Een celvrij Assay met behulp van

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Edens, L. J., Levy, D. L. A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation. J. Vis. Exp. (114), e54173, doi:10.3791/54173 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Een fundamentele vraag in de celbiologie is hoe cel en organel maten worden gereguleerd. Het is al lang bekend dat de grootte van de kern algemeen schalen met de grootte van de cel, met name tijdens embryogenese als dramatische daling van zowel cellen en nucleaire grootte voorkomen. Mechanismen van grootte regelgeving nucleaire zijn grotendeels onbekend en kunnen kanker relevant zijn waar veranderde nucleaire grootte is een belangrijke diagnostische en prognostische parameter. In vivo zal het identificeren van nucleaire grootte toezichthouders worden bemoeilijkt door de essentiële en complexe aard van de nucleaire functie. De in vitro benadering beschreven afmetingen control nucleaire studie maakt gebruik van de normale verlaging kerngrootte die tijdens Xenopus laevis ontwikkeling. Eerst worden kernen geassembleerd in X. laevis ei extract. Vervolgens worden deze kernen geïsoleerd en opnieuw gesuspendeerd in cytoplasma van embryo laat stadium. Na 30-90 min incubatieperiode nucleaire oppervlaktegebieddaalt met 20-60%, waardoor een bruikbare test om cytoplasmatische componenten aanwezig zijn in een vergevorderd stadium embryo's die bijdragen aan de ontwikkeling van nucleaire grootte schalen te identificeren. Een belangrijk voordeel van deze aanpak is het relatieve gemak waarmee de eieren en embryo-extracten biochemisch kan worden gemanipuleerd, waardoor de identificatie van nieuwe eiwitten en activiteiten die kerngrootte regelen. Zoals bij elke in vitro benadering van validatie resulteert in een in vivo systeem belangrijk is en micro-injectie van X. laevis embryo's is bijzonder geschikt voor deze studies.

Introduction

De afmetingen van cellulaire organellen typisch schalen met de grootte van de cel, en dit is wellicht het best beschreven voor de schaal van nucleaire grootte met celgrootte 1-10. Dit geldt met name tijdens embryogenese en celdifferentiatie bij dramatische vermindering van zowel de cel kerngrootte vaak waargenomen 11,12. Bovendien veranderde kerngrootte is een belangrijke parameter voor kanker diagnose en prognose 13-17. Mechanismen die bijdragen tot de grootte regelgeving nucleaire zijn grotendeels onbekend, voor een deel te wijten aan de complexiteit en de essentiële aard van de nucleaire structuur en functie. De hier beschreven methode werd ontwikkeld als een in vitro assay voor kerngrootte schalen die vatbaar is voor biochemische manipulatie en opheldering van mechanismen van regulatie nucleaire grootte.

Xenopus laevis ei extract is een goed opgezet systeem te herhalen en te studeren complexe cellulaire processen in een in vitro 18-22 geopenbaard. Een belangrijk voordeel van het extractiesysteem dat X. laevis ei extracten geven een nagenoeg onverdund cytoplasma waarvan de samenstelling is makkelijk te veranderen, bijvoorbeeld door toevoeging van recombinante eiwitten of immunodepletie. Verder is men in staat om essentiële processen te manipuleren door gebruik behandelingen die anderszins letale in een in vivo context. Wijzigingen van het ei extract procedure mogelijk maken voor de isolatie van uittreksels uit X. laevis embryo's in plaats van eieren, en deze embryo-extracten zijn even vatbaar voor biochemische manipulatie 23. Tijdens X. laevis ontwikkeling, de eencellige bevruchte embryo (~ 1 mm diameter) ondergaat een reeks van twaalf snelle celdelingen (stappen 1-8) genereren duizenden 50 μm diameter en kleinere cellen, het bereiken van een ontwikkelingsstadium aangeduid als de midblastula overgang (MBT) of stadium 24-26 augustus. De MBT wordt gekenmerkt door het begin van zygote transcriptie, celmigratie, asynchrone celdelingen, verwerving van gap fasen en vaststelling van nucleaire steady-state en zijn geen continue nucleaire expansie zoals in de pre-MBT embryo. Van stap 4 tot gastrulatie (stadia 10,5-12), het volume van individuele kernen daalt met meer dan 10-voudig 11.

Hier is het doel om mechanismen die aan deze verlaging van nucleaire grootte tijdens ontwikkeling progressie identificeren. De aanpak is om eerst te assembleren kernen in X. laevis ei extract en die kernen uit het ei cytoplasma / extract te isoleren. Deze kernen worden vervolgens opnieuw gesuspendeerd in cytoplasma van eind gastrulastadium embryo's. Na een incubatieperiode, de kernen van ei extract kleiner worden in een vergevorderd stadium embryo extract. We redeneerden dat deze would een nuttige test voor het identificeren van cytoplasmatische componenten die aanwezig zijn in een vergevorderd stadium embryo's die bijdragen aan de ontwikkeling van nucleaire grootte schalen zijn. Gebruik van deze assay, in combinatie met in vivo validatie we aangetoond dat proteïne kinase C (PKC) draagt ​​ontwikkelingsstoornissen verlaging kerngrootte in X. laevis 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle Xenopus procedures en studies werden uitgevoerd in overeenstemming met de NRC Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren 8ste editie. Protocollen werden goedgekeurd door de Universiteit van Wyoming Institutional Animal Care en gebruik Comite (Assurance # A-3216-01).

1. Bereiding van X. laevis Egg Extract (aangepast van 27,28)

  1. Prime vrouwelijke X. laevis kikkers minimaal drie dagen en ten hoogste twee weken voor eierverzameling met een enkele 100 IE injectie van drachtige merrie serum gonadotropine (PMSG).
  2. Een dag voor het experiment, injecteren gegronde kikkers met 800 IE humaan choriongonadotrofine (HCG) en plaats bij 16 ° C in 1 liter per kikker van 1 / 3x Marc's gemodificeerde Ringers (MMR). Zie tabel 1 voor buffer samenstellingen.
    Opmerking: Sommige kikkers zal geen eieren leggen of zal leggen slechte kwaliteit eieren. Typisch 2-3 kikkers geïnjecteerd ten minste een kikker zal sufficien leggen waarborgent aantallen van goede kwaliteit eieren. De gemiddelde kikker zal leggen genoeg eieren om ten minste 1 ml ei extract te produceren.
  3. Bereid 1 L 1 / 3x MMR met koud gedestilleerd gedemineraliseerd water (DDH 2 O), 500 ml buffer B, 1 L buffer C, 500 ml buffer D, en 100 ml buffer E.
  4. Transfer eieren gelegd om een ​​glas kristalliserende schotel (150 x 75 mm). Met behulp van een plastic Pasteur pipet met de punt afgesneden, boerderij uit witte gezwollen geactiveerd eieren of gelyseerd eieren. Alleen behouden eieren met duidelijke en gelijke donkere dier palen en witte plantaardige polen.
  5. Bereid 13 x 51 mm centrifugebuisjes met 1 ml buffer E gesupplementeerd met 355 uM cytochalasine D toegevoegd juist voor gebruik in stap 1,7.
  6. Dejelly en was de eieren.
    1. Wassen eieren kort met koud 1 / 3x MMR in een geschikt formaat beker, het veranderen van de buffer 3-4 keer.
    2. Verwijder de gelei jassen uit de eieren door incubatie met Buffer B. Dit zal overal 3-10 min. Zoals de bewolkte gelei jassen zijn vrijgelaten uit het eis, veranderen de buffer.
      Opmerking: Dejellying is voltooid wanneer de eieren stevig verpakt weergegeven in de hoek van het schaaltje gekanteld en plantaardig polen neerwaarts georiënteerd. Eieren zijn veel kwetsbaarder na dejellying, dus geen eieren met buffer B broeden langer dan nodig en de daaropvolgende wast moet zeer zorgvuldig worden uitgevoerd.
    3. Was de eieren kort met 3-4 veranderingen van Buffer C.
    4. Was de eieren kort met 2 veranderingen van Buffer D.
    5. Was de eieren kort met 2 veranderingen van Buffer E.
  7. Vul centrifugebuizen met eieren met behulp van een breed boring glazen pipet of plastic druppelaar. Aspireren overtollige buffer. De eieren verpakken en verwijder zoveel buffer mogelijk centrifuge swinging bucket rotor bij 212 xg gedurende 60 seconden en vervolgens bij 478 g gedurende 30 sec. Aspireren overtollige buffer.
    Opmerking: Het is belangrijk om zoveel overtollige buffer mogelijk te verwijderen bij deze stap te zorgen voor ei extract nagenoeg pure.
  8. In een swingende bucket rotor ultracentrifuge onder vacuüm gedurende 15 min bij 12.000 xg en 4 ° C om eieren breken open en scheiden in aparte lagen, met het cytoplasma wordt het oranje-gekleurde laag in het midden. Verwijder centrifuge buizen en plaats onmiddellijk op ijs.
  9. Vang het extract.
    1. Met behulp van een 18 gauge naald en spuit, doorboren de centrifugebuis net boven het donker gepigmenteerde laag op de bodem van de buis en verwijder het midden amberkleurige cytoplasmatische laag. Voer een van de top lipidelaag verzamelen. Verzamel het cytoplasma in een geschikt formaat buis.
      Let op: In het algemeen, 1 kikker produceert ten minste 1 ml extract.
    2. Supplement cytoplasma met 1/1000 het volume van 19,7 mM cytochalasine D, 1/1000 de hoeveelheid LPC voorraad en 1/50 volume van 50x energiemix. Keer de buis te mengen. Niet overdreven pipet het extract.
    3. Houd het extract op ijs en gebruik het binnen 3 uur van de voorbereiding voor het beste resultaat.
_title "> 2. Voorbereiding van Demembranated X. laevis Sperma (aangepast van 29)

Opmerking: De procedure volumes hier gepresenteerde zijn voor maximaal 8 testes.

  1. Verwijder 0,05% benzocaïne (10% benzocaïne stock bereid in ethanol en verdund tot 0,05% in kikker tankwater) van 4 ° C en opwarmen tot kamertemperatuur. Verdoven en te offeren mannelijke X. laevis kikkers benzocaïne oplossing bij kamertemperatuur gedurende 20 - 30 min. Verzekeren dood door geen hartslag via onderzoek en gevoel van de borst, door gebrek aan respons op mechanische stimulering, en / of door onthoofding.
  2. Een U-vormige insnijding aan de buik. Verwijder de tubulated massa van gele vetten lichamen. Bovenaan de nieren, zoekt de testes, die ovaalvormige lichtroze massa ongeveer 1 cm lang 29 zijn. Accijnzen de testes en rol ze op vloeipapier om bloed en ander weefsel te verwijderen.
  3. Was de testikels in Buffer T. Gebruik een nauwsluitende stamper om testes met 1 ml buffer gehaktT in een 1,5 ml buis tot homogene toestand (10 beroertes of meer). Centrifuge 5-10 seconden in een mini centrifuge en de bovenstaande vloeistof, het verwijderen van grote stukken weefsel. Centrifugeer nogmaals weer en verzamel de bovenstaande vloeistof.
  4. Breng de sperma bevattende oplossing een 15 ml plastic buis. Verhoog het volume tot een totaal van 2 ml met buffer T. Centrifugeer bij 1411 xg gedurende 10 min bij 16 ° C om het sperma pellet.
  5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 pl buffer T. Centrifugeer bij 1411 xg gedurende 10 min bij 16 ° C. Herhaal deze stap of twee keer als nodig is om de pellet somatische en rode bloedcellen te reinigen.
  6. Resuspendeer de pellet in 100 pl buffer T en 300 pl Buffer S. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
    Opmerking: Buffer S bevat lysolecithine, dat verantwoordelijk is voor demembranation.
  7. Voeg drie volumes buffer R (vers bereid voor gebruik). Omkeren buis precies één keer. Centrifugeer bij 1411 xg gedurende 15 min bij 16 &# 176; C.
  8. Resuspendeer de pellet in 400 pl Buffer R en voeg nog eens 2 ml buffer R. Centrifugeer bij 1411 xg gedurende 15 min bij 16 ° C.
  9. Resuspendeer de pellet in 50 gl buffer T.
  10. Verdun 1 pi demembranated sperma kernen met 9 ul buffer T. Breng deze verdunning een hemocytometer. Tel het aantal dunne S-vormige spermakernen in een grote 4 x 4 raster en vermenigvuldig dat getal met 100 om de concentratie van het bestand verkrijgen spermakernen per pl.
  11. Verdun de voorraad tot 100.000 sperma kernen per il met buffer T, wat resulteert in een 200x voorraad. Bereid 3-5 ul aliquots. Flash bevriezen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C.

3. Nucleaire Assembly

  1. Supplement 100 ui ei extract met 1,5 gl 35,5 mM cycloheximide (eindconcentratie ~ 0,5 mM), 6 pl 20x calciumvoorraadoplossing (eindconcentratie ~ 0,6 mM) en 0,7 pl 200x zaadcellen (eindconcentratie ~ 700spermakernen / ul). Schaal de reactie volume omhoog of omlaag als dat nodig is. Omkeren of tik voorzichtig te mengen.
    Opmerking: Extract gefietst van metafase naar interfase zorgt voor een meer robuust en betrouwbaar platform voor nucleaire montage.
  2. Incubeer in een waterbad bij 16 - 20 ° C gedurende 90 min. Meng door zachtjes te tikken om de 15 minuten om ervoor te zorgen kernen blijven in het extract opgeschort.
  3. De voortgang van de nucleaire combinatie 45 min door het opstellen van een squash als volgt.
    1. Pipet 2 pi van het extract op een glasplaatje en voeg 2 pl nucleus fix.
    2. Bedekken met een 22 mm 2 dekglaasje. Beeld op een epifluorescentiemicroscoop met behulp van water, olie, of door de lucht 20 - 100X doelstellingen en een DAPI filter.
      Opmerking: De kernen kunnen worden gevisualiseerd door bright-field imaging, maar zijn veel gemakkelijker te visualiseren door middel van fluorescentie.
    3. Gebruik kernen direct of flash-freeze monsters in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C.
      Opmerking: Het toevoegen van 4% glycerol om de kernen prIOR bevriezing kunnen helpen om hun integriteit. Frozen kernen zijn over het algemeen nog steeds levensvatbaar is en in staat om nucleaire import, maar de bevriezing proces kan leiden tot een verstoorde of meer structureel kwetsbare kernen. Kernen tot een jaar na bevriezing kan worden gebruikt.

4. Voorbereiding van X. laevis Embryo Extract

  1. Induceren vrouwelijke X. laevis kikkers om eieren te leggen, zoals beschreven in 1.1 en 1.2.
  2. Isoleer testes van mannelijke X. laevis kikkers zoals beschreven in 2.2. Onderdompelen testes in L15 medium aangevuld met 50 IU / ml penicilline en streptomycine in een glazen 35 x 10 mm petrischaal. Bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal twee weken.
  3. Verzamelen en bevruchten eieren.
    1. Verzamel vers gelegde eieren door het houden van kikkers over een glas herbruikbare petrischaal en het bevorderen van het leggen van eieren door het toepassen van lichte druk op de onderrug in de buurt van de cloaca. Knijpen de kikker te hard kan leiden tot letsel, wat leidt tot een opgeblazen buik en requiring euthanasie 29.
    2. Prop het gerecht bij een geschatte hoek van 45 °, laat de eieren te verzamelen in de rand van de schotel, verwijder alle overtollige buffer, en voeg genoeg 1 / 3x MMR nauwelijks dekking van de eieren. Bevruchten eieren binnen 15 min van de collectie.
    3. Gebruik een strak ingerichte stamper om maceraat en homogeniseren 1/4 van een testis in een 1,5 ml buis met 500 ul van een hoog zoutgehalte gewijzigd Barth's zoutoplossing (High Salt MBS). Voeg gemacereerde testes de eieren en laat voor de bevruchting plaatsvindt bij kamertemperatuur gedurende 15 - 20 min, vervolgens overstroming eieren met 1 / 3x MMR.
      Noot: Effectiviteit van testes af met opslagduur, daardoor testes weefsel vereist voor succesvolle bevruchting bij gebruik testes die zijn opgeslagen gedurende meer dan één week.
    4. Bevestig bevruchting door te controleren op contractie van de donkere gepigmenteerde animale pool en door rotatie van de embryo's met hun dierlijke polen naar boven, gewoonlijk ongeveer 20 - 30 min na toevoeging van gemalen testes. Verwachten dat de eerste cel splitsing voor te komen binnen 90 min.
    5. Met behulp van een breed boring glazen pipet ijverig verwijderen dode (wit en gezwollen of ongelijke verdeling van de dooier en pigment), gelyseerd, of onbevruchte eieren (dat wil zeggen, niet gesplitst), omdat ze snel de dood in het naburige embryo's zal leiden.
    6. Anywhere 1-2,5 uur na de bevruchting, dejelly embryo's in 2-3% cysteïne opgelost in 1/3 x MMR en op pH 7,9 met 10 N KOH. Voer twee buffer veranderingen die elk 3-4 min. Grondig de embryo's met 6-10 korte veranderingen van 1 / 3x MMR om alle sporen van cysteïne te verwijderen.
      Opmerking: Dejellied embryo's hebben een vitelline membraan en zijn niet zo kwetsbaar is als dejellied eieren.
  4. Met een wijde boring glazen pipet gezonde bevruchte (dwz gesplitst) embryo een petrischaal met vers 1 / 3x MMR en laten ontwikkelen tot het gewenste stadium bij kamertemperatuur of, indien langzamere ontwikkeling voorkeur, 16 ° C. Doorgaan met dode of ly verwijderensed embryo's aangegeven door het ontbreken van de eerste divisie en witte gezwollen uiterlijk.
  5. Controleer het stadium van de embryo's door te controleren op nagenoeg volledige afsluiting van de blastopore en vergelijken met tekeningen van gefaseerde embryo in referentiematerialen 24.
    Let op: Embryo's gekweekt bij 16 ° C zal stadium te bereiken 11,5-12 in ongeveer 12 uur.
  6. Incubeer fase 11,5-12 embryo in vers 1 / 3x MMR aangevuld met 0,5 mM cycloheximide gedurende 1 uur bij KT, embryo's arrestatie eind interfase.
  7. Breng met wijde boring glas of plastic pipet minste 15 (bij voorkeur 30 of meer)-interfase aangehouden's naar een microcentrifugebuis.
    Opmerking: 15 embryo's kunnen dan ca. 20 ui extract. Opschalen als dat nodig is.
  8. Voeg 1 ml ei lysisbuffer (ELB), aangevuld met 1 pl van LPC voorraad. Voorzichtig omkeren om embryo's te wassen, laat embryo's vallen op de bodem van de buis, en verwijder de buffer. Herhaal deze wasstap twee keer. </ Li>
  9. Resuspendeer embryo's in 500 pi van ELB plus 0,5 ul van LPC voorraad, 5 pl 19,7 mM cycloheximide, en 5 ul van 35,5 mM cytochalasine D (tot actine polymerisatie te remmen). Centrifugeer bij 200 xg gedurende 1 min in een tafelmodel microcentrifuge.
  10. Verwijder overtollig buffer en gebruik een stamper grondig te verpletteren de embryo's. Centrifugeer in een swinging bucket rotor gedurende 10 min bij 10.000 xg en 16 ° C.
  11. Prik de lipide laag van de top met een 200 ul pipet tip. Met een schone 200 ul pipet tip, verwijder de middelste cytoplasma-oranje gekleurde laag om een ​​geschikt formaat buis.
  12. Supplement embryo extract met 1/50 volume van 50x energiemix (als ATP regeneratie systeem), 1/100 volume van 35,5 mM cyclohexamide, 1/500 volume van 19,7 mM cytochalasine D en 1/1000 van het volume LPC voorraad.
  13. Bereid een squash, zoals beschreven in 3,3 tot endogene embryonale kernen in het extract te visualiseren.
    Let op: Embryo extract kan worden ingevroren met de endogene kernen op dit punt. Hoeveelheid hiervan vries / dooicycli en opslag te verminderen bij -80 ° C.
  14. Kernen uit het embryo extract te verwijderen, het extract verdund met een gelijk volume van ELB met 1/50 volume van 50x energiemix 1/100 volume van 35,5 mM cyclohexamide, 1/500 volume van 19,7 mM cytochalasine D, en 1/1000 het volume van LPC voorraad. Centrifugeer in een swinging bucket rotor bij 17.000 xg gedurende 15 min bij 16 ° C.
  15. Verzamel de supernatant en voorzichtig om alle resterende lipiden aan de top te vermijden. Mis gepelleteerde kernen niet storen bij de bodem van de buis. Bereid een pompoen zoals beschreven in 3.3 opdat meeste kernen zijn verwijderd. Gebruik het extract vers of hoeveelheid en bewaar bij -80 ° C.
  16. Verwarmen inactiveren embryo-extract voor controle-experimenten, warmte 30-100 gl aliquots extract bij 56 ° C gedurende 30 min met behulp van een thermische cycler. Zodat de warmte geïnactiveerd extract op kamertemperatuur vóór gebruik.
_title "> 5. Nuclear Krimpende Assay en immunofluorescentie

  1. Isoleer kernen geassembleerd in ei extract door verdunning van 25-150 gl voorgemonteerde kernen in 1 ml ELB in een 1,5 ml buis. Centrifugeer bij 1600 xg gedurende 3 min bij 4 ° C in een tafelmodel microcentrifuge. Verwijderen buffer, let de fragiele kernen pellet te verstoren op de bodem van de buis.
  2. Resuspendeer kernen in een hoeveelheid embryo extract gelijk aan het oorspronkelijke volume van ei extract gebruikt 5,1. Gebruik ELB of warmte geïnactiveerd extract voor de controle reacties, voor zover van toepassing.
  3. Tik voorzichtig de buis te breken van de pellet en resuspendeer de kernen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 90 min voorzichtig de buis elke 15 mengen drukken - 30 min. Opmerking: De meeste nucleaire krimpen plaatsvindt binnen de eerste 30 min.
  4. De voortgang van de nucleaire krimpen door het opstellen van een squash.
    1. Pipet 2 pi van het extract op een glasplaatje en voeg 2 pl nucleus fix.
    2. Overlay met een 22 mm 2
  5. Raak de buis naar de kernen juist voor het toevoegen van 500 pi fixatief bestaande uit ELB, 15% glycerol en 2,6% paraformaldehyde mengen. Inverteer onmiddellijk en plaats de buis op een rotator gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Bereid spin down buizen door de afbouw van 15 ml ronde bodem glazen buizen met ronde bodem kunststof inzetstukken (ontwerp en schema's beschikbaar op aanvraag). Voeg 5 ml van de nucleaire kussen buffer. Laat een 12 mm ronde dekglaasje in de buis, waarbij zeker dat het vlak ligt op de top van de plastic insert.
  7. Voorzichtig laag de oplossing die vaste kernen bovenop de nucleaire kussen met een grote boring pipet tip. Centrifugeer in een swinging bucket rotor gedurende 15 min bij 1000 x g en 16 ° C.
  8. Gebruik een aspirator om alle buffer eruit te halen de kunststof insert naar de top van de buis. Verwijder de dekglaasje met een paar fijne tang, let daarbij goed op de zijkant van de begeleidende notaslip waarop de kernen werden afgedraaid. Post-fix in koude methanol (bewaard bij -20 ° C) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  9. Breng de dekglaasje kern kant naar boven op een vel plastic paraffine folie voering een grote plastic petrischaal. Plaats vochtige wegwerpdoekjes langs de kant van de schaal om uitdroging te voorkomen.
  10. Rehydrateren kernen op het dekglaasje met 500 pl PBS-NP40 (1x PBS plus 0,1% NP40) en zuig na 5-10 sec.
  11. laag zorgvuldig 75 pl PBS-3% runderserumalbumine (BSA) op het dekglaasje. Laat 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C geblokkeerd.
  12. Verwijderen blokkeeroplossing en incubeer met primair antilichaam (bijvoorbeeld mAb414 tegen de nucleaire porie complex, 1: 1000) verdund in PBS-3% BSA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. Wassen met vijf onmiddellijke veranderingen van PBS-NP40.
  13. Incubeer met tweede antilichaam verdund in PBS-3% BSA gedurende 1 uur bij KT. Wassen met vijf onmiddellijke veranderingen van PBS-NP40.
  14. Incuberenmet 10 ug / ml Hoechst verdund in PBS-3% BSA gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was vijfmaal met PBS-NP40. Verwijder alle overtollige buffer.
  15. Monteer de dekglaasje op een dia met 5 ul antifade montage medium. Seal met duidelijke nagellak. Afbeelding onmiddellijk met een epifluorescentie microscoop met 20 - 100x doelstellingen en bewaar bij 4 ° C voor latere beeldvorming.
    Opmerking: Voer kwantificering zoals eerder beschreven 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Assemblage van Kernen in Egg Extract

De eerste stappen van dit protocol zijn aan X. bereiden laevis ei extract (Protocol 1) en demembranated sperma kernen (Protocol 2). Deze reagentia worden vervolgens gebruikt om de kernen novo (protocol 3) monteren. Figuur 1 toont enkele representatieve gegevens. Toevoeging van calcium drijft de meiose gearresteerd ei extract in interfase en de cycloheximide houdt het extract gearresteerd in interfase. Van 30 - 45 minuten na begin van de reactie, moet de eerste dunne S-vormige spermakernen beginnen te verdikken in slug-vormige chromatine massa. Succesvolle vorming van een intacte kern envelop kan worden beoordeeld door de invoer en het behoud van een fluorescent gelabelde uitvoertips zoals GST-GFP-NLS (gegevens niet getoond), of door rand kleuring voor de nucleaire porie complex: mAb414 dat FG-repeat herkent containing nucleoporins (figuur 1A). Na nucleair geheel optreedt, moet de nucleaire vorm ronder geworden en de nucleaire volume moet toenemen als de kern envelop breidt uit en nucleaire eiwitten worden geïmporteerd (Figuur 1B-C). Het niet tot de vorming van een intacte nucleaire envelop of nucleaire groei waarnemen duidt op een slechte kwaliteit ei extract. In dit geval is het beste opnieuw beginnen met een nieuwe partij eieren.

Verwijdering van endogene Kernen van Embryo Extract
De volgende stap is een laat stadium embryo extract (protocol 4) te bereiden. Na initiële bereiding van het extract en vóór verwijdering van kernen, het beste een Hoechst-gekleurde squash van een kleine hoeveelheid van het extract te bereiden. Visualisatie van vele kleine embryonale kernen is een goede indicatie van succes bij het ​​bereiden van het extract (Figuur 2A). Endogene embryonale kernen kunnen interfereren met de stroomafwaartse analysis is het ook belangrijk om een ​​hoeveelheid extractieoplossing controleren na het verwijderen van kernen door verdunning en centrifugeren. Vergeleken met de eerste squash, moet heel weinig kernen worden achtergelaten in het extract (figuur 2B). Als er nog vele kernen aanwezig, wordt een tweede ronde van centrifugatie vereist.

Nucleaire Krimpen Assay
Figuur 3 toont representatieve resultaten voor de nucleaire krimpen assay (Protocol 5). Ei extract kernen gesuspendeerd in een vergevorderd stadium embryo extract kleiner worden na verloop van tijd (Figuur 3B). Een goede negatieve controle voor de test is om kernen met embryo extract die warmte geïnactiveerd (figuur 3A) is uitbroeden. Als kernen niet te krimpen in de warmte geïnactiveerd extract, biedt dit enig vertrouwen dat de nucleaire waargenomen krimpen met onbehandelde embryo extract is niet het gevolg van osmotische effecten. De mate van kerngrootteverminderingen waargenomen afhankelijk van de bepaalde partij ei extract kernen en de kwaliteit van de embryo extract. Onze ervaring is nucleaire krimpen altijd waargenomen (bijvoorbeeld in meer dan 40 verschillende embryo extracten), maar het is belangrijk om deze experimenten meerdere malen herhaald met verschillende kernen en extraheert de inherente variabiliteit van het assay te pakken. Figuur 4 toont een schematische van het gehele protocol.

Figuur 1
Figuur 1. Nucleair Assembly Tijdcurve in X. laevis Egg Extract. Kernen werden geassembleerd de novo in X. laevis ei extract zoals beschreven in protocol 3. Hoeveelheden van hetzelfde reactiemengsel vastgesteld en gevisualiseerd door immunofluorescentie onder gebruikmaking van een antilichaam tegen het nucleaire porie complex (NPC) (mAb414) bij: > A) 30 min, B) 60 min, en C) 90 min na het begin van nucleair geheel. De immunofluorescentie protocol wordt beschreven in Protocol 5. De schaal bar is 25 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Verwijdering van Kernen van X. laevis Embryo Extract. X. laevis embryo extract werd bereid van stap 11,5-12 embryo's zoals beschreven in protocol 4. Een kleine hoeveelheid van extract werd gefixeerd en gekleurd met Hoechst: A) vóór verwijdering van kernen en B) na verwijdering van de kernen door centrifugeren. De schaal bar is 25 micrometer.OM / files / ftp_upload / 54173 / 54173fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Representatieve gegevens van het Nuclear Krimpen Assay. Kernen werden geassembleerd de novo in X. laevis ei extract aangevuld met recombinant GFP-LB3 (om de nucleaire lamina visualiseren). Zoals beschreven in protocol 5 werden ei extract kernen geïsoleerd en opnieuw gesuspendeerd in fase 11,5-12 embryo extract waaruit endogene embryonale kernen was verwijderd. Live-time-lapse imaging werd uitgevoerd bij 30 sec intervallen gedurende 90 min. Figuur panelen tonen beelden die op 6 min-intervallen voor kernen geïncubeerd in: A) laat stadium embryo extract (LEE), en B) door warmte geïnactiveerd (HI) embryo extract. Beelden uit het tijdsverloop doorgaanvan links naar rechts. De schaal bar is 25 micrometer. C) Nucleaire krimpende gegevens uit 46 verschillende ei en embryo-extracten. Balken geven de middelen voor> 240 kernen. Error bars zijn standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Schematische voorstelling van de Nuclear Krimpen Assay. Elke gekleurde vak vertegenwoordigt een protocol. Rood geeft bereiding van X. laevis ei extract (Protocol 1). Blauw geeft bereiding van demembranated X. laevis sperma (Protocol 2). Pink geeft de novo nucleair geheel in ei extract (Protocol 3). Groen geeft bereiding van X. laevis embryo extract (Protocol 4). Paars geeft aan dat de nucleaire shrinking assay protocol en immunofluorescentie (Protocol 5). Delen van dit cijfer zijn hergebruikt van 23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

buffer naam buffer samenstelling
Marc's Modified Ringers (MMR), 1 / 3x 33 mM NaCl, 0,7 mM KCI, 0,3 mM MgSO4, 0,7 mM CaCl2, 1,7 mM HEPES, pH 7,4
Extract buffer (XB), 10x 1 M KCI, 1 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, 500 mM sucrose, 100 mM HEPES, pH 7,8 (pH ingesteld met 10 N KOH, bewaard bij 4 ° C)
buffer B 4% cysteïne opgelost in 0,8x XB (bereid met koud DDH 2 O, een pHdjusted tot 7,8 met 10 N NaOH)
buffer C Meng 100 m van 10x XB met 900 ml koud DDH 2 O
buffer D Buffer C plus 5 mM EGTA en 800 uM MgCl2
LPC voorraad, 1000x 10 mg / ml van zowel leupeptine, pepstatine, chymostatine en opgelost in DMSO (opgeslagen in hoeveelheden bij -20 ° C)
buffer E 100 ml Buffer D plus 100 ul LPC voorraad
Energiemix, 50x 190 mM creatinefosfaat dinatrium, 25 mM ATP dinatriumzout, 25 mM magnesiumchloride
buffer T 15 mM PIPES, 15 mM NaCl, 5 mM EDTA, 7 mM MgCl2, 80 mM KCl, 0,2 M sucrose, pH 7,4 (filter gesteriliseerd en bewaard bij 4 ° C)
buffer S 20 mM maltose en 0,05% lysolecithine bereid in buffer T
buffer R Buffer T plus 3% bovineserumalbumine
Calcium voorraad oplossing, 20x 10 mM CaCl2, 0,1 M KCI, 1 mM MgCl2 (bewaard bij -20 ° C)
nucleus fix 125 gl 2 M sucrose, 12,5 ui 1 M HEPES pH 7,9, 250 ui 37% formaldehyde, 112 pl DDH 2 O, 0,5 gl 10 mg / ml Hoechst (bewaard bij kamertemperatuur gedurende maximaal twee weken)
Gemodificeerde Barth's zoutoplossing (MBS), 10x 880 mM NaCl, 10 mM KCI, 50 mM HEPES, 25 mM NaHCO 3, pH 7,8
High Salt MBS 1x MBS plus 0,7 mM CaCl2 en 20 mM NaCl
Egg lysisbuffer, ELB 250 mM sucrose, 50 mM KCI, 2,5 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,8
Nucleaire kussen buffer 1x XB, 0,2 M sucrose, 25% glycerol (filter gesteriliseerd en bewaard bij 4 ° C)

Tabel 1. Buffers. Composities van alle in dit protocol genoemde buffers zijn beschreven in deze tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG Molecular Probes A10037
ATP disodium salt Sigma Aldrich A2383
Benzocaine Sigma Aldrich E1501
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059
CaCl2 Sigma Aldrich C3306
Centrifuge Beckman J2-21M
Centrifuge rotor Beckman JS 13.1
chymostatin Sigma Aldrich C7268
creatine phosphate disodium Calbiochem 2380
cycloheximide Sigma Aldrich C6255
cytochalasin D Sigma Aldrich C8273
disposable wipes (kimwipes) Sigma Aldrich Z188956
L-cysteine Sigma Aldrich W326306
EGTA Sigma Aldrich E4378
Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
Glass crystallizing dish (150 x 75 mm) VWR 89090-662
Glycerol Macron 5094-16
HEPES Sigma Aldrich H4034
Hoechst - bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma Aldrich B2261
HCG - Human Chorionic Gonadotropin  Prospec hor-250-c
L15 Media Sigma Aldrich L4386
leupeptin Sigma Aldrich L2884
Lysolecithin Sigma Aldrich L1381
mAb414 Abcam ab24609
MgCl2 EMD MX0045-2
MgSO4 Sigma Aldrich M9397
Maltose Sigma Aldrich M5885
NP40 BDH 56009
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin + Streptomycin Sigma Aldrich Pp0781
pepstatin Sigma Aldrich P5318
PIPES Sigma Aldrich P6757
Plastic paraffin film (parafilm) Sigma Aldrich P7793
KCl Sigma Aldrich P9541
KH2PO4 Mallinckrodt 70100
KOH Baker 5 3140
PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin Prospec hor-272-a
NaCl Sigma Aldrich S3014
NaHCO3 Fisher BP328
Na2HPO4 EMD SX0720-1
NaOH EMD SX0590
Pestle Thomas Scientific 3411D56
Round bottom glass tubes, 15 ml Corex 8441
Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) ThermoFisher A10037
sucrose Calbiochem 8550
thermal cycler Bio-Rad T100
Ultracentrifuge Beckman L8-80M
Ultracentrifuge rotor Beckman SW 50.1
Vectashield (anti-fade mounting medium) Vector H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conklin, E. Cell size and nuclear size. J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).
  2. Wilson, E. B. The Cell in Development and Heredity. The Macmillan Company. 727-733 (1925).
  3. Levy, D. L., Heald, R. Nuclear size is regulated by importin alpha and Ntf2 in Xenopus. Cell. 143, (2), 288-298 (2010).
  4. Chan, Y. H., Marshall, W. F. Scaling properties of cell and organelle size. Organogenesis. 6, (2), 88-96 (2010).
  5. Walters, A. D., Bommakanti, A., Cohen-Fix, O. Shaping the nucleus: Factors and forces. J Cell Biochem. 113, (9), 2813-2821 (2012).
  6. Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. J Cell Sci. 122, (Pt 10), 1477-1486 (2009).
  7. Edens, L. J., White, K. H., Jevtic, P., Li, X., Levy, D. L. Nuclear size regulation: from single cells to development and disease. Trends Cell Biol. 23, (4), 151-159 (2013).
  8. Jevtic, P., Edens, L. J., Vukovic, L. D., Levy, D. L. Sizing and shaping the nucleus: mechanisms and significance. Curr Opin Cell Biol. 28, 16-27 (2014).
  9. Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of intracellular scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
  10. Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation. Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).
  11. Jevtic, P., Levy, D. L. Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing. Curr Biol. 25, (1), 45-52 (2015).
  12. Hara, Y., Iwabuchi, M., Ohsumi, K., Kimura, A. Intranuclear DNA density affects chromosome condensation in metazoans. Mol Biol Cell. 24, (15), 2442-2453 (2013).
  13. Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nat Rev Cancer. 4, (9), 677-687 (2004).
  14. Jevtic, P., Levy, D. L. Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer. Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).
  15. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12, (3), 196-209 (2012).
  16. Blom, J. H., Ten Kate, F. J., Schroeder, F. H., van der Heul, R. O. Morphometrically estimated variation in nuclear size. A useful tool in grading prostatic cancer. Urol Res. 18, (2), 93-99 (1990).
  17. Dey, P. Cancer nucleus: morphology and beyond. Diagn Cytopathol. 38, (5), 382-390 (2010).
  18. Cross, M. K., Powers, M. A. Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts. Dis Model Mech. 2, (11-12), 541-547 (2009).
  19. Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M., Rapoport, T. A. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124, (3), 573-586 (2006).
  20. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  21. Edens, L. J., Levy, D. L. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. John Wiley & Sons, Inc. 325-345 (2014).
  22. Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8, (1), a019166 (2016).
  23. Edens, L. J., Levy, D. L. cPKC regulates interphase nuclear size during Xenopus development. J Cell Biol. 206, (4), 473-483 (2014).
  24. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). 2nd edn, North-Holland Publishing Company. (1967).
  25. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30, (3), 687-696 (1982).
  26. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30, (3), 675-686 (1982).
  27. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  28. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nat Protoc. 1, (5), 2305-2314 (2006).
  29. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).
  30. Khan, M. A., et al. Quantitative alterations in nuclear structure predict prostate carcinoma distant metastasis and death in men with biochemical recurrence after radical prostatectomy. Cancer. 98, (12), 2583-2591 (2003).
  31. Tan, P. H., Goh, B. B., Chiang, G., Bay, B. H. Correlation of nuclear morphometry with pathologic parameters in ductal carcinoma in situ of the breast. Mod Pathol. 14, (10), 937-941 (2001).
  32. Zeimet, A. G., et al. DNA ploidy, nuclear size, proliferation index and DNA-hypomethylation in ovarian cancer. Gynecol Oncol. 121, (1), 24-31 (2011).
  33. Theerthagiri, G., Eisenhardt, N., Schwarz, H., Antonin, W. The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex. J Cell Biol. 189, (7), 1129-1142 (2010).
  34. Wuhr, M., et al. Evidence for an upper limit to mitotic spindle length. Curr Biol. 18, (16), 1256-1261 (2008).
  35. Loughlin, R., Wilbur, J. D., McNally, F. J., Nedelec, F. J., Heald, R. Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus. Cell. 147, (6), 1397-1407 (2011).
  36. Wilbur, J. D., Heald, R. Mitotic spindle scaling during Xenopus development by kif2a and importin. eLife. 2, e00290 (2013).
  37. Kieserman, E. K., Heald, R. Mitotic chromosome size scaling in Xenopus. Cell Cycle. 10, (22), 3863-3870 (2011).
  38. Maresca, T. J., Freedman, B. S., Heald, R. Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts. J Cell Biol. 169, (6), 859-869 (2005).
  39. MacCallum, D. E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B. Mol Biol Cell. 13, (1), 25-39 (2002).
  40. Goehring, N. W., Hyman, A. A. Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components. Curr Biol. 22, (9), R330-R339 (2012).
  41. Du Toit, A. Development: Honey, I shrunk the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, (10), 633 (2014).
  42. Buchner, K. The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus. J Cancer Res Clin Oncol. 126, (1), 1-11 (2000).
  43. Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. Protein kinase C, an elusive therapeutic target. Nat Rev Drug Discov. 11, (12), 937-957 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics