사용하여 셀 - 무료 분석

Biology

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Edens, L. J., Levy, D. L. A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation. J. Vis. Exp. (114), e54173, doi:10.3791/54173 (2016).

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Abstract

세포 생물학의 근본적인 문제는 세포와 세포 기관 크기는 조절하는 방법이다. 긴 두 셀에서 극적인 감소 핵 크기가 발생할 때 핵의 크기는 일반적으로 특히 배아 발생 동안, 셀의 크기로 스케일링하는 것이 인정되었다. 핵 크기 조절의 메커니즘은 크게 알려지지 및 변경된 핵 크기가 중요한 진단 및 예후 매개 변수입니다 암과 관련이있을 수 있습니다. 생체 내 핵 함수의 필수적인 복잡한 자연 복잡 핵 크기 조절기를 식별에 접근한다. 핵 크기 조절을 연구하기 위해 여기에 설명 된 체외 방법은 Xenopus의의 laevis의 개발 과정에서 발생하는 핵의 크기가 정상 감소 활용합니다. 우선 핵 X. 조립했다 계란 추출물 laevis의. 그런 다음,이 핵을 분리 후기 배아에서 세포질에 재현 탁하고 있습니다. 90 분 잠복기, 핵 표면적 - 30 후발달 핵 크기 스케일링 기여 후기 배아 세포질에 존재하는 구성 요소를 식별하는 데 유용한 분석법을 제공하고, 60 % - 20에 의해 감소​​한다. 이 방식의 가장 큰 장점은 계란 배아 추출물 생화학 핵 크기를 조절하는 신규 한 단백질 활동을 식별 할 수 있도록 조작 할 수있는 상대 설비이다. 체외 접근 방식에 어떤과 마찬가지로, 생체 시스템의 결과의 검증은 중요하고, X의 미세 주입 laevis의 배아는 이러한 연구에 특히 적합하다.

Introduction

세포 소기관의 크기는 통상적으로 전지의 크기 스케일링, 이는 아마도 최상의 셀 크기 1-10 핵 크기의 스케일링을 위해 설명되었다. 이것은 세포 및 핵의 크기 모두에서 극적인 감소는 종종 11, 12을 관찰 배아 및 세포 분화, 중 특히 그러하다. 또한, 변경 핵 크기는 암 진단 및 예후 13-17에서 중요한 파라미터이다. 핵의 크기 조절에 기여하는 메커니즘은 복잡 핵 구조와 기능의 본질에 부분적 대부분 알려져 있지 않다. 여기에 기재된 방법은 조작 및 생화학 핵 크기 조절 메커니즘의 해명에 의무가 핵 크기 스케일링을위한 시험 관내 분석으로 개발되었다.

Xenopus의 laevis의 달걀 추출물은 시험 관내에서 복잡한 세포 과정을 요점을 되풀이하고 공부 잘 설립 시스템 18-22 포함한 여러 세포 프로세스에 대한 새로운 기본 정보를 공개했다. 추출 시스템에 하나의 중요한 장점은 X.이다 laevis의 달걀 추출물 조성 쉽게 재조합 단백질 또는 immunodepletion의 추가를 통해 예를 들어, 변경할 수 있습니다 거의 희석 세포질을 나타냅니다. 또 하나는 달리 생체 내 상황에서 치명적일 수있는 치료법을 이용하여 필수 과정을 조작 할 수있다. 계란 추출물 절차의 수정은 X. 추출물의 분리를 허용 laevis의 배아가 아닌 계란,이 배아 추출물 생화학 적 조작 (23)에 동일하게 의무가 있습니다. X. 중 개발 laevis의 단일 셀 수정 된 배아 (~ 1mm 직경) (1 단계 - 8) 열두 빠른 세포 분열의 시리즈를 거쳐 생성하는 수천 50 μm의 직경 및 발달 단계에 도달하는 작은 셀은 midblastula 전이 (MBT) 나 스테이지 (8) 24-26 불린다. MBT가 접합체 전사, 세포 이동, 비동기 세포 분열 갭 위상 취득 및 핵 정상 크기보다는 사전 MBT 배아 같이 계속 핵 확장 확립의 발병을 특징으로한다. 개별 핵의 부피는 10 개 이상의 배 (11)에 의해 감소 - 낭 배기에 4 단계에서 (12 10.5 스테이지).

여기서, 목표는 개발 진행 중에 핵 크기의 이러한 감소에 대한 책임 메커니즘을 식별하는 것이다. 접근법은 제 X.에서 핵을 조립하는 계란 추출물을 laevis의와 난자 세포질 / 추출물에서 그 핵을 분리 할 수 있습니다. 이 핵은 다음 말 낭배 단계의 배아에서 세포질에 재현 탁하고 있습니다. 잠복기 후, 계란 추출물의 핵 후기 배아 추출물 작아진다. 우리는이 woul 것을 권유발달 핵 크기의 확장에 기여 후기 배아에 존재하는 세포질 구성 요소를 식별하기위한 유용한 분석이 될 거라고. 생체 검증과 함께이 분석을 사용하여, 우리는 단백질 키나제 C (PKC)는 X에서 핵의 크기 발달 감소에 기여하고 있음을 입증 23 laevis의.

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Protocol

모든 Xenopus의 절차와 연구는 실험 동물 8 판의 관리 및 사용에 대한 NRC 가이드를 준수 실시 하였다. 프로토콜은 와이오밍 기관 동물 관리 및 사용위원회 (보증 번호의 A-3216-01)의 대학에 의해 승인되었다.

X의 1. 준비 (27, 28에서 적응) laevis의 달걀 추출

  1. 프라임 여성 X. laevis의는 3 일 최소 임신 암말 혈청 성선 자극 호르몬 (PMSG)의 단일 100 IU 주입 계란 컬렉션 전 2 주 최대 개구리.
  2. 어느 날 실험하기 전에, 1 / 3 배 마크의 변경 벨소리 (MMR)의 개구리 당 1 L에 16 ° C에서 인간 융모 성 생식선 자극 호르몬 (HCG)과 장소의 800 IU와 프라임 개구리를 주입. 모든 버퍼 조성은 표 1을 참조하십시오.
    참고 : 일부 개구리가 알을 낳기하지 않거나 품질이 좋지 알을 낳는 것입니다. 일반적으로 2-3 개구리 sufficien을 마련 할 것이다 적어도 하나의 개구리를 보장하기 위해 주입좋은 품질의 계란 t 번호. 평균 개구리는 충분히 계란 계란 추출물의 최소 1 ml의 생산 배치됩니다.
  3. 1 / 3 배 MMR은 차가운 증류수 탈 이온수로 L (1) 준비 (DDH 2 O), 500 ml의 버퍼 B, 1 L 버퍼 C, 500 ml의 버퍼 D, 100 ml의 버퍼 E.
  4. 전송 유리의 결정화 접시 (150 X 75mm)에 계란을 마련했다. 팁과 플라스틱 파스퇴르 피펫을 차단하여, 흰색 푹신한 활성화 계란 또는 용해 계란을 농장. 만 독특하고 동일 어두운 동물 극과 흰색 식물 극 계란을 유지합니다.
  5. D 사이토 355 μM로 보충 버퍼 E의 1 ml의 13 X 51mm의 원심 분리기 튜브 준비 단계 1.7에서 사용하기 직전에 추가.
  6. Dejelly 계란을 씻어.
    1. 4 번 - 버퍼 3을 변경, 적절한 크기의 비커에 차가운 1 / 3 배 MMR 짧게 계란을 씻으십시오.
    2. 10 분 - 3이 걸릴 것이다 버퍼 B.이 함께 배양하여 계란의 젤리 코트를 제거합니다. 흐린 젤리 코트는 알에서 해제되면들, 버퍼를 변경합니다.
      참고 : 기울어과 식물 극이 아래쪽으로 지향 할 때 계란이 단단히 접시의 모서리에 포장 나타날 때 Dejellying이 완료됩니다. 계란은 훨씬 더 깨지기 쉬운 dejellying 후, 그래서 필요한 후속 세척보다 오래 버퍼 B와 알을 부화하지 않는 매우 신중하게 수행해야합니다.
    3. 버퍼 C. 4 변화 - 3 씻을 계란 간단히
    4. 버퍼 D. 2 변경 씻을 계란 간단히
    5. 버퍼 E. 2 변경 씻을 계란 간단히
  7. 넓은 구멍 유리 피펫 또는 플라스틱 스포이드를 이용하여 계란 원심 분리기 튜브를 입력합니다. 초과 버퍼 해제 대기음. 계란을 포장하고 30 초 동안 478 XG에 다음 60 초 동안 212 XG에 스윙 버킷 회 가능, 원심 분리기만큼 버퍼를 제거합니다. 초과 버퍼 해제 대기음.
    참고 : 계란 추출물이 최소한으로 희석하기 위해이 단계에서 가능한 한 많은 여분의 버퍼를 제거하는 것이 중요하다.
  8. 스윙에서 버킷 회 전자, 15 12,000 XG에 분, 4 ° C를위한 진공 초 원심 분리기가 열려 달걀 호감과 세포질이 중간에 황색 색의 층 인으로, 다른 층으로 분리합니다. 얼음에 즉시 원심 분리기 튜브와 장소를 제거합니다.
  9. 추출물을 수집합니다.
    1. 18 게이지 바늘과 주사기를 사용하여, 단지 관 아래쪽의 어두운 착색 층 위에 원심 관을 천공 및 중간 호박색 세포질 층을 제거한다. 상단 지질 층 중 하나를 수집하지 않습니다. 적절한 크기의 튜브에 세포질를 수집합니다.
      참고 : 일반적으로, 1 개구리 추출물의 최소 1 ml의를 생성합니다.
    2. 1 / 1,000 D 사이토 19.7 mm의 체적이 1 / 1,000 LPC 주식의 부피, 1/50 1/50 에너지 믹스의 볼륨 보충 세포질. 부드럽게 튜브를 혼합하는 반전. 과도하게 추출물을 피펫하지 마십시오.
    3. 얼음 추출을 유지하고 최상의 결과를 위해 준비 3 시간 이내에 사용한다.
(29에서 적응) Demembranated X를 laevis의 정자의 _title "> 2. 준비

참고 : 여기에 제시된 절차 볼륨은 최대 8 고환위한 것입니다.

  1. 0.05 %의 벤조 카인 (10 % 벤조 카인의 재고 에탄올 제조와 개구리 탱크의 물에 0.05 %로 희석) 4 ° C에서 실온에 따뜻한을 제거합니다. 마취 및 남성의 X를 희생 30 분 - 20 시간 동안 실온에서 벤조 용액 laevis의 개구리. 및 / 또는 잘린에 의해, 검사 및 기계적 자극에 대한 반응의 부족으로, 가슴 영역을 느낌으로 심장 박동의 부재에 의해 죽음을 확인합니다.
  2. 복부를 따라 U 자 모양의 절개를합니다. 노란색 지방 기관의 tubulated 질량을 제거합니다. 신장의 상단에 타원형 모양의 길이가 29에서 1cm에 대해 옅은 분홍색 덩어리입니다 고환을 찾습니다. 고환을 절제하고 혈액과 다른 조직을 제거하기 위해 종이를 모래 바닥에 그들을 롤.
  3. 버퍼 T. 사용에 버퍼 1 ㎖와 고환을 말하다하기 위해 꽉 장착 유봉을 고환을 씻으십시오균일 한 때까지 1.5 ML 튜브에 T (10 타 이상). 원심 분리기 5-10 미니 원심 분리기 초 및 조직의 큰 조각을 제거 뜨는를 수집합니다. 한 번 더 원심 분리를 반복하고 상등액을 수집합니다.
  4. 15 ML의 플라스틱 튜브에 정자 함유 용액을 전송합니다. 정자 펠렛 16 ° C에서 10 분 동안 1,411 XG에서 버퍼 T. 원심 분리기 2 ML의 총 볼륨을 높입니다.
  5. 상층 액을 제거하고 16 ° C에서 10 분 동안 1,411 XG에서 버퍼 T. 원심 분리기 500 μL에 펠렛을 재현 탁. 체세포 적혈구 펠렛을 청소할 필요 한두번이 단계를 반복한다.
  6. 5 분 동안 실온에서 100 ㎕의 버퍼 T 300 μL 버퍼 S. 인큐베이션에 펠렛을 재현 탁.
    참고 : 버퍼 S가 demembranation에 대한 책임 리소 레시틴이 포함되어 있습니다.
  7. 버퍼 R의 세 권을 추가 (사용 전에 신선한 준비). 정확히 한 번 튜브를 반전. 16에서 15 분 동안 1,411 XG에 원심 분리기# 176; C.
  8. 400 μL 버퍼 R의 펠렛을 재현 탁하고 16 ° C에서 15 분 동안 1,411 XG에서 버퍼 R. 원심 분리기의 추가 2ml를 추가합니다.
  9. 50 μL 버퍼 T.에 펠렛을 재현 탁
  10. 혈구이 희석을 적용 9 μL 버퍼 T. 1 μL demembranated 정자 핵을 희석. 하나의 큰 4 × 4 그리드 얇은 S 자형 정자 핵의 수를 계산하고 μL 당 정자의 핵에 대한 재고의 농도를 얻기 위해 100을 곱합니다.
  11. 200 배 재고 결과 버퍼 T와 μL 당 10 만 정자 핵에 주식을 희석. 5 μL 씩 - 3를 준비합니다. -80 ° C에서 액체 질소와 저장소에 플래시 동결.

3. 원자력 총회

  1. , 1.5 μL 35.5 MM의 사이클로 헥시 미드 (최종 농도 ~ 0.5 밀리미터)와 6 μl의 20 배 칼슘 원액 (최종 농도 ~ 0.6 mM)을 0.7 ㎕의 200 배 정자 (계란 추출물의 100 μl를 보충 최종 농도 ~ 700정자 핵 / μL). 반응 볼륨 위 또는 아래로 필요를 확장 할 수 있습니다. 반전 또는 부드럽게 섞어 누릅니다.
    참고 : 계면에 중기에서 순환 추출 핵 어셈블리에 대한보다 강력하고 안정적​​인 플랫폼을 제공합니다.
  2. 90 분 동안 20 °의 C - 16 수욕 인큐베이션. 부드럽게 핵 추출물에서 정지 상태로 유지하기 위해 매 15 분을 눌러 섞는다.
  3. 다음과 같이 스쿼시를 준비하여 45 분에서 핵 어셈블리의 진행 상황을 모니터링합니다.
    1. 피펫 (2) 유리 슬라이드 위에 추출물의 μL 2 μL 핵 수정을 추가합니다.
    2. 22 ㎜ × 2 coverslip에와 오버레이. 100X 목표와 DAPI 필터 - 물, 기름, 또는 공기 (20)를 사용하여 표면 형광 현미경 이미지.
      주 : 핵 시야 촬상 시각화하지만 형광으로 가시화하는 것이 훨씬 쉽게 할 수있다.
    3. -80 ° C에서 액체 질소와 저장소에 즉시 핵 또는 플래시 동결 씩 사용합니다.
      주 : 핵 PR 4 % 글리세롤을 추가자신의 무결성을 유지하는 데 도움이 될 수 있습니다 동결에 IOR. 냉동 핵 그러나 냉동 프로세스가 중단 또는 그 이상의 구조적으로 취약한 핵으로 이어질 수 있습니다, 아직 일반적으로 가능한 핵 수입 할 수있다. 핵 동결 후 1 년까지 사용할 수 있습니다.

X. 4. 제조 laevis의 배아 추출물

  1. 여성의 X를 유도 1.1 및 1.2에 설명 된대로 알을 낳기 위해 개구리를 laevis의.
  2. 남성 X.에서 고환을 분리 2.2에 설명 된대로 개구리를 laevis의. 유리 35 X 10mm 페트리 접시에 페니실린과 스트렙토 마이신의 50 IU / ㎖로 보충 L15 매체에서 고환 잠수함. 최대 2 주 동안 4 ° C에서 보관하십시오.
  3. 수집과 계란을 기름지게.
    1. 유리 재사용 페트리 접시 위에 개구리를 잡고 갓 누워 계란을 수집하고 허리 배설강 주변에 부드러운 압력을 적용하여 계란 부설을 추진합니다. 부풀어 복부와 REQ로 이어지는 부상을 초래할 수 있습니다 너무 열심히 개구리를 꽉 조이고안락사 (29) uiring.
    2. 대략 45 ° 각도로 요리 소품, 계란, 접시의 가장자리에서 수집하는 모든 여분의 버퍼를 제거하고 겨우 계란을 충당하기에 충분한 1 / 3 배 MMR을 추가 할 수 있습니다. 컬렉션의 15 분 안에 계란을 기름지게.
    3. 담가서 부드럽게와 바스의 염 (높은 소금 MBS)을 수정 높은 소금의 500 μL와 1.5 ML 튜브에서 고환의 1/4을 균질화 단단히 장착 유봉을 사용합니다. 다음 1 / 3 배 MMR과 계란 홍수, 20 분 - 계란에 침연 (macerated) 고환을 추가하고 15 실온에서 발생하는 수정을 허용.
      주 : 정소의 효율성 일주일 이상 저장된 고환을 사용하는 경우, 따라서 더 정소 조직이 성공적으로 수정 요구 될 수 있고, 저장 시간에 따라 감소한다.
    4. 짓 눌린 teste 첨가 한 후 30 분 - 보통 (20)이 위를 향 어두운 착색 된 동물 극의 수축을 확인하여 자신의 동물 극 배아의 회전에 의해 수정 확인에스. 첫 번째 셀 절단 90 분 이내에 발생할 것으로 예상된다.
    5. 그들은 신속하게 주변 배아의 죽음을 유도하는 바와 같이, 용해, 부지런히 죽은 (흰색 푹신한 또는 노른자와 안료의 치우침)를 제거 넓은 구멍 유리 피펫을 사용하여, 또는 미 수정 계란 (즉, 절단하지 않음).
    6. 어디서든 1 - 3 % 시스테인 1/3 X MMR에 용해하고 10 N KOH으로 pH 7.9로 조정 - dejelly 2 배아는 2.5 시간의 후 수정. 4 분 - 각 3 두 개의 버퍼 변경을 수행합니다. 시스테인의 모든 흔적을 제거하기 위해 1 / 3 배 MMR 10 간단한 변화 - 철저히 6 배아를 씻으십시오.
      참고 : Dejellied 배아는 난황 막을 가지고 dejellied 계란만큼 허약하지 않다.
  4. 넓은 구멍 유리 피펫을 사용하여 16 ° C 신선한 1 / 3X MMR을 함유하는 페트리 접시에 건강 수정 된 (즉, 절단) 배아를 전송하고 느리게 전개가 바람직한 경우 그것들은 RT에서 원하는 스테이지 개발하거나 할 수있다. 죽거나 사라져을 제거하기 위해 계속SED 배아는 첫 번째 부문 또는 흰색 부푼 모양의 부족으로 나타났다.
  5. blastopore의 거의 완전한 폐쇄를 확인하여 및 참고 자료 (24)에서 사용할 수 개최 배아의 도면을 비교하여 배아의 단계를 확인합니다.
    참고 : 배아 단계를 11.5에 도달 할 것 16 ° C에서 배양 - 약 12​​ 시간에서 12.
  6. 후반 계면에서 배아를 체포, 실온에서 1 시간 동안 0.5 밀리미터 사이클로 헥시 미드와 보충 신선한 1 / 3 배 MMR 12 배아 - 단에게 11.5를 품어.
  7. 넓은 구멍 유리 또는 플라스틱 피펫 (15) (바람직하게는 30 이상)의 최소 미세 원심 튜브에 계면 체포 배아로 전송합니다.
    참고 : 15 배아 추출물의 약 20 μl를 생산하기에 충분하다. 필요에 따라 확장.
  8. LPC 주식의 1 μl를 보충 1 ml의 계란 용해 버퍼 (ELB)를 추가합니다. 부드럽게, 배아를 씻어 배아는 튜브의 바닥에 떨어지지 및 버퍼를 제거하는 반전. 이 세척 단계를 두 번 더 반복합니다. </ 리>
  9. ELB 500 μL 플러스 LPC 주식의 0.5 μL, 19.7 MM의 사이클로 헥시 미드의 5 μL 및 D 사이토 35.5 mm의 5 μL에 재현 탁 배아는 (액틴의 중합을 억제하기 위해). 탁상의 microcentrifuge 1 분 동안 200 XG에 원심 분리기.
  10. 여분의 버퍼를 제거하고 철저하게 배아를 분쇄하는 유봉을 사용합니다. 10,000 XG에 10 분, 16 ° C에 대한 스윙 버킷 로터에서 원심 분리기.
  11. 200 μL 피펫 팁으로 위에서 지방층 천공. 깨끗하고 200 μL 피펫 팁으로, 적절한 크기의 튜브에 중간 세포질 황색 색의 층을 제거.
  12. 50X 에너지 믹스의 볼륨 (AN ATP 재생 시스템을 제공하는) 1/50로 보충 배아 추출액, 1/100 35.5 밀리미터 시클로 헥시 미드, D 사이토 19.7 mm의 1/500 부피 및 1 / 1,000의 체적의 체적 LPC의 재고.
  13. 추출물의 내생 배아 핵을 시각화 3.3에 설명 된대로 스쿼시를 준비합니다.
    참고 : 배아 추출물로 고정 할 수 있습니다 이 시점에서 내인성 핵. 나누어은 -80 ° C에서 동결 / 해동 사이클 및 저장을 줄일 수 있습니다.
  14. 1/50 1/50 에너지 믹스의 체적 1/100 함유 ELB의 동량 추출물을 희석 배아 추출물에서 핵을 제거하기 위해 35.5 밀리미터 시클로 헥시 미드의 체적 1/500 D 사이토 19.7 mm의 부피 및 1 / 1,000 LPC 주식의 볼륨. 16 ° C에서 15 분 동안 17,000 XG에 스윙 버킷 로터에서 원심 분리기.
  15. 상단에 남아있는 지질 않도록주의하면서 상층 액을 수집합니다. 튜브의 하단에있는 펠렛 핵을 방해하지 마십시오. 대부분의 핵이 제거 된 것을 확인하기 3.3에 기재된 바와 같이 스쿼시를 준비한다. -80 ° C에서 신선한 추출물 또는 나누어지는 및 저장을 사용합니다.
  16. 열 사이 클러를 이용하여 30 분 동안 56 ° C에서 추출 100 ㎕ 씩 - 대조 실험 열 30 배아 추출액을 비활성화 가열. 열 불 활성화 추출물을 사용하기 전에 실온으로 복귀 할 수 있습니다.
분석 및 면역 형광 축소 _title "> 5. 핵

  1. 1.5 ㎖의 튜브에 1 ㎖의 ELB에서 미리 조립 된 핵의 150 μL - 25 희석 계란 추출물 조립 핵을 분리. 탁상의 microcentrifuge 4 ° C에서 3 분 동안 1,600 XG에 원심 분리기. 튜브의 하단에있는 핵의 허약 한 펠렛을 방해하지 않도록주의, 버퍼를 제거합니다.
  2. 5.1 사용 계란 추출물 원래 볼륨 동일 배아 추출액의 부피에 핵을 재현 탁. 적절하게 사용 ELB 또는 제어 반응에 열 불 활성화 추출물,.
  3. 조심스럽게 펠렛을 중단하고 핵을 재현 탁하기 위해 튜브를 누릅니다. 30 분 - 부드럽게 매 15 섞어 튜브를 눌러, 90 분 동안 실온에서 인큐베이션. 주 : 핵 수축의 대부분은 처음 30 분 내에 발생한다.
  4. 스쿼시를 준비하여 핵 수축의 진행 상황을 모니터링합니다.
    1. 피펫 (2) 유리 슬라이드 위에 추출물의 μL 2 μL 핵 수정을 추가합니다.
    2. 22 ㎜ × 2와 오버레이
  5. 직전 ELB로 구성된 정착액의 500 μL, 15 % 글리세롤, 2.6 % 파라 포름 알데히드를 추가로 핵을 재현 탁하기 위해 튜브를 누릅니다. 즉시 전환하고, 실온에서 15 분 동안 회전에 튜브를 놓는다.
  6. 둥근 바닥 플라스틱 삽입 (설계 및 요청에 따라 사용할 수 회로도)를 15 ml의에게 둥근 바닥 유리 튜브를 여비로 튜브를 스핀 다운 준비합니다. 핵 쿠션 버퍼의 5 ML을 추가합니다. 이 플라스틱 삽입물의 상단에 편평하게 놓여 있는지되고, 튜브에 12mm 원형 coverslip에 놓습니다.
  7. 부드럽게 넓은 구멍 피펫 팁을 사용하여 핵 쿠션의 상단에 고정 핵을 포함하는 용액을 층. 1,000 XG에 15 분, 16 ° C에 대한 스윙 버킷 로터에서 원심 분리기.
  8. 버퍼를 모두 제거하고 튜브의 상단에 플라스틱 삽입물을 당겨하는 흡입기를 사용합니다. 덮개의 측면을 주목하는주의하면서 미세 집게 한 쌍의 커버 슬립을 제거핵이 회전 된에 미끄러. 차가운 메탄올 후 수정은 실온에서 5 분간 (-20 ° C에 저장).
  9. 큰 플라스틱 페트리 접시를 안감 플라스틱 파라핀 필름 한 장에 최대 coverslip에 핵 측을 전송합니다. 탈수를 방지하기 위해 접시의 측면을 따라 젖은 일회용 물티슈를 놓습니다.
  10. 10 초 - 오 후 PBS-NP40 500 μL (1X PBS 플러스 0.1 % NP40) 및 흡인으로 커버 슬립에 핵을 재수.
  11. 조심스럽게 커버 슬립에 PBS-3 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 75 μl를 층. 실온에서 1 시간 또는 밤새 4 ° C를 차단 할 수 있습니다.
  12. 차단 용액 제거 차 항체로 배양한다 (예 핵공 복합체 1 대 mAb414 : 1000)을 실온에서 하룻밤 동안 또는 4 ℃에서 1 시간 동안 PBS-3 % BSA로 희석시켰다. PBS-NP40 다섯 즉각적인 변화를 씻으십시오.
  13. RT에서 1 시간 동안 PBS-3 % BSA로 희석 된 이차 항체로 인큐베이션. PBS-NP40 다섯 즉각적인 변화를 씻으십시오.
  14. 품다10 μg의로 / ㎖ 훽스트을 RT에서 5 분 동안 PBS-3 % BSA로 희석시켰다. PBS-NP40와 다섯 번 씻으십시오. 모든 여분의 버퍼를 제거합니다.
  15. 5 μL의 antifade 설치 매체와 슬라이드 위에 커버 슬립을 탑재합니다. 명확한 매니큐어로 밀봉합니다. 나중에 영상 4 ° C에서 100 배 목적 또는 저장 - 이미지는 즉시 표면 형광 (20)와 현미경을 사용.
    참고 : 이전에 23 설명한 바와 같이 정량화를 수행합니다.

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Representative Results

계란 추출물의 핵의 조립

이 프로토콜의 첫 번째 단계는 X를 준비한다 laevis의 달걀 추출물 (프로토콜 1) demembranated 정자 핵 (프로토콜 2). 이 시약은 핵 드 노보 (프로토콜 3)를 조립하는 데 사용됩니다. (1) 일부 대표 데이터를 보여줍니다. 칼슘 첨가 계면에 meiotically 체포 계란 추출물을 구동하고, 사이클로 헥시 미드는 계면에서 체포 추출물을 유지합니다. (30) - 반응 개시 후 45 분, 처음에 얇은 S 모양의 정자 핵 총알 모양의 염색질 대중에 두껍게하기 시작한다. 온전한 핵막의 성공적인 형성 예컨대 GST-GFP-NLS (데이터 미도시) 또는 FG 반복 인식 mAb414를 사용 핵공 컴플렉스 림 염색과 같은 형광 표지 된 수입화물 수입 및 유지에 의해 평가할 수있다 contai닝 nucleoporins (그림 1A). 핵 어셈블리가 발생하면, 핵 모양이 더 둥근이되어야하고 핵 봉투가 확장 핵 단백질 (그림 1B-C) 가져으로 핵 볼륨이 증가한다. 온전한 핵 봉투 핵 성장의 형성을 준수하지 않으면 가난한 품질의 계란 추출물을 나타냅니다. 이 경우에는, 계란의 새로운 배치로 다시 시작하는 것이 최상이다.

배아 추출물에서 내인성 핵의 제거
다음 단계는 후기 배아 추출액 (4 프로토콜)을 제조하는 공정이다. 추출물 전에 핵의 제거에 초기 준비 후에는 추출물의 작은 나누어지는의 훽스트 염색 스쿼시를 준비하는 것이 좋습니다. 많은 작은 배아 핵의 시각화 추출물 (그림 2A)를 준비에서 성공의 좋은 지표이다. 내인성 배아 핵 하류 analysi 방해 할 수S, 이는 희석 및 원심 분리에 의해 제거한 후 핵 추출물의 분취 량을 확인하는 것이 중요하다. 첫 번째 스쿼시에 비해 매우 적은 핵은 추출물 (그림 2B)에 남아 있어야합니다. 많은 핵이 여전히 존재하는 경우, 원심 분리의 두 번째 라운드가 필요하다.

핵 축소 분석
그림 3은 핵 축소 분석을위한 대표적인 결과 (프로토콜 5)를 보여줍니다. 후기 배아 추출물에 재현 탁 계란 추출물 핵 시간 (그림 3B)를 통해 작아진다. 분석을위한 좋은 음성 대조군은 열 불 활성화 (그림 3A)이었다 배아 추출물 핵을 배양하는 것입니다. 핵 열 불 활성화 추출물 축소하지 않을 때,이 처리되지 않은 배아 추출물 축소 핵 관찰 자신감이 삼투 효과의 결과 아닙니다 제공합니다. 핵 크기의 정도관찰 된 감소는 계란 추출물 핵의 특정 배치뿐만 아니라, 배아 추출액의 품질에 따라 달라진다. 우리의 경험에 의하면, 핵 축소 항상 그러나 그것은 다른 핵으로이 실험을 여러 번 반복하는 것이 중요하다 및 분석의 내재 변동성을 해결하기 위해 추출 (예를 들어, 40 개 이상의 서로 다른 배아 추출물)이 관찰된다. 그림 4는 회로도를 보여줍니다 전체 프로토콜.

그림 1
그림 X에서 1 원자력 조립 시간 코스 laevis의 달걀 추출. 핵은 X에서 드 노보 조립했다 핵 기공 단지 (NPC) (mAb414)에 대한 항체를 사용하여 면역 형광하여 동일한 반응 3. 분취 량은 고정 가시화 된 프로토콜에 설명 된대로 계란 추출물을 laevis의 : > A) 30 분, b) 60 분, 및 C) 핵 조립체 개시 후 90 분. 면역 프로토콜은 스케일 바는 25 μm의입니다. 프로토콜 5에 설명 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
X.에서그림 2. 제거 배아 추출물을 laevis의. X. A) 전에 원심 분리하여 핵의 제거 후 핵의 제거 및 B)에 : 프로토콜 4에 설명 된대로 추출물의 작은 나누어지는 고정 및 훽스트로 염색 된 12 배아 - laevis의 배아 추출물 단계에서 11.5를 제조 하였다. 스케일 바는 25 μm의입니다.톰 / 파일 / ftp_upload / 54173 / 54173fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 대표 데이터 핵 축소 분석에서. 핵은 X에서 드 노보 조립했다 재조합 GFP-LB3 보충 laevis의 달걀 추출물 (핵 라미을 시각화합니다). 프로토콜 5에 기재된 바와 같이, 계란 추출물 핵을 분리하고 단계 11.5 재현 탁 - 내인성 배아 핵이 제거 된 12되는 배아 추출물. 라이브 시간 경과 영상은 90 분 동안 30 초 간격으로 수행 하였다. A) 후기 배아 추출물 (LEE), 및 B) 열 불 활성화 (HI) 배아 추출물 그림 패널에서 배양 핵 6 분 간격으로 획득 된 영상을 보여줍니다. 시간 코스의 이미지는 계속에서 왼쪽에서 오른쪽으로. 스케일 바는 46 다른 계란과 배아 추출물에서 25 μm의. C) 핵 축소 데이터입니다. 바> (240) 핵에 대한 방법을 보여줍니다. 오차 막대는 표준 편차이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
분석을 축소 핵의 그림 4 도식은. 각각의 색 상자가 하나의 프로토콜을 나타냅니다. 빨간색 X의 준비를 나타냅니다 laevis의 달걀 추출물 (프로토콜 1). 블루 demembranated X의 준비를 나타냅니다 laevis의 정자 (프로토콜 2). 핑크 계란 추출물에 드 노보 핵 어셈블리 (프로토콜 3)을 나타냅니다. 녹색 X의 준비를 나타냅니다 laevis의 배아 추출액 (프로토콜 4). 보라색 ​​핵의를 나타냅니다hrinking 분석 및 면역 프로토콜 (프로토콜 5). 이 그림의 일부가 23에서 재사용되고있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

버퍼 이름 버퍼 조성
마크의 수정 링거 (MMR), 1 / 3 배 33 mM의 염화나트륨, 0.7 mM의 KCl을 0.3 mM의 황산, 0.7 mM의 CaCl2를 1.7 mM의 HEPES, pH 7.4의
추출 버퍼 (XB), 10 배 1 M의 KCl, 1 mM의 CaCl2를 10 밀리미터의 MgCl 2, 500 mM의 수 크로스, 100 mM의 HEPES은 pH가 7.8 (pH는 4 ° C에서 저장, 10 N KOH로 조정)
버퍼 B 시스테인은 0.8 배의 XB에 용해 된 4 %는 (냉 DDH 2 O, pH를 a를 준비10 N NaOH로 7.8 djusted)
버퍼 C 차가운 DDH 2 O의 900 ml의 10 배 XB의 100m 믹스
버퍼 D 버퍼 C 플러스 5 밀리미터 EGTA 및 800 μM의 MgCl 2
LPC 스톡, 1000 배 10 ㎎ / ㎖ 류 펩틴, 펩 스타틴 및 DMSO에 용해 chymostatin 각 (-20 ℃에서 분취 량으로 저장)
버퍼 E 100 ml의 버퍼 D 플러스 100 μl의 LPC의 재고
에너지 믹스, 50 배 190 mM의 크레아틴 인산 나트륨, 25 mM의 ATP의 나트륨 염, 25 mM의 염화 마그네슘
버퍼 T 15 mM의 파이프, 15 mM의 NaCl을, 5 mM의 EDTA, 7 밀리미터의 MgCl 2, 80 밀리미터의 KCl, 0.2 M 자당, pH가 7.4 (필터 소독과 4 ° C에 저장)
버퍼 S 말토오스 20 밀리미터 및 버퍼 T에서 제조 된 리소 레시틴 0.05 %
버퍼 R 버퍼 T 플러스 3 % 소혈청 알부민
칼슘 원액, 20 배 10 mM의 염화칼슘 2, 0.1 M의 KCl, 1 mM의의 MgCl 2 (-20 ° C에 저장)
핵 수정 125 μL의 2 M 수 크로스, pH가 7.9 12.5 ㎕의 1 M HEPES, 250 μL의 37 % 포름 알데히드, 112 μL의 DDH 2 O 0.5 ㎕의 10 ㎎ / ㎖ 훽스트 (최대 2 주 동안 실온에서 보관)
수정 바스의 염 (MBS), 10 배 880 mM의 염화나트륨, 10 mM의 KCl을 50 mM의 HEPES, 25 밀리미터의 NaHCO3, pH가 7.8
높은 소금 MBS 1X MBS 플러스 0.7 mM의 CaCl2를 20 mM의 염화나트륨
에그 용해 완충액, ELB 250 mM의 수 크로스, 50 mM의 KCl을 2.5 밀리미터의 MgCl 2, 10 mM의 HEPES, pH가 7.8
핵 쿠션 버퍼 1X XB, 0.2 M 수 크로즈, 25 % 글리세롤 (필터 살균 및 4 ℃에서 보관)

표 1. 버퍼.이 프로토콜에 언급 된 모든 버퍼의 조성물은이 표에 설명되어 있습니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG Molecular Probes A10037
ATP disodium salt Sigma Aldrich A2383
Benzocaine Sigma Aldrich E1501
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059
CaCl2 Sigma Aldrich C3306
Centrifuge Beckman J2-21M
Centrifuge rotor Beckman JS 13.1
chymostatin Sigma Aldrich C7268
creatine phosphate disodium Calbiochem 2380
cycloheximide Sigma Aldrich C6255
cytochalasin D Sigma Aldrich C8273
disposable wipes (kimwipes) Sigma Aldrich Z188956
L-cysteine Sigma Aldrich W326306
EGTA Sigma Aldrich E4378
Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
Glass crystallizing dish (150 x 75 mm) VWR 89090-662
Glycerol Macron 5094-16
HEPES Sigma Aldrich H4034
Hoechst - bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma Aldrich B2261
HCG - Human Chorionic Gonadotropin  Prospec hor-250-c
L15 Media Sigma Aldrich L4386
leupeptin Sigma Aldrich L2884
Lysolecithin Sigma Aldrich L1381
mAb414 Abcam ab24609
MgCl2 EMD MX0045-2
MgSO4 Sigma Aldrich M9397
Maltose Sigma Aldrich M5885
NP40 BDH 56009
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin + Streptomycin Sigma Aldrich Pp0781
pepstatin Sigma Aldrich P5318
PIPES Sigma Aldrich P6757
Plastic paraffin film (parafilm) Sigma Aldrich P7793
KCl Sigma Aldrich P9541
KH2PO4 Mallinckrodt 70100
KOH Baker 5 3140
PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin Prospec hor-272-a
NaCl Sigma Aldrich S3014
NaHCO3 Fisher BP328
Na2HPO4 EMD SX0720-1
NaOH EMD SX0590
Pestle Thomas Scientific 3411D56
Round bottom glass tubes, 15 ml Corex 8441
Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) ThermoFisher A10037
sucrose Calbiochem 8550
thermal cycler Bio-Rad T100
Ultracentrifuge Beckman L8-80M
Ultracentrifuge rotor Beckman SW 50.1
Vectashield (anti-fade mounting medium) Vector H-1000

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