تخليق البروتين Bioconjugates
1School of Chemistry, The Australian Centre for Nanomedicine and the ARC Centre of Excellence in Convergent Bio-Nano Science and Technology, The University of New South Wales

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

تفاصيل هذا البروتوكول الخطوات الهامة اللازمة لbioconjugation من السيستين التي تحتوي على البروتين لmaleimide، بما في ذلك تنقية الكاشف، ظروف التفاعل، وتنقية bioconjugate وتوصيف bioconjugate.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Mason, A. F., Thordarson, P. Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry. J. Vis. Exp. (113), e54157, doi:10.3791/54157 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Bioconjugation ينطوي على ربط تساهمي جزيء حيوي واحد مع آخر أو مع جزيء اصطناعي مثل صبغة، المخدرات أو البوليمر. وتستخدم أساليب bioconjugation البروتين الآن على نطاق واسع في العديد من المجموعات البحثية والكيمياء، والبيولوجيا، وتكنولوجيا النانو مع تطبيقات تتراوح بين الفلورسنت صبغ العلامات 1،2، مما يجعل من البروتين (الضد) -prodrugs 3 (تقارن الأجسام المضادة المخدرات - ADCS) توليف البروتين dimers 4،5 ، وصولا إلى السيارات الهجينة البروتين البوليمر الذاتي تجميع 6،7 المستخدمة في النانوي 8 و أنظمة الكيمياء 9.

خصوصية الكيمياء المستخدمة لbioconjugation، في حين لا تنتقد دائما، هو من أهمية قصوى بالنسبة bioconjugates البروتين الأكثر وظيفية، حتى لا تتداخل مع موقع نشط من البروتين الهدف. يحتاج رد فعل bioconjugation المثالي لتحقيق عدة معايير، بما في ذلك: أ) استهداف مواقع نادرة أو فريدة من نوعها على البروتين من الفائدة،ب) أن يكون انتقائيا نحو تحقيق هذا الهدف، ج) المضي قدما في ظل ظروف غير تغيير طبيعة لتجنب البروتين تتكشف والرابع) تكون ذات العائد المرتفع مثل البروتين المستهدف عادة ما يتوافر فقط في تركيز شبه millimolar. وmaleimide - السيستين مايكل بالإضافة يقترب من تحقيق كل هذه المعايير، ولديها لهذا السبب ادعى طويلة وضعا خاصا في مجال bioconjugate الكيمياء 10. هذا هو لأنني) العديد من البروتينات التي تحتوي على السيستين واحد فقط بقايا على سطحها يمكن راثيا هناك، ثانيا) في الرقم الهيدروجيني الصحيحة رد فعل انتقائي للغاية نحو السيستين، ج) وهي تنطلق بسلاسة في المخازن المائية والرابع) فهي سريعة جدا مع معدل ثابت الدرجة الثانية من maleimides للبروتينات التي تحتوي على السيستين ذكرت أن تتجاوز 5000 م -1 ثانية -1 في بعض الحالات 11. قدمت البروتين من الفائدة يمكن أن يتسامح مع كمية صغيرة (≈ 5-10٪) من عضوية المشارك المذيبات 12، أي ما يقرب صبغ functionalized maleimide، صlymer، السطح أو بروتين آخر يمكن ربط البروتينات. وبالإضافة إلى ذلك، maleimides هم أكثر تحديدا لcysteines على البروتينات من iodoacetamides، والتي هي أكثر عرضة للتفاعل مع محب للنواة أخرى في درجة الحموضة المرتفعة. وأكثر استقرارا من الإقتران القائم على ثاني كبريتيد التي تحتاج إلى أن تبقى في درجة الحموضة الحمضية لمنع الصرف ثاني كبريتيد 13.

نحن هنا نورد بروتوكول عام لتصريف جزيئات functionalized maleimide إلى البروتين تحتوي على بقايا السيستين واحدة باستخدام تفاعل بين رو (II) حامل اللون المستندة إلى والبروتين الأكسدة السيتوكروم ج كمثال على ذلك. هذا البروتوكول هو ينطبق أيضا على معظم البروتينات الأخرى التي تحتوي على الوصول بقايا السيستين السطحية والمستهدفة functionalized maleimide المقابلة، سواء كان بروتين آخر، صبغة الفلورسنت، وحامل اللون أو البوليمر الاصطناعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم تصميم البروتوكول التالي لتركيب وbioconjugate البروتين صبغ كما هو مبين في الشكل رقم 1 وهو بروتوكول عام للتفاعل من maleimide مع السيستين سطح مجانية تحتوي على البروتينات، مع ملاحظات إدراج حيثما ينطبق ذلك للمساعدة في بروتين الغشاء. bioconjugates، bioconjugates البروتين البوليمر، وديمر البروتين المركب (البروتين البروتين) bioconjugates. في هذه الحالة بالذات، البروتين ISO-1 السيتوكروم لديها واحد سطح السيستين بقايا المتاحة للرد الذي يسمح لوضع العلامات محددة للغاية للتحدث. إذا كان البروتين من الفائدة لديها بقايا السيستين متعددة، وينطبق نفس البروتوكول، وإن كان ذلك مع فقدان للخصوصية وتجانس المنتج. الكيمياء تستهدف بقايا يسين السطح، وذلك باستخدام N -hydroxysuccinimidyl استرات أو ايزوثيوسيانيتس، قد يكون نهجا أكثر بساطة إذا لم يتم تتطلب التحديد.

شكل 1
مخطط رد الفعل 1. Bioconjugation. وحالة سبيل المثال، حصاد الضوء، وسوف تعلق على أساس الروتينيوم جزيء هوائي لالسيتوكروم عبر مايكل إضافة maleimide قلادة على جزيء هوائي القائم على الروثينيوم وبقايا السيستين يتعرض (CYS102) على البروتين. المنطقة الحمراء لسطح CYT ج يشير إلى مجموعة الهيم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. تنقية السيتوكروم ج

ملاحظة: هذه الخطوة لا تنطبق على جميع البروتينات. ومع ذلك، فمن المهم أن نعرف أن البروتين الحصول عليها من المورد التجاري يمكن أن تحتوي على أخرى، الإسوية بروتين غير مرغوب فيها والتي قد تحتاج إلى إزالتها عن طريق مزيد من تنقية 13.

  1. حل 2.4 غرام من فوسفات هيدروجين الصوديوم (M ث = 120 غرام مول -1) في 1 لتر من الماء عالى النقاء إلى العلاقات العامةepare حل العازلة التي تحتوي على 20 ملي ناه 2 ص 4. ضبط درجة الحموضة مع 1 م هيدروكسيد الصوديوم لدرجة الحموضة 7.
    ملاحظة: مخازن الفوسفات المستخدمة في هذا البروتوكول يجب الطازجة بشكل يومي، وتصفيتها من خلال 0.2 ميكرون السليلوز غشاء فلتر قبل استخدامها.
  2. حل 29.22 غرام من كلوريد الصوديوم (M ث = 58.44 غرام مول -1) في 500 مل من ناه 2 عازلة 20 ملي ص 4 لجعل 20 ملي ناه 2 ص 4 و 1 عازلة M كلوريد الصوديوم. هذا هو شطف العازلة للتنقية في الخطوة 1.6).
  3. حل 12.0 ملغ من مجفف بالتجميد السيتوكروم ج (CYT ج) في 6 مل من درجة الحموضة 7 20 ملي العازلة الفوسفات.
  4. بشكل منفصل بحل 14.7 ملغ من dithiothreitol (DTT، M ث = 154.25 جم / مول) في 95.3 ميكرولتر من الماء عالى النقاء لإعداد محلول المخزون 1 م.
    ملاحظة: الحل الأسهم DTT يجب الطازجة، وهذا كاشف هو عرضة للتعطيل التأكسدي في محلول مائي.
  5. بذرةETTE 60 ميكرولتر من محلول 1 M DTT في حل البروتين للحد من CYT ج. وهذا اللون من الحل تتغير من الأحمر الداكن إلى اللون الأحمر الفاتح على الاختلاط.
  6. تصفية خفض حل البروتين من خلال 0.22 ميكرون منخفض البروتين PVDF ملزمة فلتر حقنة قبل الحقن على أي وسيلة إعلامية الكروماتوغرافي.
  7. إرفاق عمود تبادل الأيونات الموجبة 3.3 مل قوية بين حلقة الحقن وكاشف للأشعة فوق البنفسجية فيس لاللوني السائل (FPLC) أداة البروتين سريع.
  8. تتوازن العمود مع 3 مجلدات عمود من الماء عالى النقاء، تليها 3 مجلدات عمود 20 ملي درجة الحموضة 7 عازلة الفوسفات، وذلك باستخدام معدل التدفق من 1 مل / دقيقة.
  9. تحميل 1 مل من انخفاض CYT الخام ج في حلقة الحقن، وبدء أسلوب التدرج 328-450 مم كلوريد الصوديوم، وأكثر من 5 مجلدات العمود. رصد 280 نانومتر و 410 نانومتر قنوات كاشف الأشعة فوق البنفسجية فيس، وجمع أكبر الذروة.
  10. زيادة تركيز الملح إلى 1 M ل2 مجلدات العمود إلى أزل ISO-2 سيتوكرومه ج، وبعد أن تم مسح العمود، وإعادة تتوازن العمود مع 2 مجلدات عمود 20 ملي العازلة الفوسفات قبل حقن قسامة الخام القادمة.
  11. كرر الخطوات من 1،9-1،10 حتى يتم تنقية جميع البروتين الخام.
  12. تجميع ISO-1 تحتوي على كسور والتركيز عليها باستخدام 3.5 كيلو دالتون الوزن الجزيئي القطع (MWCO) مرشح تدور والطرد المركزي في 3000 ز س.
  13. تحميل البروتين تتركز في 3.5 أشرطة غسيل الكلى كيلو دالتون MWCO وdialyze ضد عالى النقاء الماء طوال الليل، مع 2 التغييرات من الماء.
  14. تحديد تركيز المحلول البروتين النقي، مركزة عن طريق أخذ 10 ميكرولتر، تمييع إلى 100 ميكرولتر مع الماء عالى النقاء، وأخذ الطيف الامتصاصية. استخدام حجم منخفض، و 100 ميكرولتر كوفيت الكوارتز للحصول على البروتين الامتصاصية الأطياف. عادة، وتركيز البروتين مخفف هو بناء على أمر من 50-100 ميكرون.
    1. استخدام مميزة ذروة 410 نيوتن متر من CYT ج لتحديد concentratioن استخدام قانون بير لامبرت مع قيمة الامتصاصية المولية من 97.6 سم -1 ملي -1:
      A = ε × ج × ι
      حيث A هو الامتصاصية، ε هو الامتصاصية المولية، ج هي تركيز في ملي، وι هو طول مسار كفيت في سم 13.
  15. عند هذه النقطة، تقسيم البروتين في 1 مل قسامات والحفاظ المجمدة في -20 درجة مئوية حتى تكون هناك حاجة إليها. CYT ج يمكن تجميد وإذابة دون فقدان للهيكل أو وظيفة، ولكن سوف تبدأ دورات تكرار لتفسد البروتين.
    ملاحظة: والبروتينات تتسامح تجميد بدرجات مختلفة. على سبيل المثال، البروتينات الفلورية الخضراء 5،9 لا ينبغي تجميدها، بدلا من تخزينها في الثلاجة.

2. تجميع السيتوكروم ج Bioconjugates

  1. حل 0.9 ملغ من الروثينيوم (II) bisterpyridine maleimبيئة تطوير متكاملة (رو (II) (طن سنويا) 2 -maleimide، 0.975 مكرومول، 6 يعادله) في 600 ميكرولتر من الأسيتونتريل.
    ملاحظة: إذا كان maleimide المستخدمة قابلة للذوبان في الماء، وإعداد محلول المخزون في الماء بدلا من الأسيتونتريل. ومن المهم للmaleimide لتكون قابلة للذوبان في المخزن المؤقت رد فعل. ثنائي ميثيل سلفوكسيد، وتستخدم N، N -dimethylformamide، والأسيتونتريل كل عادة المواد المساعدة للمساعدة في حل منخفضة الوزن الجزيئي 12، في كثير من الأحيان الكواشف maleimide مسعور.
  2. يعد حل العازلة التي تحتوي على 100 ​​ملي العازلة الفوسفات، و 100 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA، M ث = 292.24 جم / مول)، والتي عندما المخفف إلى 20 ملي هو في درجة الحموضة 7. اضافة هيدروكسيد الصوديوم الصلبة حتى يذوب EDTA (عدة جرامات عادة ) وضبط درجة الحموضة إلى 7.
  3. حل 2.87 ملغ من تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين هيدروكلوريد (TCEP 15، م ث = 286.65 جم / مول) في 1 مل من الماء عالى النقاء لإعداد ملي حل الأوراق المالية 10. هذه الخطوة هي استيرادنملة لضمان أن السيستين على البروتين يخفض بشكل كامل قبل maleimide اقتران 15.
    ملاحظة: ينبغي إعداد محلول المخزون TCEP حديثا لكل رد فعل، وهذا كاشف هو عرضة للتعطيل التأكسدي في محلول مائي.
  4. الجمع بين 11.4 مل من الماء عالى النقاء مع 3 مل من 100 ملي حل الأسهم الفوسفات / EDTA في 50 مل أنبوب بلاستيكي. عندما تضعف أكثر مع حلول البروتين والأسهم maleimide تركيز عازلة ستكون 20 ملم.
    ملاحظة: إذا كان البروتين وصمها هو بروتين الغشاء، وضمان أن تتم إضافة المنظفات مناسبة إلى المخزن المؤقت لإذابة البروتين. إذا لم يتم استخدام المنظفات البروتين الغشاء قد يعجل ببطء، مما سيؤثر سلبا على عائدات رد فعل. استخدام المنظفات في كل خطوات تنقية اللاحقة.
  5. إضافة 0.15 مكرومول (3 مل من حل 50 ميكرومتر، 1 ما يعادلها) من تنقية CYT ج إلى المخزن المؤقت الفوسفات EDTA.
  6. إضافة 7.5 ميكرولتر من solut الأسهم TCEPأيون (0.075 مكرومول، و 0.5 في حكمه) إلى حل البروتين وترك التحريك لمدة 5 دقائق للحد من أي البروتين الذي قد dimerized بسبب الأكسدة السيستين.
    ملاحظة: لا تقم بإضافة TCEP إذا كان البروتين من الفائدة لا dimerize بسهولة. التحقق من ذلك عن طريق تشغيل هلام بروتين في ظل ظروف غير الحد.
  7. إضافة 600 ميكرولتر من محلول الأسيتونتريل رو (II) (طن سنويا) 2 -maleimide إلى انخفاض الحل، مخزنة من CYT ج، وترك التحريك خليط التفاعل، في الظلام، في RT، لمدة 24 ساعة.
  8. تركيز خليط التفاعل باستخدام 3.5 كيلو دالتون MWCO مرشحات تدور، الطرد المركزي في 3000 x ج، تكرار 2-3 مرات مع الطازجة 20 ملي العازلة الفوسفات حتى ينتهي الترشيح واضح. إزالة أكبر قدر من maleimide غير المتفاعل من خليط التفاعل ممكن قبل المرحلة التالية من التنقية.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، وخليط bioconjugation الخام يمكن تخزينها في الثلاجة، في الظلام. ومن المهم لإزالة الصبغة maleimide غير المتفاعل من قبل الطرد المركزيifuge غسيل الكلى قبل التخزين كما maleimide يمكن ببطء وnonspecifically تتفاعل مع بقايا يسين على سطح البروتين.

3. تنقية Bioconjugates ج السيتوكروم

  1. حل 2.4 غرام من الصوديوم هيدروجين فوسفات و29.22 غرام من كلوريد الصوديوم في 1 لتر من الماء عالى النقاء لإعداد محلول العازلة التي تحتوي على 20 ملي ناه 2 ص 4 و 0.5 M كلوريد الصوديوم. هذا هو المخزن المؤقت الترشح لتنقية يجمد المعادن تقارب اللوني (ايماك).
  2. حل 17 غرام من ايميدازول (M ث = 68.077 ز مول -1) في 500 مل من 20 ملي ناه 2 ص 4 و 0.5 عازلة M كلوريد الصوديوم. هذا هو شطف العازلة لتنقية ايماك.
  3. ضبط درجة الحموضة من كلا مخازن لدرجة الحموضة 7 باستخدام 1 M هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك، وتصفيتها من خلال 0.22 ميكرون أغشية السليلوز مجدد قبل استخدامها في FPLC.
  4. كما يتم شحنها الأعمدة ايماك شراؤها دون أي ايونات المعادن تحميلها على عمودUMN، وإعداد عمود لني 2+ تنقية المستندة عن طريق غسل العمود مع 3 مل من الماء عالى النقاء، 3 مل من 100 ملي حل النيكل خلات، و 6 مل من الماء عالى النقاء. إذا كان ليس لاستخدامها العمود على الفور غسل خلال 3 مل من 20٪ من الإيثانول وتخزين العمود في الثلاجة لمنع نمو البكتيريا.
  5. إرفاق ني 2+ -loaded 1 مل العمود ايماك للFPLC بين حلقة الحقن وكاشف للأشعة فوق البنفسجية فيس.
  6. تتوازن العمود مع 3 مجلدات عمود 20 ملي فوسفات، 0.5 عازلة M كلوريد الصوديوم باستخدام معدل تدفق 0.5 مل / دقيقة.
  7. تحميل 100 ميكرولتر من خليط التفاعل الخام (التي تمت تصفيتها من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون) على عمود ني 2+ ايماك. غسل العمود مع 3 مجلدات عمود العازلة على التوالي إلى أزل غير رد فعل CYT ج، تليها التدرج ايميدازول 0-125 ملم أكثر من 3 مجلدات العمود إلى أزل الروتينيوم-bisterpyridine السيتوكروم ج bioconjugate (رو (II) -cyt ج) .
  8. غسل جolumn مع 250 ملي العازلة ايميدازول لمدة 5 مجلدات العمود، ثم إعادة توازن العمود مع 20 ملي الفوسفات، و 0.5 M كلوريد الصوديوم وكرر الخطوة 3.7 حتى يتم تنقية جميع bioconjugate الخام.
  9. تجميع الكسور bioconjugate والتركيز عليها باستخدام 3.5 كيلو دالتون MWCO مرشح تدور، الطرد المركزي في 3000 ز س.
  10. تحميل bioconjugate تتركز في 3.5 أشرطة غسيل الكلى كيلو دالتون MWCO وdialyze ضد عالى النقاء الماء طوال الليل، مع 2 التغييرات من الماء.
  11. تحديد تركيز نقية، حل bioconjugate تتركز الأشعة فوق البنفسجية فيس، وذلك باستخدام نفس القيمة الامتصاصية المولية كما ISO-1 السيتوكروم ج (97.6 مم -1 سم -1) في 410 نانومتر. عادة، وتركيز bioconjugate هو بناء على أمر من 50-100 ميكرون.
  12. تقسيم bioconjugate إلى 25 مكل والحفاظ المجمدة في -20 درجة مئوية حتى تكون هناك حاجة إليها.

4. توصيف Bioconjugates ج السيتوكروم

  1. ردعmination من كتلة bioconjugate بواسطة MALDI-TOF MS
    1. حل 10 ملغ من caffeic حامض في 1 مل من محلول الأسيتونتريل / المياه / حمض trifluoroacetic (80: 20: 0.1، ت / ت / ت).
    2. تمييع 5 ميكرولتر من محلول البروتين المركز مع 5 ميكرولتر من حل caffeic حامض.
    3. بقعة 0.5 ميكرولتر من محلول caffeic حامض على لوحة الهدف MALDI والسماح للحل لتجف.
    4. بقعة 0.5 ميكرولتر من محلول العينة / مصفوفة على رأس هذه البقعة caffeic حامض، والسماح للبقعة لتجف. بقعة 0.5 ميكرولتر أخرى من عينة مصفوفة على رأس هذا إلى "ساندويتش" العينة بين طبقات من المصفوفة، والسماح ليجف.
    5. الحصول على أطياف الشامل في الوضع الخطي باستخدام إعدادات أداة مناسبة لالبروتينات 16.
  2. التحقيق في bioconjugates بواسطة الكهربائي للهلام
    1. استعد 10 ميكرولتر من كل عينة البروتين ليتم تشغيلها عن طريق تمييع عينات البروتين مع كبريتات الليثيوم خلط دوديسيل (LDS، ودرجة الحموضة 8.4) عازلة (4X) رالزراعة العضوية تركيز النهائي من ما يقرب من 20 ميكروغرام لكل بئر. للآبار التي تتطلب الحد من الظروف، إضافة 1 ميكرولتر من 500 ملي dithiothreitol (DTT) الحد من وكيل (10X).
    2. عينات الحرارة عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    3. إضافة 50 مل من الممزوجة مسبقا 1 M زارة التربية والعلم، 1 M تريس قاعدة، 2٪ SDS، 20 ملي EDTA (درجة الحموضة 7.7) يعمل خليط عازلة (20x و) من مصدر تجاري إلى 950 مل من الماء عالى النقاء لإعداد عازلة هلام قيد التشغيل.
    4. إزالة المشط البلاستيك من هلام ووضع الجل في خزان هلام التوالي. تعبئة خزان العازلة مع هلام تشغيل بحيث تتم تغطية الآبار مع العازلة.
    5. نماذج تحميل بعناية في الصعود إلى الجاهزة 12٪ مكرر تريس، 1 مم، 10-جيدا هلام باستخدام نصائح ماصة طويلة للمساعدة في التحميل. تحميل prestained 10 البروتين الوزن الجزيئي علامة (3-188 كيلو دالتون) في بئر الأوسط من هلام لمساعدة التحليل.
    6. تشغيل هلام في 200 V الجهد المستمر لمدة 35 دقيقة.
    7. وصمة عار الجل مع Coomassie حل الزرقاء التجاري لمدة 2 ساعة، ويغسل مع ultrapالمياه لدى عودتهم لمدة 48 ساعة.
  3. تقرير من النقاء bioconjugate بواسطة التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس
    1. إعداد 120 ميكرولتر من 5 ميكرومتر حلول رو (II) (طن سنويا) 2 -maleimide، ISO-1 CYT ج، ورو (II) ج -cyt.
    2. قياس الطيف الأساس كفيت الكوارتز تحتوي على الماء عالى النقاء الوحيد، من 250 نانومتر إلى 650 نانومتر.
    3. قياس الطيف لكل مكون، وضمان تشطف كفيت وتجفيفها بين كل قياس.
    4. رسم الامتصاصية من كل عنصر بوصفها وظيفة من الطول الموجي، ومقارنة المبلغ خطية من المواد الأولية مع المنتج النهائي لتحديد ما إذا كان نسبة 1: 1 رو (II) (طن سنويا) 2 -maleimide إلى CYT ج وكان رد فعل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويؤكد تركيب bioconjugates بواسطة ثلاث طرق رئيسية: مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين وقت الرحلة الطيف الكتلي (MALDI-TOF MS)، بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام، والأشعة فوق البنفسجية-مرئي (أشعة فوق البنفسجية فيس) التحليل الطيفي، كما هو مبين في الشكلين 2، 3 و 4. زيادة الجماعية المقابلة لكتلة جزيء صغير إلحاق، وعدم وجود البروتين المتفاعل توضح نجاح الربط التساهمي رو (II) (طن سنويا) 2 -maleimide إلى CYT ج وتنقية لاحقة من bioconjugate. الطيف للأشعة فوق البنفسجية فيس من bioconjugate يسمح العائد على أن تحسب مع الامتصاصية في 410 نانومتر، وذلك بمقارنة الطيف إلى توقع 1: الطيف 1 إضافة المواد الأولية ويمكن الاستدلال على تكوين bioconjugate. في المثال أعلاه، فإن العائد يختلف نوعا ما عن الدفعي إلى دفعة لكنها عادة ما بين 15-27٪ بعد FPLC purificaنشوئها 15.

وبالإضافة إلى ذلك، وظهور ذروة جديدة في اللوني خلال تنقية يؤكد تخليق نوع جديد. ويتمثل هذا في الشكل (5)، حيث تحليل آثار أشعة فوق البنفسجية فيس مختلفة يمكن أن تشير إلى ما إذا كانت الأنواع يحتوي على رو (II) عنصر -maleimide (طن سنويا) 2.

الشكل 2
الشكل 2. MALDI-TOF قداس أطياف البروتينات. أطياف الشامل من محض ISO-1 السيتوكروم ج (أسود) ورو (II) -cyt ج (الحمراء). قمم يمكن ملاحظة أن تتوافق مع الجماهير المحسوبة ISO-1 CYT ج (12706 دا) ورو (II) -cyt ج (13559 دا) مع ناتج إضافة caffeic حامض مرئية على +179 دا. ويعتبر هذا ناتج إضافة بكميات أعلى في CYT غير المتفاعل ج قpectra بسبب رد فعل بين α، β-الكربونيل غير المشبعة من caffeic حامض وثيول خالية من البروتين في ظل ظروف MALDI الطاقة العالية. عادة ما ينظر إليها adducts مصفوفة في MALDI-MS ويمكن أن تكون التساهمية وغير التساهمية في الطبيعة. أطياف هي خط الأساس تصحيح، والضوضاء التي تمت تصفيتها، وتطبيع للمقارنة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. SDS-PAGE من البروتينات 12٪ مكرر تريس هلام انخفاض وغير مخفضة CYT ج ورو (II) ج -cyt. حارة 3 يحتوي على مستوى البروتين قبل الملون، مع كتلة ببتيد المشروح إلى حق كل فرقة (كيلو دالتون). الرجاء انقر هنا لعرض أكبر أصداراتن من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. الأشعة فوق البنفسجية في ضوء الأطياف من البروتينات: طيف الامتصاص رو (II) -cyt ج (الأخضر) يتوافق ارتباطا وثيقا بالإضافة الخطية (متقطع الأزرق) من الذهب الخالص، غير المتفاعل CYT ج (الحمراء)، والمتفاعل رو (II) ( طن سنويا) 2 -maleimide (أسود). هذا يدل على أن bioconjugate يتكون من: 1 المرفق 1 من maleimide للبروتين الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. المخطط الاستشرابي تنقية ني ايماك من bioconjugates: ايماك أثر رو (II) -cyt ج تنقية. أشعة فوق البنفسجية فيس يتتبع: 410 نانومتر يتوافق مع الفرقة سوريه من قبرصير ج و 280 نانومتر يتوافق مع كلا CYT ج ورو (II) (طن سنويا) 2 -maleimide، و 475 نانومتر يتوافق مع تهمة نقل الفرقة المعادن ليجند من (II) المجمع الروتينيوم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تنقية المواد الأولية قبل bioconjugation أمر في غاية الأهمية. البروتينات التي تم الحصول عليها من مصادر المؤتلف التجارية غالبا ما تحتوي على الإسوية أخرى من البروتين من الفائدة، والتي يمكن أن يكون مختلفا الكيمياء السطحية والقابلية للتفاعل. على سبيل المثال، في bioconjugation وصفها، والمتاحة تجاريا CYT ج تحتوي على خليط من كل من ISO-1 و ISO-2 CYT ج 12،14،17. ISO-2 و أشكال السيتوكروم ج 1 ايزو هم إلى حد كبير مثلي، مع الفرق الرئيسي هو وجود بقايا السيستين خالية بالقرب من محطة سي من ISO-1 السيتوكروم ج. في المثال هنا، ويتحقق تنقية مع مائي قوي الموجبة لتبادل FPLC، ومع ذلك، قد يكون أكثر قابلية للتطبيق أشكال أخرى من FPLC مثل تبادل شاردي وتقارب، مسعور أو اللوني الحجم الاستبعاد. يتم تقليل البروتين أيضا في هذه الخطوة للتأكد من أن بقايا السيستين على البروتين من الفائدة (هنا السيتوكروم ج) هي فوانخفاض LLY قبل bioconjugation مع الهدف المرتبط maleimide. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه من المفيد للتأكد مما إذا جزيء صغير إلحاق maleimide ليتم استخدامها مع السيستين التي تحتوي على البروتين هو محض وأن maleimide لم تجر رد فعل في التخزين، كما maleimides والضوء ودرجة الحرارة حساسة. وهذا يمكن أن يتم التحقق بسرعة وسهولة عن طريق 1 H NMR، كما البروتونات الفينيل من maleimide سليمة سوف تبدو وكأنها القميص في 6-6،5 جزء في المليون، في حين أن البروتونات من maleimide مفتوحة سيتحول أول الملعب. وأيضا قياس الطيف الكتلي، مع حلقة maleimide مفتوحة الموافق زيادة كتلة دا 18.

سوف عازلة الاختيار، ودرجة الحموضة، وإدراج المواد المساعدة مثل المنظفات والمذيبات العضوية، والاختزال يكون لها تأثير عميق على عوائد bioconjugation 5،15. في حالة إضافة مايكل لmaleimide وثيول، يجب أن تكون درجة الحموضة فوق 6 بعد أقل من 8 لسرعة رد الفعل ومحددة تحدث. تحت الرقم الهيدروجيني 6، خصوصية عالية كماسوف maleimide لن تكون قادرة على التفاعل مع أي الأمينات، ولكن ثيول هو البروتونية وبالتالي هو النيوكليوفيل الفقراء لمايكل إضافة يؤدي إلى رد فعل بطيء. أعلى درجة الحموضة 8، ويمكن سطح بقايا يسين أصبحت deprotonated وتتفاعل مع maleimides المتاحة، مما يؤدي إلى التعلق التساهمية غير محددة من عنصر maleimide للبروتين. يستخدم الفوسفات عازلة في هذا bioconjugation لأنها عازلة قوية في هذا النطاق درجة الحموضة ولا يتفاعل مع أي من الكواشف. تريس (hydroxymethyl) aminomethane (تريس) العازلة، على سبيل المثال، سيكون سوء اختيار كمجموعة أمين في هذا المخزن المؤقت يحتمل أن تتفاعل مع maleimide، التي من شأنها أن تؤدي إلى المحصول الضعيف. ذوبان جميع الكواشف هو أيضا المفتاح لعوائد عالية. إضافة كميات صغيرة (<10٪ ت / ت) من المذيبات العضوية يمكن أن تساعد في حل المكونات غير القطبية، في حين أن الرقم الهيدروجيني الصحيحة وتركيز الملح ضرورية للحفاظ على البروتينات في حل ومطوية 12. لprotei غشاء كبيرنانوثانية مع بقايا سطح مسعور كبيرة، السطحي سيكون ضروريا لمنع البروتين من عجل 18.

إذا كان البروتين في bioconjugation عرضة للأكسدة وdimerization، وقد تبين إضافة عامل مختزل مثل TCEP لتحسين المحاصيل bioconjugation 15. في الوضع الطبيعي للحد من البروتين في شكله أحادى، خالية من ثيول يسمح نسبة أكبر من المواقع ثيول النشطة يمكن الوصول إليها من قبل maleimide. ومع ذلك، من أجل الجمع ورياضيات الكيمياء هو مفتاح النجاح في زيادة العائد كما TCEP سوف تتفاعل أيضا مع maleimide. بإضافة maleimide بعد TCEP، سوف تستهلك TCEP عن طريق الحد من البروتين أولا. يستخدم نصف ما يعادل TCEP إلى البروتين لنفس السبب، بحيث الزائد TCEP لا يتوفر للرد سلبا مع maleimide الحرة. جسور ثاني كبريتيد الهيكلي على المناطق الداخلية من البروتين من غير المحتمل أن تتأثر إضافة TCEPأو الاختزال الأخرى مثل التلفزيون الرقمي الأرضي، شريطة أن البروتين لا يحتجزون في ظروف تغيير طبيعة مثل ارتفاع درجة الحرارة أو نسبة عالية من اليوريا. على سبيل المثال، إضافة وجود فائض كبير من DTT إلى CYT ج قبل FPLC تنقية لا يكون لها تأثير كبير على كمية من البروتين تعافى بعد تنقيتها. إذا كان يشتبه في الحد من الجسور السيستين الهيكلية التي TCEP، وهذا يمكن التأكد من تشغيل هلام بروتين تحت الأم الظروف، عدم تغيير طبيعة.

يتم تنقيته رو (II) المسمى bisterpyridine السيتوكروم ج تصنيعه في هذه الطريقة عن طريق ني 2+ يجمد المعادن الانجذاب اللوني 14. توجد طرق تنقية أخرى، مثل حجم اللوني الاستبعاد، وأنيون / تبادل الأيونات الموجبة اللوني، واللوني تقارب محددة مثل مرحلة ثابتة الأجسام المضادة. بشكل عام، فإن هذه الطريقة لا يزال هو نفسه كما هو موضح أعلاه، مع تركيز وغسيل الكلى الخطوات followinز تنقية الكروماتوغرافي إلى إعادة المنتج bioconjugate إلى منطقة عازلة مناسبة للتخزين.

الوسيلة الرئيسية لتحديد ما إذا كانت bioconjugation ناجحة هو عبر MALDI-TOF MS. هذه هي الطريقة الأكثر دقة لتأكد من الفرق الصغيرة في الكتلة بين البروتين الأصلي والبروتين المسمى تساهميا مع جزيء صغير، والفرق في كثير من الأحيان أقل من 1000 دا. الجزء الأكثر صعوبة في تشغيل التجربة MALDI-TOF MS هو اختيار مصفوفة واكتشاف تقنية. لكن caffeic حامض وقد وجد أن تكون موثوقة، مصفوفة للأغراض العامة لتحليل البروتينات وbioconjugates المستخدمة في هذا العمل. كبديل محتمل، حمض sinapinic هو آخر مصفوفة MALDI تستخدم عادة لتحليل البروتينات. تحليل البيانات MALDI-TOF MS واضحة نسبيا. ويبين الشكل 2 نموذجي الطيف MALDI-TOF MS كل نقية ISO-1 CYT ج (M ث = 12706 دا) ونقية رو (II) -cyt ج (Mث = 13559 دا)، وكلاهما تتوافق ارتباطا وثيقا الكتلة الجزيئية المحسوبة. ويمكن أيضا أن نقاء يتعين مراعاتها، مشيرا إلى عدم وجود ISO-2 السيتوكروم ج الذروة (م ث = 12532 دا) في الطيف غير المتفاعل وعدم وجود ISO-1 السيتوكروم ج الذروة في الطيف bioconjugate. ويمكن أيضا أن تقدر كتلة bioconjugate باستخدام هلام الكهربائي الشكل 3، 12٪ مكرر تريس هلام بروتين، يوفر قطعتين من الأدلة على bioconjugation. أولا، عدم وجود الفرقة ديمر في ظل ظروف غير الحد لرو (II) -cyt ج يشير إلى أن لم يعد هناك السيستين الحرة، والثانية، وتحول طفيف من الفرقة bioconjugate يترجم صعودا إلى زيادة في الوزن الجزيئي. المواد الهلامية بروتين لا تقدر بثمن ويمكن أن توفر نهائيا دليل على bioconjugation ناجحة ليس فقط لمرفقات جزيء صغير، ولكن أيضا لتركيب البروتين dimers 5 أو bioconjugates البروتين البوليمر 9.

للبروتيناتيستخدم تحتوي على حاملات مثل البروتين الفلوري الأخضر أو ​​سيتوكروم التي تحتوي على الهيم، التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس لتحديد تكوين والعائد من bioconjugate. 1: إضافة 1 خطية من الأطياف المواد الأولية تسمح ببناء طيف الأشعة فوق البنفسجية فيس افتراضية من bioconjugate، كما هو مبين في الشكل (4) وبمقارنة الطيف bioconjugate الفعلي لهذا 1: إضافة الطيف 1، يمكن تكوين يكون الاستدلال . على سبيل المثال، إذا كان اثنان أو أكثر رو (II) (طن سنويا) و2 -maleimides تعلق nonspecifically للبروتين، والفرقة 480 نانومتر من bioconjugate ستكون أعلى من الطيف المتوقعة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تركيز bioconjugate يمكن أن يقترب باستخدام نانومتر قيمة الامتصاصية المولية 410 من 97.6 سم -1 ملي -1. ومن المفترض أن يكون الشيء نفسه بالنسبة للbioconjugate لأن رو (II) (طن سنويا) 2 -maleimide ديه الحد الأدنى من الامتصاصية في هذه المنطقة.

وتجدر الإشارة إلى ثار bioconjugation عبر الكيمياء السيستين maleimide لديها العديد من القيود. أولا، يجب أن يكون البروتين من الفائدة يجب أن يؤديها لذلك، يمكن الوصول إليها بقايا السيستين، أو هندسة البروتينات شيء آخر واحدة لتقديم واحد. ثانيا، إن السندات السيستين maleimide هو عرضة للتبادل مع التجولات مجانية أخرى، مثل الزلال والجلوتاثيون في سياق تطبيقات البلازما 19. هذا التبادل هو يعتمد بشكل كبير على الوصول المذيبات والمسؤول المحلي على سطح البروتين. قد يكون لا يزال الروابط Maleimide-ثيول مناسبة للتطبيقات البلازما، ولكن يجب أن يتم التحقق الاستقرار على المدى الطويل باستخدام مطياف الكتلة والكهربائي للهلام.

على الرغم من هذا، و، وارتفاع مرفق ذو العائد محددة للغاية من جزيئات جديدة مثل الأصباغ الفلورية، ومراكز الأكسدة، والبوليمرات، وغيرها من البروتينات البروتينات عن طريق الكيمياء السيستين maleimide هي تقنية قوية تسمح مجموعة من بنيات الجزيئات المثيرة للاهتمام أن يكونccessed. وجود كميات كبيرة من bioconjugates البروتين كيميائيا واضحة المعالم هو المفتاح لدراسات مستقبلية تنطوي على بروتين ملزمة، التجميع الذاتي، حركية الانزيم وتوطين البروتين. كما هو موضح أعلاه، ابتداء من تنقية المواد، واختيار من وسط التفاعل، وإضافة الكواشف التكميلية مثل الحد من وكلاء أو السطحي فقط يكون لها تأثير كبير على عائدات bioconjugation. وحققت تنقية بسهولة عن طريق اللوني البروتين متوافق، ويتم إنجاز توصيف باستخدام مزيج من MALDI-TOF MS، هلام الكهربائي، والأشعة فوق البنفسجية فيس التحليل الطيفي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich 71496
sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71691
sodium chloride Sigma-Aldrich 73575
cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae Sigma-Aldrich C2436
dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
TSKgel SP-5PW Sigma-Aldrich Tosoh SP-5PW, 07161 3.3 ml strong cation exchange column
Amicon Ultra-15  Merck-Millipore UFC900308 3.5 kDa spin filter
Slide-A-Lyzer mini dialysis units Thermo Scientific 66333 3.5 kDa dialysis cassetes
Ru(II) bisterpyridine maleimide Lab made see ref (14)
acetonitrile Sigma-Aldrich A3396
ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 03609
tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride  Sigma-Aldrich 93284
imidazole Sigma-Aldrich 56749
nickel acetate Sigma-Aldrich 244066
AcroSep IMAC Hypercell column Pall via VWR: 569-1008 1 ml IMAC column
0.2 micron cellulose membrane filter Whatman Z697958 47 mm filter for buffers
0.2 micron PVDF membrane filter Merck-Millipore SLGV013SL syringe filters for proteins
hydrochloric acid Sigma-Aldrich 84426 Extremely corrosive! Use caution.
caffeic acid Sigma-Aldrich 60018 MALDI matrix
trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 91707 extremely corrosive! Use caution
SimplyBlue SafeStain Thermo Scientific LC6060 Coomassie blue solution
NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel Thermo Scientific NP0342BOX precast protein gels
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard Thermo Scientific LC5925 premade protein ladder
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Thermo Scientific NP0008 premade gel sample buffer
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) Thermo Scientific NP0004 premade gel reducing agent
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) Thermo Scientific NP0002 premade gel running buffer
Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS Applied Biosystems
Acta FPLC GE Fast Protein Liquid Chromatography
Cary 50 Bio Spectrophotometer Varian-Agilent UV-Vis
Milli-Q ultrapure water dispenser Merck-Millipore ultrapure water
Low volume UV-Vis Cuvette Hellma 105-201-15-40 100 microliter cuvette

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-272 (1998).
  2. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: Fishing for selectivity in a sea of functionality. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 6974-6998 (2009).
  3. Lyon, R. P., Meyer, D. L., Setter, J. R., Senter, P. D. Conjugation of anticancer drugs through endogenous monoclonal antibody cysteine residues. Meth. Enzymol. 502, 123-138 (2012).
  4. Natarajan, A., Xiong, C. Y., Albrecht, H., DeNardo, G. L., DeNardo, S. J. Characterization of site-specific ScFv PEGylation for tumor-targeting pharmaceuticals. Bioconjug. Chem. 16, 113-121 (2005).
  5. Hvasanov, D., et al. One-Pot Synthesis of High Molecular Weight Synthetic Heteroprotein Dimers Driven by Charge Complementarity Electrostatic Interactions. J. Org. Chem. 79, 9594-9602 (2014).
  6. Thordarson, P., Le Droumaguet, B., Velonia, K. Well-defined protein-polymer conjugates--synthesis and potential applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 243-254 (2006).
  7. Lutz, J. F., Börner, H. G. Modern trends in polymer bioconjugates design. Prog. Polym. Sci. 33, 1-39 (2008).
  8. Nicolas, J., Mura, S., Brambilla, D., Mackiewicz, N., Couvreur, P. Design, functionalization strategies and biomedical applications of targeted biodegradable/biocompatible polymer-based nanocarriers for drug delivery. Chem. Soc. Rev. 42, 1147-1235 (2013).
  9. Wong, C. K., et al. Polymersomes Prepared from Thermoresponsive Fluorescent Protein-Polymer Bioconjugates: Capture of and Report on Drug and Protein Payloads. Angew. Chem. Int. Ed. 5317-5322 (2015).
  10. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. Elsevier: Oxford. (2013).
  11. Li, J., Xu, Q., Cortes, D. M., Perozo, E., Laskey, A., Karlin, A. Reactions of cysteines substituted in the amphipathic N-terminal tail of a bacterial potassium channel with hydrophilic and hydrophobic maleimides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, (18), 11605-11610 (2002).
  12. Peterson, J. R., Smith, T. A., Thordarson, P. Synthesis and room temperature photo-induced electron transfer in biologically active bis(terpyridine)ruthenium(II)-cytochrome c bioconjugates and the effect of solvents on the bioconjugation of cytochrome c. Org. Biomol. Chem. 8, 151-162 (2010).
  13. Borges, C. R., Sherma, N. D. Techniques for the Analysis of Cysteine Sulfhydryls and Oxidative Protein Folding. Antioxid. Redox Signal. (3), 1-21 (2014).
  14. Peterson, J. R., Thordarson, P. Optimising the purification of terpyridine-cytochrome c bioconjugates. Chiang Mai J. Sci. 36, (2), 236-246 (2009).
  15. Hvasanov, D., Mason, A. F., Goldstein, D. C., Bhadbhade, M., Thordarson, P. Optimising the synthesis, polymer membrane encapsulation and photoreduction performance of Ru(II)- and Ir(III)-bis(terpyridine) cytochrome c bioconjugates. Org. Biomol. Chem. 11, (28), 4602-4612 (2013).
  16. Signor, L., Boeri Erba, E. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa. J. Vis. Exp. e50635 (2013).
  17. Foucher, M., Verdière, J., Lederer, F., Slonimski, P. P. On the presence of a non-trimethylated iso-1 cytochrome c in a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae). Eur. J. Biochem. 31, 139-143 (1972).
  18. Müller, M., Azzi, A. Selective labeling of beef heart cytochrome oxidase subunit III with eosin-5-maleimide. FEBS Lett. 184, (1), 110-114 (1985).
  19. Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat. Biotechnol. 30, (2), 184-189 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics