用いた無細胞アッセイ

Biology

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Edens, L. J., Levy, D. L. A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation. J. Vis. Exp. (114), e54173, doi:10.3791/54173 (2016).

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Abstract

細胞生物学の根本的な疑問は、細胞や細胞小器官のサイズが規制されている方法です。長い細胞や核のサイズの両方の劇的な削減が発生したときに、核の大きさは、一般的に胚形成の間、特に、セルの大きさに比例することが認められています。核のサイズ調節のメカニズムは不明な点が多いと変更された核の大きさがキー診断および予後のパラメータである癌に関連する可能性がある。 インビボ核サイズ調節因子が核機能の本質的かつ複雑な性質によって複雑されている識別に近づきます。核のサイズ制御を研究するためにここに記載のin vitroアプローチは、 アフリカツメガエルの開発中に発生する核の大きさが通常の減少を利用しています。まず、核はXに組み立てられます卵抽出物をアフリカツメガエル 。そして、これらの核は、後期胚から単離され、細胞質中に再懸濁します。 90分のインキュベーション期間、核の表面積 - 30後発達核のサイズスケーリングに貢献後期胚に存在する細胞質成分を識別するために有用なアッセイを提供し、60% - 20によって減少します。このアプローチの主な利点は、卵や胚抽出物は、生化学的に核の大きさを調節する新規タンパク質や活動の同定を可能にする、操作することが可能な相対的な施設です。任意のインビトロのアプローチと同様に、in vivo系での結果の検証が重要であり、Xのマイクロインジェクションツメガエル胚は、これらの研究のために特に適しています。

Introduction

細胞小器官の大きさは、典型的には、細胞の大きさに比例し、これはおそらく最高のセルサイズ1-10との核の大きさのスケーリングのために文書化されています。これは、細胞と核の大きさの両方の劇的な減少は、多くの場合、11,12を観察している胚形成および細胞分化、中に特に当てはまります。また、変更された核の大きさは、癌の診断および予後13-17で重要なパラメータです。核のサイズの調節に寄与メカニズムは複雑さに起因する部分と核構造と機能の本質的な性質で、不明な点が多いです。ここで説明する方法は、生化学的操作および核のサイズ調節のメカニズムの解明に適している核のサイズスケーリングのためのin vitroアッセイとして開発されました。

アフリカツメガエルの卵抽出物は、in vitroでの複雑な細胞過程を再現し、研究するために十分に確立されたシステムであり、 18-22を含むいくつかの細胞プロセスに関する新たな基本的な情報を明らかにしました。抽出システムへの重要な利点の1つは、Xです。ツメガエル卵抽出物は、その組成が容易に組換えタンパク質または免疫除去の添加によって、例えば、変更することができ、ほぼ未希釈の細胞質を表します。また、一方がさもなければインビボの状況において致死的であるかもしれない治療を使用することによって本質的なプロセスを操作することができます。卵抽出物手順の変更は、Xからの抽出物の単離を可能にツメガエル胚ではなく、卵、およびこれらの胚抽出物は、生化学的な操作23にも同様に適しています。 X.中に数千50μを生成する-開発をアフリカツメガエル 、単細胞受精胚(〜1ミリメートルの直径)は12急速な細胞分裂(8ステージ1)のシリーズを受けますメートルの直径と発達段階に到達したより小さな細胞は、中期胞胚変移(MBT)またはステージ8 24-26と呼ばれます。 MBTは接合体、転写、細胞遊走、非同期細胞分裂、ギャップ相の取得、および核定常状態のサイズではなく、事前MBT胚のように継続的な原子力拡大の設立の発症によって特徴付けられます。ステージ4から原腸形成(段階10.5から12)に、個々の核の体積が10倍以上11により減少します。

ここでは、目標は、発達の進行の間の核の大きさで、これらの削減のための責任のメカニズムを識別することです。アプローチは、最初のXで核を組み立てることです卵抽出物をアフリカツメガエル卵細胞質/抽出物から、それらの核を単離すること。これらの核は、その後、後期原腸段階の胚から細胞質中に再懸濁されています。インキュベーション期間後、卵抽出物からの核は後期胚抽出物中より小さくなります。我々は、このwoulと推論しました発達核のサイズスケーリングに貢献後期胚に存在する細胞質成分を同定するために有用なアッセイをd。 インビボでの検証と結合し、このアッセイを用いて、我々は、プロテインキナーゼC(PKC)は、Xの核の大きさの発達削減に寄与することが実証され23を アフリカツメガエル

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Protocol

すべてのアフリカツメガエルの手順と研究は実験動物第8版の管理と使用に関するNRCガイドに準拠して実施しました。プロトコルは、ワイオミング州制度動物実験委員会(保証#のA-3216から01まで)の大学によって承認されました。

X.の調製(27,28から適応) ツメガエルの卵抽出物

  1. プライム女性のX.ツメガエルは、妊馬血清ゴナドトロピン(PMSG)の単一の100 IU注射で採卵前3日間の最小値と2週間の最大のカエル。
  2. ある日、実験の前に、1/3倍のカエルあたり1Lに16℃でマルクの修正リンガー(MMR)を下塗りしたヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)の800 IUとカエルと場所を注入。すべてのバッファの組成については、 表1を参照てください。
    注:一部のカエルが卵を産みませんか質の悪い卵を産みます。典型的には2から3カエルはsufficienを築くだろう少なくとも一つのカエルを確実にするために注入され、良質の卵のトン数。平均カエルが卵抽出物の少なくとも1ミリリットルを生成するために十分な卵を産むでしょう。
  3. 1/3×MMRは、冷蒸留脱イオン水でL 1準備(のddH 2 O)500mlの緩衝液B、1Lの緩衝液C 500mlのバッファーD、100 mlのBuffer E.
  4. 転送は、ガラス結晶皿(150×75ミリメートル)に卵を築きました。先端がプラスチック製のパスツールピペットを使用すると、白いふくらんで活性化した卵または溶解卵を外注、カットオフ。唯一の明確なと等しく暗い動物極と白の植物極の卵を保持しています。
  5. Dサイトカラシン355μMを補充した緩衝液Eの1ミリリットルで13×51ミリメートルの遠心チューブを準備し、ステップ1.7で使用直前に追加されました。
  6. Dejellyと卵を洗います。
    1. 4回 - バッファ3を変更すること、適切なサイズのビーカーに冷たい1/3×MMRで簡単に卵を洗ってください。
    2. 10分 - 3からどこでも取る緩衝液Bこれとのインキュベーションによって卵からのゼリーのコートを削除します。曇ったゼリーコートは卵から放出されるようにsが、バッファを変更してください。
      注:卵が傾いたときにしっかりと皿の隅に詰め、植物極が下方向に配向されて表示されたときDejellyingは完了です。卵はdejellying後にはるかに壊れやすいので、必要とその後の洗浄よりも長く緩衝液Bで卵をインキュベートしていない非常に慎重に実行する必要があります。
    3. 緩衝液Cの4変化 - 3で洗浄卵の簡単
    4. 緩衝液Dの2変更で洗浄卵簡単に
    5. バッファーEの2変更で洗浄卵簡単に
  7. 広口ガラスピペットやプラスチックスポイトを使って卵を遠心管を埋めます。余分なバッファーを吸引除去。卵をパックし、できるだけ多くのバッファを削除し、60秒間212×gで、スイングバケットローターで遠心分離した後、30秒間478×gでするには。余分なバッファーを吸引除去。
    注:卵抽出物を最小限に希釈されていることを確認するために、この段階でできるだけ多くの余分なバッファーを除去することが重要です。
  8. スイングでバケットローター、細胞質が途中で琥珀色の層であることで、異なる層にオープンし、別々の卵をつぶすために12,000×gで4℃で15分間真空下で超遠心分離機。遠心分離管を取り外し、直ちに氷上に置きます。
  9. 抽出液を収集します。
    1. 18ゲージの針と注射器を使用して、ちょうどチューブの底の暗い着色層の上に遠心管を穿刺し、中央の琥珀色の細胞質層を除去します。トップ脂質層のいずれかを収集することはありません。適切なサイズのチューブに細胞質を収集します。
      注意:一般的に、1カエルは、抽出物の少なくとも1ミリリットルを生成します。
    2. 1 /千Dサイトカラシン19.7ミリモルの量、1 /千LPCストックの量、および1/50 50倍のエネルギーミックスのボリュームと補足細胞質。穏やかに混合するためにチューブを反転。過度の抽出物をピペットないでください。
    3. 氷の上エキスを維持し、最良の結果を得るための準備の3時間以内にそれを使用しています。
(29から適応)脱膜化アフリカツメガエルの精子の_title "> 2。準備

注意:ここで紹介する手順ボリュームは、最大8精巣のためのものです。

  1. 4℃と室温に戻しから0.05%ベンゾカイン(10%ベンゾカイン株式エタノール中で調製し、カエルの水槽の水で0.05%に希釈した)を削除します。男性のXを麻酔し、犠牲30分- 20室温でベンゾカイン溶液中のカエルをアフリカツメガエル 。胸の部分を調べると感じることで、機械的刺激に対する応答の欠如によって、および/または断頭により心拍が存在しないことによって死を確認してください。
  2. 腹部に沿ってU字型の切開を行います。黄色の脂肪体のtubulated質量を削除します。腎臓の上部には、長さが29で約1cmの楕円形の淡いピンクの塊である精巣を、探します。精巣を切除し、血液および他の組織を除去するために吸い取り紙の上にそれらをロールバックします。
  3. バッファー1mlで睾丸をミンチする嵌合した乳棒バッファT.使用中の精巣を洗います均質になるまで1.5mlチューブ中のT(10ストローク以上)。遠心分離機5 - ミニ遠心機で10秒、組織の大部分を除去し、上清を集めます。もう一度遠心分離を繰り返し、上清を収集します。
  4. 15ミリリットルのプラスチック管に精子を含む溶液を移します。精子をペレット化し、16℃で10分間、1411×gでバッファT.遠心分離で2ミリリットルの合計容量を増やしてください。
  5. 上清を除去し、16℃で10分間1411×gでバッファT.遠心分離機500μlのペレットを再懸濁。体細胞および赤血球のペレットをきれいにするために、必要に応じて一度か二度、この手順を繰り返します。
  6. 5分間、室温で100μlのBuffer Tと300μlのBuffer S.インキュベートでペレットを再懸濁。
    注:Buffer Sはdemembranationを担当してリゾレシチンを、含まれています。
  7. バッファR(使用前に新たに調製)の3つのボリュームが追加。正確に一度チューブを反転。 16で15分間1411×gで遠心分離° C。
  8. 400μlのBuffer Rでペレットを再懸濁した後、16℃で15分間1411×gでバッファR.遠心分離機の追加の2ミリリットルを追加します。
  9. 50μlのBuffer Tにペレットを再懸濁
  10. 血球計数器にこの希釈液を適用する9μlのBuffer Tと1μlの脱膜化精子核を希釈します。一つの大きな4×4のグリッドに薄いS字状の精子核の数をカウントし、1μl当たりの精子核の株式の濃度を得るために、100でその数を掛けます。
  11. 200xの株式で、その結果、バッファTとのμlの10万の精子核に株式を希釈します。 5μlのアリコート - 3を準備します。 -80℃で液体窒素とストア内のFlash凍結。

3.原子力アセンブリ

  1. 〜最終濃度(1.5μlの35.5 mMのシクロヘキシミド(最終濃度〜0.5 mM)の、6μlの20倍のカルシウムストック溶液(最終濃度〜0.6 mM)の、0.7μlの200倍の精子と卵抽出物の100μlのサプリメント700精子核/μl)を。反応容量をスケールアップまたはダウンし、必要に応じて。反転または穏やかに混合するためにタップします。
    注:Extractは、核アセンブリのためのより堅牢で信頼性の高いプラットフォームを提供して間期に中期から再投入。
  2. 90分間20℃ - 16の水浴中でインキュベートします。核は抽出液中に懸濁したまま確実にするために穏やかに15分ごとにタップして混ぜます。
  3. 次のようにスカッシュを調製することにより、45分で核アセンブリの進行状況を監視します。
    1. ピペットで2ガラススライド上に抽出μlの2μlの核の修正を追加します。
    2. 22ミリメートル2カバーガラスでオーバーレイ。 100X目的とDAPIフィルター - 水、油、または空気20を使用して、落射蛍光顕微鏡の画像。
      注:核は、明視野イメージングにより可視化しますが、蛍光によって視覚化する方がはるかに簡単であることができます。
    3. -80℃で液体窒素とストア内直ちに核またはフラッシュ凍結アリコートを使用してください。
      注:核PRに4%グリセロールを追加凍結へのIORは、その整合性を維持するのに役立ちます。冷凍核ただし凍結プロセスが中断またはそれ以上の構造的に脆弱な核につながることができ、まだ一般的に生存可能であり、核内移行が可能です。核を凍結後の年まで使用することができます。

Xの4.準備ツメガエル胚エキス

  1. 女性のX.を誘導1.1と1.2で説明したように卵を産むためにカエルをアフリカツメガエル
  2. 男性Xから精巣を隔離2.2に記載されているようにカエルをアフリカツメガエル 。ガラス35×10ミリメートルペトリ皿にペニシリンおよびストレプトマイシンの50 IU / mlのを補充したL15培地で精巣を水没。 2週間まで4℃で保管してください。
  3. 収集し、卵を受精。
    1. ガラス再利用可能なペトリ皿の上にカエルを保持することによってたての卵を収集し、腰排出腔の近くに穏やかな圧力を適用することにより、産卵を促進します。肥大化した腹部とREQにつながる、傷害をもたらすことができますあまりにもハードカエルを絞ります安楽死29を uiring。
    2. おおよそ45°の角度で皿を支える、卵は、皿の縁に集まるすべての余分なバッファを削除して、やっと卵をカバーするのに十分な1/3×MMRを追加することができます。コレクションの15分以内に卵を受精。
    3. バースの生理食塩水(高ソルトMBS)変形高い塩の500μlの1.5ミリリットルチューブに精巣の1/4を柔らかくし、均質化するためにしっかりと取り付けられて乳棒を使用してください。その後、1/3×MMRで卵を洪水、20分 - 卵に離解精巣を追加し、15室温で起こると受精を可能にします。
      注:精巣の有効性は、貯蔵時間と共に減少する、複数の週間保存された精巣を使用する場合、したがって、より精巣組織が成功した受精のために必要とされ得ます。
    4. その動物極を上に向けて暗い色素性の動物極の収縮をチェックすることによって胚の回転によって受精を確認し、通常は約20から30分粉砕した精巣を加えた後、秒。最初のセルの切断は90分以内に起こることを期待しています。
    5. 彼らは急速に隣接胚に死を誘導するように、溶解し、熱心に死んだ(白とふくらんまたは卵黄と顔料の偏在)削除広口ガラスピペットを用いて、または未受精卵は( すなわち 、切断されません)。
    6. 1からどこでも - 2.5時間後に受精、dejelly 2における胚 - 3%システインは1/3のx MMRに溶解し、10 N KOHでpHを7.9に調整しました。 4分 - 各3二つのバッファの変更を行います。システインの全ての痕跡を除去するために、1/3×MMRの10の簡単な変更 - 徹底的6で胚を洗浄します。
      注:Dejellied胚は卵黄膜を持っているとdejellied卵ほど脆弱ではありません。
  4. 広口ガラスピペットを用いて、新鮮な1/3×MMRを含むペトリ皿に健康受精( すなわち、切断された)胚を転送し、遅い開発が好まれている場合、それらは、室温で所望の段階に開発したりすることができ、16°C。死んで除去するために、継続するか、LYsedの胚は、1部または白ふくらん外観の欠如によって示されます。
  5. 原口のほぼ完全な閉鎖をチェックすることにより、参照材料24で利用可能な段階的な胚の図面を比較することによって、胚の段階を確認してください。
    注:16°Cは、ステージ11.5に到達するで胚を培養 - 約12時間で12を。
  6. ステージをインキュベート11.5 - 新鮮な1/3×MMRで12胚は、後期中間期に胚を逮捕するために、RTで1時間0.5 mMのシクロヘキシミドを補充しました。
  7. 広い口径のガラスやプラスチックピペット15(好ましくは30以上)の最小のマイクロ遠心チューブに相間、逮捕された胚に移します。
    注:15胚抽出物の約20μLを生成するのに十分です。必要に応じてスケールアップ。
  8. LPCの株式の1μlのを補った1ミリリットル卵溶解緩衝液(ELB)を追加します。静かに、胚を洗浄した胚は、チューブの底に落としておくことができ、および緩衝液を除去するために反転します。この洗浄工程をさらに2回繰り返します。</李>
  9. ELB500μlのプラスLPCの株式の0.5μlを、19.7 mMのシクロヘキシミドを5μl、およびDサイトカラシン35.5 mMの5μlの再懸濁の胚は(アクチン重合を阻害します)。卓上微量で1分間、200×gで遠心分離します。
  10. 余分なバッファを削除し、徹底的に胚を粉砕する乳棒を使用しています。万XGと16℃で10分間、スイングバケットローターで遠心分離。
  11. 200μlのピペットチップで上から脂質層を穿刺。クリーン200μlのピペットチップを使用すると、適切なサイズのチューブに真ん中の細胞質琥珀色の層を除去します。
  12. 50倍のエネルギーミックスの体積は(ATP再生システムを提供すること)1/50と補足胚芽抽出液、1/100 35.5ミリモルのシクロヘキシミド、Dサイトカラシン19.7ミリモルの1/500量、1 /千のボリュームのボリュームLPC株。
  13. 抽出物中の内因性の胚の核を可視化するために3.3で説明したようにスカッシュを準備します。
    注:胚抽出物で凍結することができますこの時点で内因性の核。アリコートを-80℃で凍結/融解サイクルおよびストアを減少させます。
  14. 1/50 50倍のエネルギーミックスのボリューム、100分の1を含むELBの等量の抽出物を希釈し、胚抽出物から核を除去するために35.5ミリモルのシクロヘキシミドのボリューム、1/500 Dカラシン19.7ミリモルの量、および1 /千LPC株式のボリューム。 16℃で15分間、17000×gで、スイングバケットローターで遠心分離。
  15. 一番上に残っている脂質に注意しながら、上清を収集します。チューブの底にペレット化した核を邪魔しないでください。 3.3で説明したように、ほとんどの核が除去されていることを確認するためにスカッシュを準備します。 -80℃で新鮮な抽出物又はアリコートとストアを使用してください。
  16. サーマルサイクラーを用いて56℃で30分間抽出物の100μlアリコート - 対照実験、熱30用胚芽抽出物を熱不活性化するには。熱不活性化抽出物は使用前に室温に戻してください。
アッセイおよび免疫蛍光を縮小_title "> 5。原子力

  1. 1.5mlチューブに1ミリリットルELBで事前に組み立て核150μlの - 25を希釈することにより卵抽出物で組み立て核を分離します。卓上微量で4℃で3分間、1600×gで遠心分離します。チューブの底に核の壊れやすいペレットを乱さないように注意しながら、バッファを削除してください。
  2. 5.1で使用される卵抽出物の元の体積に等しい胚芽抽出物の量に核を再懸濁します。必要に応じて使用ELBまたは制御反応のための熱不活性化抽出物。
  3. 静かにペレットを破壊し、核を再懸濁するためにチューブをタップします。 30分 - 優しくごとに15を混合するためにチューブをタップし、室温で90分間インキュベートします。注:核収縮のほとんどは、最初の30分以内に起こります。
  4. スカッシュを調製することにより、核収縮の進行状況を監視します。
    1. ピペットで2ガラススライド上に抽出μlの2μlの核の修正を追加します。
    2. 22ミリメートル2とオーバーレイ
  5. 直前ELB、15%グリセロール、2.6%のパラホルムアルデヒドからなる固定液の500μLを加えることに核を再懸濁するためにチューブをタップします。すぐに反転し、室温で15分間回転体にチューブを配置します。
  6. 丸底プラスチックインサート(デザインや要望に応じて利用できる回路図)で15ミリリットルを丸底ガラス管を艤装することによりスピンダウンチューブを準備します。核クッション緩衝液5mlを追加します。それはプラスチックインサートの上に平ら確認している、チューブに12ミリメートルの円形カバースリップを削除します。
  7. 穏やかワイドボアピペットチップを用いた核クッションの上部に固定された核を含有する溶液を層。千XGと16℃で15分間、スイングバケットローターで遠心分離。
  8. バッファのすべてを削除し、管の頂部にプラスチック製のインサートを引っ張って吸引器を使用します。カバーの側面に注目することは注意して、微細なピ​​ンセットでカバースリップを削除します核がスピンしたその上にスリップ。冷メタノールでポストフィックスを室温で5分間(-20℃で保存します)。
  9. 大規模なプラスチック製のペトリ皿の内側を覆うプラスチック製のパラフィンフィルムのシート上にカバースリップ核側を転送します。脱水を防ぐために、皿の側面に沿って湿った使い捨てワイプを置きます。
  10. 10秒 - 5の後PBS-NP40を500μl(1×PBSプラス0.1%NP40)と吸引でカバースリップ上で核を再水和。
  11. 慎重にカバースリップ上にPBS-3%ウシ血清アルブミン(BSA)75μlのレイヤ。室温または一晩4℃で1時間をブロックすることができます。
  12. ブロッキング溶液を外し、一次抗体とインキュベート( 例えば、核膜孔複合体、1に対するmAb414:1,000)、室温または4℃で一晩1時間PBS-3%BSAで希釈しました。 PBS-NP40の5即時変更で洗います。
  13. 室温で1時間、PBS-3%BSAで希釈した二次抗体と共にインキュベートします。 PBS-NP40の5即時変更で洗います。
  14. インキュベート室温で5分間、PBS-3%BSAで希釈した10 / mlのヘキスト有します。 PBS-NP40で5回洗浄します。すべての余分なバッファを削除してください。
  15. 5μlの退色防止封入剤でスライド上にカバースリップをマウントします。明確なマニキュアで密封します。後でイメージングのために4℃で100×目標や店 - すぐに20と落射蛍光顕微鏡を用いた画像。
    注意:以前に23を説明したように定量化を行います。

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Representative Results

卵抽出物中の核の組立

このプロトコルの最初のステップは、Xを準備していますツメガエルの卵抽出物(プロトコル1)および脱膜化精子核(プロトコル2)。これらの試薬 ​​は、その後、核デノボ (プロトコル3)を構築するために使用されている。1は、いくつか代表的なデータを示しています。カルシウムの添加は、間期に減数分裂逮捕卵抽出物を駆動し、シクロヘキシミドは間期で逮捕された抽出物を保持します。 30で - 反応開始後45分で、最初は薄いS字型の精子核はスラグ状のクロマチン塊に厚くを開始する必要があります。無傷の核エンベロープの成功した形成は、GST-GFP-NLS(データは示していない)、またはFGリピートを認識するmAb414を用いた核膜孔複合体のためのリム染色などによる蛍光標識された輸入貨物の輸入及び保持によって評価することができますcontai寧ヌクレオポリン( 図1A)。核アセンブリが発生した後、核の形状がより丸くなるべきと核エンベロープが拡大し、核タンパク質が( 図1B-C)インポートされる核体積が増加するはずです。無傷の核エンベロープまたは核成長の形成に従わない場合には、品質の悪い卵抽出物を示しています。この場合には、卵の新たなバッチで再起動するのが最善の方法です。

胚芽抽出からの内因性核の除去
次のステップでは、後期胚抽出物(プロトコル4)を調製することです。最初の抽出物の調製及び前核の除去後は、抽出物の少量のヘキスト染色スカッシュを準備するのが最善です。多くの小さな胚の核の可視化は、抽出物( 図2A)を製造するのに成功したの良好な指標です。内因性の胚の核は、下流analysiに干渉することができますようにSは、希釈し、遠心分離によって核を除去した後、抽出物のアリコートを確認することも重要です。最初のスカッシュと比較すると、非常に少数の核は、抽出物( 2B)にしておく必要があります。現在、多くの核がまだある場合は、遠心分離の第二ラウンドが必要となります。

原子力縮小アッセイ
図3は、核の縮小アッセイ(プロトコル5)のための代表的な結果を示しています。後期胚抽出液中に再懸濁卵抽出物核は時間( 図3B)の上に小さくなります。アッセイのための良好なネガティブコントロールは熱が不活性化された胚芽抽出物( 図3A)で核をインキュベートすることです。核は熱不活性化エキスに収縮しないように、これは、未処理の胚抽出物で縮小核は浸透圧効果の結果ではありません観察いくつかの信頼性を提供します。核の大きさの程度観察された減少は、卵抽出物核の特定のバッチだけでなく、胚抽出物の品質に依存して変化します。我々の経験では、核の縮小は、常にしかし、別の核でこれらの実験を複数回繰り返すことが重要であり、アッセイの固有の変動に対処するために抽出し、( 例えば、40種類以上の胚抽出物において)が観察される。4図は概略図を示していますプロトコル全体の。

図1
X. 1.原子力組立時間コース ツメガエル 卵抽出。核はX新たに組み立てました核膜孔複合体(NPC)(mAb414)でに対する抗体を用いた免疫蛍光法により、同じ反応からの3アリコートを固定して可視化した議定書に記載されているように卵抽出物をアフリカツメガエル > A)30分、B)60分、及びC)の核アセンブリの開始後90分。免疫プロトコルは、スケールバーは25μmである。プロトコル5に記載されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
X から核の 図2. 取り外し 胚芽抽出を アフリカツメガエル 。X. A)は、従来の遠心分離によって核を除去した後の核の除去、及びB)に:プロトコル4に記載の抽出物の少量のアリコートを固定し、ヘキストで染色した12胚- ツメガエル胚抽出物は、ステージから11.5を調製しました。スケールバーは25μmです。オム/ファイル/ ftp_upload / 54173 / 54173fig2large.jpg "ターゲット=" _空白"> この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3. 代表的なデータ原子力縮小アッセイから。核はX新たに組み立てました組換えGFP-LB3を補っツメガエルの卵抽出物は、(核ラミナを可視化します)。内因性の胚の核が除去された12胚芽抽出 - プロトコル5で説明したように、卵抽出物の核を段階で11.5を単離し、そして再懸濁しました。ライブタイムラプスイメージングは​​、90分間、30秒間隔で行いました。 A)後期胚抽出物(LEE)、およびB)熱不活性化(HI)胚芽抽出物:図パネルは中でインキュベートし、核のための6分間隔で取得された画像を示します。時間のコースからの画像を続行します左から右から。スケールバーは25μmである。C)核は46の異なる卵と胚抽出物からのデータを縮小します。バーは> 240の核のための手段を示しています。エラーバーは標準偏差である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
原子力収縮アッセイの 図4 の回路図は、各色付きのボックスには、1プロトコルを表します。赤はXの準備を示していますツメガエルの卵抽出物(プロトコル1)。ブルーは、脱膜化Xの準備を示していますラエビスの精子(プロトコル2)。ピンク卵抽出物(プロトコル3)にデノボ核アセンブリを示しています。グリーンはXの準備を示していますツメガエル胚抽出物(プロトコル4)。紫は、核のを示していますhrinkingアッセイプロトコルおよび免疫蛍光(プロトコル5)。この図の一部は、23から再利用されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

バッファ名 緩衝液組成
マルクの改変リンガー(MMR)、1/3倍 33のNaCl、0.7のKCl、0.3mMのMgSO 4を、0.7 mMのCaCl 2を、1.7 mMのHEPES、pHが7.4
抽出バッファー(XB)、10× 1 MのKCl、1mMのCaCl 2を、10mMのMgCl 2を、500mMのスクロース、100mMのHEPES、pHを7.8(pHを10 N KOHで調整し、4℃で保存)
緩衝液B システインは冷たいのddH 2 Oを用いて調製0.8倍のXB(、pHがaで4%を溶かし10 N NaOHで7.8にdjusted)
緩衝液C 風邪のddH 2 Oの900ミリリットルで10倍XBの100メートルを混ぜます
緩衝液D バッファCプラス5mMのEGTAおよび800μMのMgCl 2
LPC株、1,000倍 10 mg / mlでロイペプチン、ペプスタチン、およびDMSOに溶解したキモスタチンの各々は、(-20℃でアリコートで保存します)
緩衝液E 100 mlのBuffer Dプラス100μlのLPCの株式
エネルギーミックス、50倍 190 mMのクレアチンリン酸二ナトリウム、25mMのATP二ナトリウム塩、25mMの塩化マグネシウム
バッファT 15mMのパイプ、15ミリモルのNaCl、5mMのEDTA、7ミリモルのMgCl 2、80mMのKClを、0.2Mのスクロース、pH7.4の(フィルタを滅菌し、4℃で保存)
バッファS マルトースを20mMおよびバッファTで製造したリゾレシチン0.05%
バッファR バッファTプラス3%のウシ血清アルブミン
カルシウム原液、20倍 10mMのCaCl 2を、0.1 MのKCl、1mMのMgCl 2(-20℃で保存)
核修正 125μlの2 Mショ糖、12.5μlの1 M HEPES pHは7.9、250μlの37%ホルムアルデヒド、112μlののddH 2 O、0.5μlの10 mg / mlとヘキスト(2週間まで室温で保存)
修正されたバースの生理食塩水(MBS)、10倍 880のNaCl、10mMの塩化カリウム、50mMのHEPES、25mMのNaHCO 3を、pHが7.8
ハイソルトMBS 1×MBSプラス0.7 mMのCaCl 2を、20 mMのNaClを
卵溶解緩衝液、ELB 250mMのスクロース、50mMの塩化カリウム、2.5のMgCl 2、10mMのHEPES、pHは7.8
核クッションバッファ 1X XB、0.2 Mスクロース、25%グリセロール(濾過滅菌し、4℃で保存)

表1バッファ・ページをther.within。このプロトコルに記載されたすべてのバッファの組成物は、この表に記載されています。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG Molecular Probes A10037
ATP disodium salt Sigma Aldrich A2383
Benzocaine Sigma Aldrich E1501
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059
CaCl2 Sigma Aldrich C3306
Centrifuge Beckman J2-21M
Centrifuge rotor Beckman JS 13.1
chymostatin Sigma Aldrich C7268
creatine phosphate disodium Calbiochem 2380
cycloheximide Sigma Aldrich C6255
cytochalasin D Sigma Aldrich C8273
disposable wipes (kimwipes) Sigma Aldrich Z188956
L-cysteine Sigma Aldrich W326306
EGTA Sigma Aldrich E4378
Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
Glass crystallizing dish (150 x 75 mm) VWR 89090-662
Glycerol Macron 5094-16
HEPES Sigma Aldrich H4034
Hoechst - bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma Aldrich B2261
HCG - Human Chorionic Gonadotropin  Prospec hor-250-c
L15 Media Sigma Aldrich L4386
leupeptin Sigma Aldrich L2884
Lysolecithin Sigma Aldrich L1381
mAb414 Abcam ab24609
MgCl2 EMD MX0045-2
MgSO4 Sigma Aldrich M9397
Maltose Sigma Aldrich M5885
NP40 BDH 56009
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin + Streptomycin Sigma Aldrich Pp0781
pepstatin Sigma Aldrich P5318
PIPES Sigma Aldrich P6757
Plastic paraffin film (parafilm) Sigma Aldrich P7793
KCl Sigma Aldrich P9541
KH2PO4 Mallinckrodt 70100
KOH Baker 5 3140
PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin Prospec hor-272-a
NaCl Sigma Aldrich S3014
NaHCO3 Fisher BP328
Na2HPO4 EMD SX0720-1
NaOH EMD SX0590
Pestle Thomas Scientific 3411D56
Round bottom glass tubes, 15 ml Corex 8441
Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) ThermoFisher A10037
sucrose Calbiochem 8550
thermal cycler Bio-Rad T100
Ultracentrifuge Beckman L8-80M
Ultracentrifuge rotor Beckman SW 50.1
Vectashield (anti-fade mounting medium) Vector H-1000

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