名称 PKG。尺寸 重建 工作浓度 存储
    成纤维细胞生长因子基本(bFGF)的 25毫克制备25微克/ ml储备溶液;加入25微克FGF入1毫升无菌介质(RPMI加1%FCS),漩涡使溶解,加100微升/等分 5毫微克/毫升-20℃,分装-20℃,避免重复冻结/解冻
    干细胞因子(SCF) 10毫克以制备10μg/ ml的储备液;加SCF的10微克到1毫升无菌介质(RPMI加1%FCS),漩涡使溶解,加250微升/等份 5毫微克/毫升-20℃,分装-20℃,避免重复冻结/解冻
    肝细胞生长因子(HGF) 5毫克制备5微克/ ml储备溶液;加5微克HGF入1毫升无菌介质(RPMI加1%FCS),漩涡使溶解,加200微升/等份 2毫微克/毫升-20℃,分装-20℃,避免重复冻结/解冻
    内皮素3 50毫克以制备50μg/ ml的储备液;添加Endotelin 50微克到1毫升无菌介质(RPMI加1%FCS),漩涡使溶解,加100微升/等分 10ng / ml的-20℃,分装-20℃,避免重复冻结/解冻
    层粘连蛋白 1毫克在2慢慢解冻- 8℃,漩涡,并添加100微升/等分 10毫克/毫升-20℃,分装-20℃,避免重复FRE结/解冻
    血管内皮生长因子(VEGF)的 10毫克制备5微克/ ml储备溶液; VEGF增加10微克于2ml无菌水,漩涡使溶解,加100微升/等分 1ng / ml的-20℃,分装-20℃,避免重复冻结/解冻
    白血病抑制因子(LIF) 50毫克以制备20μg/ ml的储备液;增加LIF的50微克到将2.5ml无菌水,漩涡使溶解,加100微升/等分 4纳克/毫升-20℃,分装-20℃,避免重复冻结/解冻
    腺嘌呤 25克为了制备0.18μm的原液;添加121.5毫克OG adedine到50ml的0.05M HCl中(250微升37.1%的HCl入50ml水中)),漩涡以溶解,过滤消毒以及加入1毫升/等分 1.8×10 -3 M 4℃,分装-20℃,避免重复冻结/解冻
    胰岛素 50毫克制备5毫克/毫升贮备液;加入50毫克胰岛素到10ml 0.005 M盐酸(5微升37.1%的HCl在10ml水中)),漩涡以溶解,过滤消毒并加入0.5毫升/等分试样 5毫克/毫升-20℃,分装-20℃,避免重复冻结/解冻
    T3 100毫克以制备2×10 -8 M原液;添加3.4毫克T3的成25个毫升的1M NaOH中,稀释0.1毫升该溶液到9.9毫升的PBS,再稀释0.1毫升该溶液到9.9毫升的PBS,漩涡以溶解,过滤消毒并加入0.5毫升/等分试样 2×10 -11中号-20℃,分装-20 <SUP>℃,避免重复冻结/解冻
    霍乱毒素 5毫克为了准备10 -7 M原液;添加5毫克霍乱毒素到5毫升无菌DDH 2 O(储存在-20℃);稀释50微升的该溶液到5ml DDH 2 O的,漩涡至均质化,过滤消毒并加入0.5毫升/等分试样 10 -10中号粉4 - 8℃,分装-20℃,避免重复冻结/解冻
    纤维连接蛋白 1毫克以制备1mg / ml的储备液;加入1毫克纤维连接蛋白加入到1毫升无菌distiled水。允许30分钟。物料进入溶液。 不要搅动或者旋风 。加入100微升/等分 10毫克/毫升粉4 - 8℃,分装-20℃,避免重复冻结/解冻
    APO-转 100毫克制备5毫克/毫升贮备液(1000倍 );添加100毫克的转进20毫升的PBS漩涡溶解,过滤消毒和加入0.5毫升/等分 5毫克/毫升-20℃,分装-20℃,避免重复冻结/解冻
    肝素 50 KU 制备50毫克/毫升储液(1000倍 );添加50毫克肝素加入到1毫升的水漩涡中溶解,过滤消毒,并添加1毫升/等分 0.1毫克/毫升-20℃,分装-20℃,避免重复冻结/解冻
    硫酸乙酰肝素蛋白多糖 1毫克制备0.1mg / ml的储备液;加入1毫克硫酸乙酰肝素的成10毫升无菌水漩涡以溶解的,并添加为0.2ml /等分试样 2毫克/毫升-20℃,分装-20℃,避免重复冻结/解冻
    IV型胶原蛋白 5毫克为了制备2mg / ml的库存solutin:加入2毫克胶原Ⅴ的成2.5无菌0.25%乙酸的溶液中。允许1 -物料进入溶液2小时漩涡更好的稀释而 。加入400微升/等份 80毫克/毫升-20℃,分装-20℃,避免重复冻结/解冻

    表1: 定义中补充准备。

    与F-12培养基中添加
    试剂 原液 最终解决方案
    胎牛血清 10% 50毫升
    丙酮酸钠 100毫米 1毫米 5毫升
    L-谷氨酰胺 200毫米 2毫米 5毫升
    HEPES 1M的 10毫 5毫升
    庆大霉素 50毫克/毫升 50微克/毫升 500微升
    青霉素/链霉素万U /毫升/ 10毫克/毫升 100 U /毫升/ 100微克/毫升 5毫升
    胰岛素 5毫克/毫升 5微克/毫升 500微升
    T3 为2×10 - 8M的 2×10 -11中号 500微升
    腺嘌呤 1.8×10 - 1M的 1.8×10 - 3 5毫升
    5微克/毫升 500微升
    肝素 50毫克/毫升 0.1毫克/毫升 1毫升
    ECGS 3毫克/毫升 3微克/毫升 5毫升
    bFGF的 25微克/毫升 5毫微克/毫升 100微升
    SCF 10微克/毫升 5毫微克/毫升 250微升
    HGF 5微克/毫升 2毫微克/毫升 200微升
    内皮素3 50微克/毫升 10ng / ml的 200微升
    LIF 20微克/毫升 4纳克/毫升 100微升
    VEGF 5微克/毫升 1ng / ml的 100微升
    Choleran毒素 10 -7 M 10 -10中号 500微升</ TD>
    注意:以上引用的量为制剂为500ml的3-D培养介质。介质必须存放在4℃下没有超过2周

    表2:3-D培养基的制备。

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    Discussion

    在这个手稿,我们描述了人肠黏膜由倍数细胞类型,包括原代人淋巴细胞,成纤维细胞和内皮细胞,以及肠上皮细胞系24的生物工程化的模型的开发。在这个3-D模型,细胞在富含胶原蛋白的细胞外基质中的微重力条件下24培养。

    如先前所描述,该模型的主要特征是:(i)以模仿上皮组织单层组织的能力,(ⅱ)上皮细胞,紧密连接,桥粒和微绒毛的适当极性的诱导,(ⅲ)一个长长期培养(最多20天)用初级细胞的高存活率( ,成纤维细胞和内皮细胞),(四)中的表达的组织样分化标志物包括绒毛蛋白,细胞角蛋白,E-钙粘蛋白和亩霉素,(五)的能力,以产生相当大量的细胞因子( 例如 ,IL-8)和在抗原刺激碱性磷酸酶,(ⅵ)营养物如葡萄糖( ,二糖酶的表达的运输,和糖的存在转运),和(vii)肠上皮细胞( ,吸收性肠,杯状和M细胞)24的多谱系分化。

    需要强调的是用我们的3-D模型,研究者必须坚持良好的细胞培养的指导方针46-48实现可重复的结果是很重要的。它是系统控制的可行性,支原体污染和细胞生长行为的改变细胞的关键。如果标识问题,首先确保没有任何未经授权的更改已经引入的协议。如果问题仍然存在,切换到新的一批各种媒体组件(包括血清)和/或细胞。我们的3-D模型的局限性是采用致瘤HCT-8上皮细胞系。但是,考虑到HC​​T-8线的存在提供的是可商购的优点是重要的。此外,这些上皮细胞不表达任何经典或非经典的人类白细胞抗原(HLA)级I分子49,50。因此,他们让上皮细胞具有不同的HLA-I类在无上皮细胞,外周血单个核细胞同种异体反应性的单倍型PBMC的文化。此外,该系统与系统的比较,如肠道干细胞组织体时,51-53,这种模式提供了许多好处。虽然肠道干细胞组织体提供有关细胞生物学和肠分化51-53宝贵的信息,这种模式允许直接顶接触到的营养物质,药物和病原体。这种模式还提供了轻松访问肠腔内容物这种抗微生物肽和细胞因子。与此相反,组织体是紧凑未其朝内一个腔表面。因此,存在可被引入到类器官内腔54产物的限制量。

    我们认为,人体肠道黏膜的我们的多细胞三维器官模型具有广泛的电位在两个健康和疾病进行发现的工具,包括与病原体相互作用,抗原贩卖和炎性和代谢过程24。最后,由于我们的3-D模型的多细胞性质,我们的模型可以用有可能在体内影响上皮细胞的行为免疫细胞类型启用GAIN-和损失的研究。

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor  Synthecon RCCs-4DQ For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.
    Disposable 50 ml-vessel Synthecon D-405 Box with 4 vessels
    HCT-8 epithelial cells  ATCC CCL-244
    CCD-18Co Fibroblasts  ATCC CRL-1459
    Human Umbilical Vein Endothelial Cells ATCC CRL-1730 HUVEC
    Fibroblast Growth Factor-Basic  Sigma F0291 bFGF
    Stem Cell Factor  Sigma S7901 SCF
    Hepatocyte Growth Factor  Sigma H1404 HGF
    Endothelin 3 Sigma E9137
    Laminin Sigma L2020 Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor
    Vascular Endothelial Growth Factor  Sigma V7259 VEGF
    Leukemia Inhibitory Factor  Santa Cruz sc-4377 (LIF
    Adenine Sigma A2786
    Insulin Sigma I-6634
    3,3',5-triiodo-L-thyronine  Sigma T-6397 T3
    Cholera Toxin Sigma C-8052
    Fibronectin BD 354008 Isolated from human plasma
    apo-Transferrin Sigma T-1147
    Heparin Sigma H3149
    Heparan sulfate  proteoglycan Sigma H4777 Isolated from basement membrane of mouse  Engelbreth-Holm-Swarm tumor
    Collagen IV Sigma C5533 Isolated from human placenta
    Heat-inactivated fetal bovine serum  Invitrogen 10437-028
    D-MEM, powder Invitrogen 12800-017
    10% formalin–PBS  Fisher Scientific SF100-4
    Bovine type I collagen  Invitrogen A1064401
    Trypsin-EDTA  Fisher Scientific MT25-052-CI
    Sodium pyruvate Invitrogen 11360-070
    Gentamicin  Invitrogen 15750-060
    Penicillin/streptomincin  Invitrogen 15140-122
    L-Glutamine Invitrogen 25030-081
    Hepes Invitrogen 15630-080
    Ham's F-12 Invitrogen 11765-054
    Basal Medium Eagle Invitrogen 21010-046 BME
    RPMI-1640 Invitrogen 11875-093
    Endothelial Basal Medium Lonza CC-3156 EBM-2
    Endothelial cell growth supplement Millipore 02-102 ECGS

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