Ein zellfreien Assay unter Verwendung von

Biology

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Edens, L. J., Levy, D. L. A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation. J. Vis. Exp. (114), e54173, doi:10.3791/54173 (2016).

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Abstract

Eine grundlegende Frage in der Zellbiologie ist wie Zell- und Organell Größen reguliert werden. Es ist seit langem erkannt worden, dass die Größe des Kerns im allgemeinen mit der Größe der Zelle skaliert, insbesondere während der Embryonalentwicklung, wenn dramatische Verringerungen sowohl in Zell- und Kerngrößen auftreten. Mechanismen der Regulation der Kerngröße sind weitgehend unbekannt und kann zu Krebs relevant sein , wenn veränderte Kerngröße ein wichtiger diagnostischer und prognostischer Parameter ist. In - vivo - Ansätze zur Kerngröße Regula Identifizierung mit den grundlegenden und komplexen Natur der Kernfunktion kompliziert sind. Die in vitro - Ansatz hier beschriebenen Kerngrößensteuerung zu studieren nutzt die normale Verringerungen der Kerngröße , die während der Xenopus laevis Entwicklung auftreten. Zuerst werden Kerne in X. zusammengebaut laevis Ei - Extrakt. Dann werden diese Kerne isoliert und in Zytoplasma von späten Stadium Embryonen erneut suspendiert. Nach einer 30-90 min Inkubationszeit, Kernflächeverringert sich um 20 bis 60%, einen nützlichen Test bietet Cytoplasma-Komponenten, die in späten Stadium Embryonen zu identifizieren, die zu Entwicklungskerngrößenskalierung beitragen. Ein wesentlicher Vorteil dieser Vorgehensweise ist die relative Leichtigkeit, mit der das Ei und Embryoextrakte können biochemisch manipuliert werden, so dass für die Identifizierung neuer Proteine ​​und Aktivitäten, die Kerngröße zu regulieren. Wie bei jedem in vitro - Ansatz, der Validierung der Ergebnisse in einem in vivo - System ist wichtig, und die Mikroinjektion von X. laevis Embryonen ist für diese Untersuchungen besonders geeignet.

Introduction

Die Größen der Zellorganellen maßstabs typischerweise mit der Größe der Zelle, und das mit der Zellgröße 1-10 für die Skalierung der Kerngröße ist vielleicht am besten dokumentiert. Dies gilt insbesondere während der Embryogenese und der Zelldifferenzierung, wenn dramatische Verringerungen sowohl in Zell- und Kerngröße häufig 11,12 beobachtet. Ferner verändert Kerngröße ist ein wichtiger Parameter bei der Krebsdiagnose und -prognose 13-17. Die Mechanismen, die zur Kerngrößenregulierung beitragen, sind weitgehend unbekannt, aufgrund der Komplexität und Wesen der Kernstruktur und Funktion teilweise. Das Verfahren hier wurde als ein in vitro - Assay für die Kerngröße Skalierung beschrieben entwickelt, die biochemische Manipulation und Aufklärung von Mechanismen der Kerngrößenregulierung zugänglich ist.

Xenopus laevis Ei - Extrakt ist ein gut etabliertes System komplexe zelluläre Prozesse in einem in - vitro zu rekapitulieren und studieren 18-22. Ein wesentlicher Vorteil des Systems ist , dass Extrakt X. Eiextrakten laevis stellen eine nahezu unverdünnten Zytoplasma deren Zusammensetzung kann leicht verändert werden, beispielsweise durch Zugabe von rekombinanten Proteinen oder Immunodepletion. Weiterhin ist eine wesentliche Prozesse manipulieren können durch Behandlungen , die die ansonsten letalen in einem in vivo - Kontext sein könnten. Änderungen des Eies Extrakt Verfahren ermöglichen eine Trennung von Auszügen aus X. laevis Embryonen statt Eier, und diese Embryo - Extrakte sind gleichermaßen zugänglich biochemische Manipulation 23. Während X. laevis - Entwicklung, die Einzelzell befruchteten Embryo (~ 1 mm Durchmesser) durchläuft eine Reihe von zwölf schnellen Zellteilungen (Stufen 1 bis 8) bis zu mehreren Tausend erzeugen 50 μm Durchmesser und kleinere Zellen, eine Entwicklungsstufe erreicht nannte die midblastula Übergang (MBT) oder Stufe 24 bis 26 August. Der MBT wird durch den Beginn der zygotischen Transkription, Zellmigration, asynchrone Zellteilungen, den Erwerb von Spaltphasen und Errichtung von Kern Steady-State-Größen statt kontinuierliche Ausbau der Kernkraft wie in der Pre-MBT Embryo aus. Von Stufe 4 bis Gastrulation (Stufen 10,5-12), verringert sich das Volumen der einzelnen Kerne um mehr als 10-fach 11.

Hier ist das Ziel, die Mechanismen zu identifizieren, die für diese Verringerung der Kerngröße während der Entwicklungsfortschritt. Der Ansatz besteht darin, zunächst Kerne montieren in X. laevis Ei - Extrakt und um diese Kerne aus dem Ei Zytoplasma / Extrakt isolieren. Diese Kerne werden dann in Zytoplasma von Ende Gastrulastadium Embryonen erneut suspendiert. Nach einer Inkubationszeit, werden die Kerne aus Ei-Extrakt kleiner Extrakt späten Stadium Embryo. Wir schlussfolgerten, dass diese would ein nützlicher Test sein für die Identifizierung zytoplasmatische Komponenten in späten Stadium Embryonen, die zur Entwicklung der Kerngrößenskalierung beitragen. Unter Verwendung dieses Tests in Verbindung mit in vivo - Validierung, haben wir gezeigt , dass die Proteinkinase C (PKC) trägt zur Entwicklungs Verringerungen der Kerngröße in X. laevis 23.

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Protocol

Alle Xenopus Verfahren und Untersuchungen wurden in Übereinstimmung mit den NRC - Führer für die Pflege und Verwendung von Labortieren 8. Auflage durchgeführt. Protokolle wurden von der University of Wyoming Institutional Animal Care und Use Committee (Assurance # A-3216-01) zugelassen.

1. Herstellung von X. laevis Ei - Extrakt (angepasst von 27,28)

  1. Prime weiblichen X. laevis Frösche ein Minimum von drei Tagen und höchstens zwei Wochen vor der Eiersammlung mit einem einzigen 100 IU Injektion von trächtigen Stute Serum - Gonadotropin (PMSG).
  2. Einen Tag vor dem Experiment, injizieren grundierten Frösche mit 800 IE humanes Choriongonadotropin (HCG) und kann bei 16 ° C in 1 l pro Frosch von 1 / 3x Marc modifizierten Ringers (MMR). Siehe Tabelle 1 für alle Pufferzusammensetzungen.
    Hinweis: Einige Frösche werden nicht Eier legen oder wird schlechter Qualität Eier legen. Typischerweise 2 - 3 Frösche injiziert sufficien mindestens einen Frosch zu gewährleisten legent Zahlen von guter Qualität Eier. Die durchschnittliche Frosch wird lag genug Eier mindestens 1 ml Ei-Extrakt herzustellen.
  3. Vorbereitung 1 L 1 / 3x MMR mit kaltem destilliertem deionisiertem Wasser (ddH 2 O), 500 ml Puffer B, 1 L Puffer C, 500 ml Puffer D und 100 ml Puffer E.
  4. Transfer Eier zu einem Glas Kristallisierschale gelegt (150 x 75 mm). Unter Verwendung eines Kunststoff-Pasteur-Pipette mit der Spitze abgeschnitten, Bauernhof aus weißen geschwollenen aktivierte Eier oder lysiert Eier. Nur behalten Eier mit verschiedenen und gleich dunkel Tier Pole und weiß pflanzlich Pole.
  5. Vorbereitung 13 x 51 mm-Zentrifugenröhrchen mit 1 ml Puffer E mit 355 uM Cytochalasin D supplementiert zugegeben gerade vor in Schritt 1.7 zu verwenden.
  6. Dejelly und die Eier zu waschen.
    1. Waschen Sie Eier kurz mit kaltem 1 / 3x MMR in einem entsprechend dimensionierten Becher, der Puffer 3 Wechsel - 4 mal.
    2. Entfernen Sie die Gelee Mäntel aus den Eiern durch Inkubation mit Puffer B Diese nehmen überall von 3 bis 10 min. Da die trübe Gelee Mäntel sind aus dem Ei freigegebens, ändern Sie den Puffer.
      Anmerkung: Dejellying abgeschlossen ist, wenn die Eier fest in der Ecke der Schale verpackt erscheinen, wenn gekippt und vegetabile Pole nach unten gerichtet. Eier sind viel zerbrechlicher nach dejellying, also nicht brüten Eier mit Puffer B für länger als nötig und die anschließende Waschungen müssen sehr sorgfältig durchgeführt werden.
    3. Wash Eier kurz mit 3-4 Änderungen von Puffer C
    4. Wash Eier kurz mit 2 Änderungen von Puffer D
    5. Wash Eier kurz mit 2 Änderungen Puffer E.
  7. Füllen Sie Zentrifugenröhrchen mit Eiern eine große Bohrung Glaspipette oder Plastiktropfen verwenden. Absaugen Überschüssigen Puffer. Um die Eier zu verpacken und so viel Puffer wie möglich, Zentrifuge in Schwingbecherrotor bei 212 × g für 60 Sekunden und dann bei 478 × g für 30 Sekunden zu entfernen. Absaugen Überschüssigen Puffer.
    Hinweis: Es ist wichtig, so viel überschüssigen Puffer wie möglich bei diesem Schritt zu entfernen, das Ei-Extrakt, um sicherzustellen, minimal verdünnt.
  8. In einem Schwingen Becherrotor, Ultrazentrifuge unter Vakuum für 15 min bei 12.000 xg und 4 ° C Eier geöffnet zu zerkleinern und in verschiedene Schichten trennen, wobei das Zytoplasma der bernsteinfarbene Schicht in der Mitte zu sein. Entfernen Zentrifugenröhrchen und Stelle sofort auf Eis.
  9. Sammeln Sie den Extrakt.
    1. Unter Verwendung einer 18-Gauge-Nadel und Spritze durchbohren das Zentrifugenröhrchen gerade über der dunklen pigmentierte Schicht an der Unterseite des Rohres und entfernen Sie die mittlere bernsteinfarbenem zytoplasmatische Schicht. Sie nicht von der oberen Lipidschicht zu sammeln. Sammeln Sie das Zytoplasma in ein entsprechend dimensioniertes Rohr.
      Hinweis: Im Allgemeinen 1 Frosches erzeugt mindestens 1 ml Extrakt.
    2. Supplement Zytoplasma mit 1/1000 das Volumen von 19,7 mM Cytochalasin D, 1/1000 das Volumen von LPC-Lager, und 1/50 das Volumen 50x Energiemix. vorsichtig umdrehen das Rohr zu mischen. Nicht übermäßig, den Extrakt pipettieren.
    3. Halten Sie den Extrakt auf Eis und innerhalb von 3 Stunden der Vorbereitung für die besten Ergebnisse.
_title "> 2. Herstellung von Demembranated X. laevis Sperm (angepasst von 29)

Hinweis: Die Prozedur Bände hier vorgestellten sind für bis zu 8 Hoden.

  1. Entfernen 0,05% Benzocain (10% Benzocain Lager in Ethanol hergestellt und verdünnt auf 0,05% in Wasser Frosch Tank) von 4 ° C und auf Raumtemperatur erwärmt. Anesthetize und männlichen X. opfern laevis Frösche in Benzocain Lösung bei Raumtemperatur für 20 - 30 min. Stellen Sie sicher, Tod durch Abwesenheit von Herzschlag durch die Untersuchung und das Gefühl der Brustbereich, durch mangelnde Reaktion auf mechanische Stimulation und / oder durch Enthauptung.
  2. Machen Sie einen U-förmigen Schnitt entlang des Bauches. Entfernen Sie die tubulirte Masse von gelben Fettkörper. An der Spitze der Nieren, suchen Sie die Hoden, die Länge 29 blassrosa Massen etwa 1 cm in ovalförmig sind. Excise die Hoden und rollen sie auf Löschpapier Blut und andere Gewebe zu entfernen.
  3. Waschen Sie die Hoden in Buffer T verwenden einen engen Einbau Stößel Hoden mit 1 ml Puffer zu HackfleischT in einem 1,5-ml-Röhrchen, bis sie homogen ist (10 Schläge oder mehr). Zentrifuge von 5 bis 10 sec in einem Mini-Zentrifuge und sammeln Sie den Überstand, Entfernung großer Gewebestücke. Wiederholen Sie die Zentrifugation noch einmal und den Überstand zu sammeln.
  4. Übertragen, um die Spermien enthaltenden Lösung in ein 15 ml Kunststoffröhrchen. Erhöhen Sie die Lautstärke auf insgesamt 2 ml mit Puffer T. Zentrifuge bei 1411 × g für 10 min bei 16 ° C, um die Spermien zu pelletieren.
  5. Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 500 ul Puffer T. Zentrifugation bei 1.411 xg für 10 min bei 16 ° C. Wiederhole diesen Schritt einmal oder zweimal bei Bedarf das Pellet von somatischen und roten Blutkörperchen zu reinigen.
  6. Resuspendieren des Pellets in 100 & mgr; l Puffer T und 300 & mgr; l Buffer S. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
    Hinweis: Puffer S enthält Lysolecithin, die für demembranation verantwortlich ist.
  7. In drei Volumina Puffer R (frisch zubereitet vor der Verwendung). Invert Rohr genau einmal. Zentrifuge bei 1.411 xg für 15 min bei 16 &# 176; C.
  8. Das Pellet in 400 ul Puffer R und dann eine weitere 2 ml Puffer R. Zentrifuge bei 1411 × g für 15 min bei 16 ° C hinzufügen.
  9. Das Pellet in 50 ul Puffer T.
  10. Verdünnen Sie 1 ul demembranated Spermakerne mit 9 ul Buffer T Wenden Sie diese Verdünnung auf einem Hämozytometer. Zählen Sie die Anzahl der dünnen S-förmigen Samenkerne in einem großen 4 x 4 Raster, und multiplizieren Sie diese Zahl mit 100, die Konzentration der Lager in Spermakerne pro ul zu erhalten.
  11. Verdünnen Sie die Lager auf 100.000 Spermakerne pro ul mit Puffer T, in einem 200x Lager führt. Bereiten Sie 3-5 ul Aliquots. Blitzeis in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C.

3. Nuclear Assembly

  1. Supplement 100 ul Eiextrakt mit 1,5 & mgr; l 35,5 mM Cycloheximid (Endkonzentration ~ 0,5 mM), 6 ul 20x Calciumvorratslösung (Endkonzentration ~ 0,6 mM) und 0,7 & mgr; l 200x Spermien (Endkonzentration ~ 700Spermakerne / ul). Skalieren Sie das Reaktionsvolumen nach oben oder unten wie nötig. Umkehren oder sanft zu mischen tippen.
    Hinweis: Auszug aus der Metaphase in Interphase radelte bietet eine robuste und zuverlässige Plattform für die Kernbaugruppe.
  2. Inkubieren in einem Wasserbad bei 16-20 ° C für 90 min. Mischen Sie vorsichtig alle 15 min klopfen, um sicherzustellen, Kerne im Extrakt suspendiert bleiben.
  3. Überwachung der Fortschritte der Kernbaugruppe bei 45 min durch einen Squash-Vorbereitung wie folgt.
    1. Pipettieren 2 ul Extrakt auf einen Glasträger und mit 2 ul Kern fix.
    2. Overlay mit einem 22 mm 2 Deckglas. Bild auf einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit Wasser, Öl oder Luft 20 - 100X Ziele und eine DAPI-Filter.
      Anmerkung: Nuclei durch Hellfeld-Bildgebung sichtbar gemacht werden, sondern sind viel leichter durch Fluoreszenz sichtbar zu machen.
    3. Verwenden Sie Kerne sofort oder Flash-Freeze-Aliquots in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C.
      Hinweis: Hinzufügen von 4% Glycerin auf die Kerne prIOR zum Einfrieren helfen kann, ihre Integrität zu erhalten. Gefrorene Kerne sind in der Regel noch lebensfähig und in der Lage Kernimport jedoch das Einfrieren Prozess gestört oder mehr strukturell fragile Kerne führen kann. Kerne bis zu einem Jahr nach dem Gefrieren verwendet werden.

4. Herstellung von X. laevis Embryo - Extrakt

  1. Induce weiblich X. laevis Frösche Eier zu legen , wie in 1.1 und 1.2 beschrieben.
  2. Isolieren Hoden von männlichen X. laevis Frösche wie in 2.2 beschrieben. Versenken Hoden in L15 Medien, ergänzt mit 50 IU / ml Penicillin und Streptomycin in einem Glas 35 x 10 mm Petrischale. Lagerung bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen.
  3. Sammeln und befruchten Eier.
    1. Sammeln frisch gelegte Eier durch Frösche über einem Glas wieder verwendbaren Petrischale hält und Eiablage fördern durch leichten Druck auf den unteren Rücken in der Nähe der Kloake. Quetschen der Frosch zu hart zu Verletzungen führen kann, was zu einem aufgeblähten Bauch und erfuiring Euthanasie 29.
    2. Prop das Gericht bei einem ungefähren Winkel von 45 °, lassen Eier in den Rand der Schale zu sammeln, entfernen Sie alle überschüssigen Puffer, und fügen Sie MMR genug 1 / 3x kaum die Eier decken. Düngung Eier innerhalb von 15 Minuten der Sammlung.
    3. Verwenden Sie einen festen Sitz Stößel aufzuweichen und homogenisieren 1/4 eines Hodens in einem 1,5-ml-Röhrchen mit 500 ul Hochsalz Modified Barths Saline (High Salt MBS). Hinzufügen mazerierten Hoden auf die Eier und ermöglichen Befruchtung bei Raumtemperatur erfolgen für 15 bis 20 min, dann überschwemmen Eier mit 1 / 3x MMR.
      Anmerkung: Die Wirksamkeit der Hoden nimmt mit Lagerzeit kann daher Hoden Gewebe für eine erfolgreiche Befruchtung erforderlich sein, wenn Hoden verwenden, die länger als eine Woche gelagert wurden.
    4. Bestätigung der Befruchtung von für die Kontraktion des dunklen pigmentierten animalen Pol Prüfen und durch die Drehung der Embryonen mit ihren Tierpole nach oben zeigen, in der Regel etwa 20 - 30 min nach Zugabe von zerstoßenem testes. Erwarten Sie die erste Zelle Spaltung innerhalb von 90 min auftreten.
    5. Mit einer breiten Bohrung Glaspipette sorgfältig tot (weiß und geschwollen oder ungleichmäßige Verteilung von Eigelb und Pigment) zu entfernen, lysiert oder unbefruchtete Eier (dh nicht gespalten), da sie rasch Tod im benachbarten Embryonen veranlassen wird.
    6. Überall 1-2,5 Stunden nach der Befruchtung, dejelly Embryonen in 2 - 3% Cystein gelöst in 1/3 x MMR und auf pH 7,9 mit 10 N KOH. Führen Sie zwei Puffer Änderungen, die jeweils 3 - 4 min. Gründlich waschen Sie die Embryonen mit 6 bis 10 kurze Änderungen von 1 / 3x MMR alle Spuren von Cystein zu entfernen.
      Hinweis: Dejellied Embryonen haben eine Vitellinmembran und sind nicht so zerbrechlich wie dejellied Eier.
  4. Mit einer breiten Bohrung Glaspipette, übertragen gesund befruchtet (dh gespalten) Embryonen in eine Petrischale frisch 1 / 3x MMR enthält , und es ihnen ermöglichen, auf die gewünschte Stufe bei RT oder zu entwickeln , wenn langsamere Entwicklung bevorzugt wird, 16 ° C. Weiter zu entfernen abgestorbene oder lysed Embryonen, die durch Mangel an erste Abteilung oder weißen geschwollenen Aussehen gekennzeichnet.
  5. Überprüfen Sie die Stufe der Embryonen , die durch fast vollständige Schließung der Blastoporus Überprüfung und von 24 bis Zeichnungen inszenierter Embryonen in Referenzmaterialien verglichen wird .
    Hinweis: Die Embryonen bei 16 ° C kultiviert Stufe 11,5 erreichen - 12 in ca. 12 Stunden.
  6. Inkubieren Stufe 11,5-12 Embryonen in frischem 1 / 3x MMR ergänzt mit 0,5 mM Cycloheximid für 1 h bei RT, Embryonen im späten Interphase zu verhaften.
  7. Transfer mit breiten Bohrung Glas oder Plastikpipette mindestens 15 (vorzugsweise 30 oder mehr) Interphase verhaftet Embryonen zu einem Reaktionsgefäß.
    Hinweis: 15 Embryonen ausreichend sind, etwa 20 & mgr; l Extrakt herzustellen. Scale up nach Bedarf.
  8. 1 ml Ei Lysepuffer (ELB), ergänzt mit 1 ul LPC Lager. Vorsichtig umdrehen Embryonen zu waschen, lassen Embryonen auf den Boden des Röhrchens zu fallen, und den Puffer zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zwei weitere Male. </ Li>
  9. Resuspendieren Embryonen in 500 ul ELB plus 0,5 ul LPC Lager, 5 ul 19,7 mM Cycloheximid und 5 ul 35,5 mM Cytochalasin D (bis Aktin-Polymerisation hemmen). Zentrifuge bei 200 × g für 1 min in einer Tischmikrozentrifuge.
  10. Überschüssigen Puffer und mit einem Stößel, um gründlich die Embryonen zu vernichten. Zentrifuge in einem Schwingbecher-Rotor für 10 min bei 10.000 × g und 16 ° C.
  11. Stechen Sie die Lipidschicht von oben mit einer 200 ul Pipettenspitze. Mit einem sauberen 200 ul Pipettenspitze, entfernen Sie die mittlere Cytoplasma-amber-farbige Schicht auf eine geeignete Größe Rohr.
  12. Supplement Embryoextrakt mit 1/50 des Volumens von 50x Energiemix (ATP-Regenerationssystem zur Verfügung zu stellen), 1/100 das Volumen von 35,5 mM Cycloheximid, 1/500 Volumen von 19,7 mM Cytochalasin D und 1 / 1.000 das Volumen der LPC Lager.
  13. Bereiten Sie einen Squash, wie in 3.3 beschrieben, um endogene embryonalen Kerne in dem Extrakt zu visualisieren.
    Hinweis: Embryo-Extrakt kann mit eingefroren werden die endogenen Kerne an dieser Stelle. Aliquotieren zu reduzieren Frost / Tau-Zyklen und bei -80 ° C.
  14. Zum Entfernen von Kernen aus dem Embryo-Extrakt, verdünnt den Extrakt mit einem gleichen Volumen von 1/50 ELB das Volumen 50x Energie Mischung enthält, 1/100 das Volumen von 35,5 mM Cyclohexamid, 1/500 das Volumen von 19,7 mM Cytochalasin D, und 1/1000 das Volumen der LPC-Lager. Zentrifuge in einem Schwingbecher-Rotor bei 17.000 xg für 15 min bei 16 ° C.
  15. Die überstehende Flüssigkeit wird vorsichtig jegliches verbleibende Lipid an der Spitze zu vermeiden. Nicht die pelletierten Kerne an der Unterseite des Rohres stören. Bereiten Sie einen Squash beschrieben, wie in 3.3, um sicherzustellen, dass die meisten Kerne entfernt wurden. Verwenden Sie den Extrakt frisch oder aliquoten und bei -80 ° C.
  16. Aufzuheizen Embryoextrakt für Kontrollversuche, Wärme 30 inaktivieren - 100 ul Aliquots des Extraktes bei 56 ° C für 30 min unter Verwendung eines Thermocyclers verwenden. Lassen Sie hitzeinaktiviertem Extrakt auf Raumtemperatur vor der Verwendung zurückzukehren.
_title "> 5. Nuclear Schrumpf Assay und Immunofluoreszenz

  1. Isolieren Sie Kerne in Ei-Extrakt zusammengebaut durch Verdünnung 25-150 ul vormontierter Kerne in 1 ml ELB in einem 1,5-ml-Röhrchen. Zentrifuge bei 1.600 × g für 3 min bei 4 ° C in einer Tischmikrozentrifuge. Entfernen Sie Puffer, wobei darauf geachtet, nicht die fragile Pellet der Kerne an der Unterseite des Rohres zu stören.
  2. Resuspendieren Kerne in einem Volumen von Embryoextrakt gleich dem ursprünglichen Volumen der in 5.1 verwendeten Ei-Extrakt. Verwenden Sie ELB oder Hitze inaktivierten Extrakt für Kontrollreaktionen, als angemessen.
  3. Ziehen Sie das Rohr tippen Sie auf das Pellet und resuspendieren die Kerne aufzubrechen. 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, sanft das Rohr klopfen alle 15 zu mischen - 30 min. Hinweis: Die meisten der Kernschrumpfung innerhalb der ersten 30 min erfolgt.
  4. Überwachung der Fortschritte der Kernschrumpfung durch einen Squash vorbereitet.
    1. Pipettieren 2 ul Extrakt auf einen Glasträger und mit 2 ul Kern fix.
    2. Overlay mit einem 22 mm 2
  5. Tippen Sie auf das Rohr die Kerne unmittelbar vor der Zugabe von 500 & mgr; l Fixiermittel zu suspendieren, bestehend aus ELB, 15% Glycerin und 2,6% Paraformaldehyd. Invert sofort, und legen Sie den Schlauch auf einem Rotator für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
  6. Bereiten Sie Spin-down-Rohre durch die Ausstattung 15 ml Rundboden-Glasröhrchen mit rundem Boden Kunststoff-Einsätze (Design und Schemata auf Anfrage erhältlich). 5 ml Kernkissen Puffer. Werfen Sie einen 12 mm Kreisdeckglas in die Röhre, sicher zu sein, es auf der Oberseite der Kunststoffeinsatz flach aufliegt.
  7. Schicht vorsichtig die Lösung feste Kerne auf der Oberseite des Kernkissen, das eine breite Bohrung Pipettenspitze verwenden. Zentrifuge in einem Schwingbecher-Rotor für 15 min bei 1000 xg und 16 ° C.
  8. Verwenden eines Aspirators alle dem Puffer zu entfernen, und der Kunststoffeinsatz an der Oberseite des Rohres ziehen. Entfernen Sie das Deckglas mit einem Paar von feinen Pinzette, vorsichtig auf die Seite der Abdeckung zu beachtengleiten auf dem wurden die Kerne gesponnen. Post-fix in kaltem Methanol für 5 min bei RT (bei -20 ° C gelagert).
  9. Übertragen Sie die Deck Kern Seite nach oben auf ein Blatt aus Kunststoff Paraffinfilm eine große Petrischale aus Kunststoff Futter. Platzieren wet Einwegtücher an der Seite der Schale Austrocknung zu verhindern.
  10. Rehydrieren Kerne auf dem Deckglas mit 500 ul PBS-NP40 (1x PBS plus 0,1% NP40) und Aspirat nach von 5 bis 10 sec.
  11. Schicht vorsichtig 75 & mgr; l PBS-3% Rinderserumalbumin (BSA) auf dem Deckglas. Erlauben 1 Stunde bei Raumtemperatur zu blockieren oder über Nacht bei 4 ° C.
  12. Entfernen Blockierungslösung und Inkubieren mit primärem Antikörper (zB mAb414 gegen den Kernporenkomplex, 1: 1000) , verdünnt in PBS-3% BSA für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. Waschen Sie sich mit fünf sofortige Änderungen von PBS-NP40.
  13. Inkubieren mit sekundärem Antikörper, verdünnt in PBS-3% BSA für 1 h bei RT. Waschen Sie sich mit fünf sofortige Änderungen von PBS-NP40.
  14. bebrütenmit 10 & mgr; g / ml Hoechst verdünnt in PBS-3% BSA für 5 min bei RT. Waschen fünfmal mit PBS-NP40. Entfernen Sie alle überschüssigen Puffer.
  15. Montieren Sie das Deckglas auf einen Objektträger mit 5 ul verblassungshemmenden Eindeckmediums. Siegel mit klarem Nagellack. Bild sofort mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit 20 - 100x Objektive oder lagern bei 4 ° C für eine spätere Bildgebung.
    Hinweis: Führen Sie die Quantifizierung , wie zuvor 23 beschrieben.

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Representative Results

Versammlung der Nuclei in Egg Extract

Die ersten Schritte dieses Protokolls sind X vorzubereiten laevis Ei - Extrakt (Protokoll 1) und demembranated Samenkerne (Protokoll 2). Diese Reagenzien werden dann verwendet , um Kerne montieren de novo (Protokoll 3). Abbildung 1 zeigt einige repräsentative Daten. Die Zugabe von Kalzium treibt die meiotisch verhaftet Ei-Extrakt in der Interphase und der Cycloheximid hält den Extrakt in der Interphase verhaftet. Mit 30 - 45 Minuten nach Beginn der Reaktion, die anfänglich dünnen S-förmigen Spermakerne sollten beginnen, in schneckenförmigen Chromatin Massen zu verdicken. Erfolgreiche Bildung einer intakten Kernhülle kann durch Import und Beibehaltung eines fluoreszenzmarkierten Import Fracht, wie GST-GFP-NLS (Daten nicht gezeigt) oder durch Felgen Färbung für den Kernporenkomplex bewertet werden mAb414 verwenden, das FG-repeat erkennt containing Nukleoporine (1A). Nach dem Atomanordnung auftritt, sollte Kern Form runder geworden und das Atomvolumen erhöhen sollte , da die Kernhülle erweitert und sind Kernproteine ​​importiert (1B-C). Failure Bildung einer intakten Kernhülle oder Kernwachstum zu beobachten, zeigt eine schlechte Qualität Ei-Extrakt. In diesem Fall ist es am besten wieder von Eiern mit einem neuen Stapel zu beginnen.

Die Entfernung von Endogene Nuclei aus Embryo - Extrakt
Der nächste Schritt ist es, einen späten Stadium Embryoextrakt (Protokoll 4) herzustellen. Nach der erstmaligen Herstellung des Extrakts und vor dem Entfernen der Kerne, ist es am besten, eine Hoechst-gefärbte Squash eines kleinen aliquoten Teil des Extrakts vorzubereiten. Visualisierung von viele kleine embryonalen Kerne ist ein guter Indikator für den Erfolg bei der Herstellung des Extraktes (2A). Als endogene embryonalen Kerne können mit der nachgeschalteten analysi störens ist es auch wichtig, ein Aliquot des Extrakts nach Kerne durch Verdünnung und Zentrifugation entfernt zu überprüfen. Im Vergleich zum ersten Squash, sehr wenige Kerne sollten in dem Extrakt (2B) belassen werden. Wenn es noch viele Kerne vorhanden, eine zweite Runde der Zentrifugation sind erforderlich.

Nuclear Schrumpf Assay
Abbildung 3 zeigt repräsentative Ergebnisse für die Kernschrumpf Assay (Protokoll 5). Eiextrakt Kerne im späten Stadium Embryoextrakt resuspendiert kleiner werden über die Zeit (3B). Eine gute negative Kontrolle für den Test ist Kerne mit Embryoextrakt zu inkubieren , die Wärme inaktiviert (3A) war. Als Kerne in hitzeinaktiviertem Extrakt schrumpfen ausfallen, stellt dies einige Zuversicht, dass nicht eine Folge des osmotischen Effekte Kern Schrumpfung mit unbehandeltem Embryoextrakt beobachtet wird. Das Ausmaß der KerngrößeVerringerungen beobachtet, hängt von der bestimmten Charge von Eiextrakt Kerne sowie die Qualität des Embryoextrakt abhängig. Nach unserer Erfahrung ist Kern Schrumpfen immer beobachtet ( zum Beispiel in mehr als 40 verschiedenen Embryo Extrakte), jedoch ist es wichtig , diese Experimente mehrmals mit verschiedenen Kernen zu wiederholen und extrahiert die inhärente Variabilität des Assays zu adressieren. Abbildung 4 zeigt eine schematische des gesamten Protokolls.

Abbildung 1
Abbildung 1. Kernmontagezeit - Kurs in X. laevis Ei - Extrakt. Die Kerne wurden de novo in X. zusammengebaut laevis Ei - Extrakt , wie in Protokoll 3. Aliquots aus der gleichen Reaktion wurden fixiert und sichtbar gemacht durch Immunofluoreszenz unter Verwendung eines Antikörpers gegen den Kernporenkomplex (NPC) (mAb414) beschrieben unter: > A) 30 min, B) 60 min, und C) 90 min nach dem Beginn der Atomanordnung. Das Immunofluoreszenz - Protokoll ist in Protokoll 5. Der Maßstab beschrieben ist 25 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Die Entfernung von Nuclei von X. laevis Embryo - Extrakt. X. A) vor dem Entfernen der Kerne und B) nach dem Entfernen der Kerne durch Zentrifugation: 12 Embryonen im Protokoll 4. Ein kleines Aliquot des Extraktes beschrieben wurde fixiert und gefärbt mit Hoechst - laevis Embryo Extrakt wurde aus der Stufe 11,5 hergestellt. Der Maßstab ist 25 um.om / files / ftp_upload / 54173 / 54173fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Repräsentative Daten aus dem Kernschrumpf Assay. Die Kerne wurden de novo in X. zusammengebaut laevis Ei - Extrakt mit rekombinantem GFP-LB3 ergänzt (die Kernlamina sichtbar zu machen). 12 Embryo Extrakt aus dem endogenen embryonalen Kerne entfernt worden war - wie in Protokoll 5 beschrieben, Kerne Ei-Extrakt wurden im Stadium 11,5 isoliert und erneut suspendiert. Live-Zeitraffer-Bildgebung wurde für 90 min bei 30 Sekunden-Intervallen durchgeführt. Abbildung Tafeln zeigen Bilder in 6 - Minuten - Intervallen für Kerne erworben inkubiert in: A) späten Stadium Embryo - Extrakt (LEE) und B) hitzeinaktiviertem (HALLO) Embryo - Extrakt. Bilder aus den Zeit Kurse gehenvon links nach rechts. Der Maßstab ist 25 um. C) Kernschrumpf Daten aus 46 verschiedenen Ei und Embryo - Extrakten. Die Balken zeigen die Mittel für> 240 Kerne. Die Fehlerbalken sind Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Schematische Darstellung des Kernschrumpf Assay. Jeder farbige Box stellt ein Protokoll. Rot bedeutet , Vorbereitung von X. laevis Ei - Extrakt (Protokoll 1). Blau zeigt Vorbereitung von demembranated X. laevis Spermien (Protokoll 2). Rosa zeigt De - novo - Atomanordnung in Ei - Extrakt (Protokoll 3). Grün bedeutet , Vorbereitung von X. laevis Embryo - Extrakt (Protokoll 4). Lila zeigt die Kern shrinking Assayprotokoll und Immunofluoreszenz (Protokoll 5). Teile dieser Figur wurden aus 23. Wiederverwendet worden Bitte klicken hier , um eine größere Version dieser Figur.

Buffer Name Pufferzusammensetzung
Marc-modifiziertem Ringers (MMR), 1 / 3x 33 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,3 mM MgSO 4, 0,7 mM CaCl 2, 1,7 mM HEPES, pH 7,4
Extract-Puffer (XB), 10x 1 M KCl, 1 mM CaCl 2, 10 mM MgCl 2, 500 mM Sucrose, 100 mM HEPES, pH 7,8 (pH mit 10 N KOH eingestellt, bei 4ºC gelagert)
Puffer B 4% Cystein in 0.8x XB gelöst (hergestellt mit kaltem ddH 2 O, pH - Wert eindjusted auf 7,8 mit 10 N NaOH)
Puffer C Mischungs 100 m 10fach XB mit 900 ml kaltem ddH 2 O
Puffer D Puffer C plus 5 mM EGTA und 800 & mgr; M MgCl 2
LPC Lager, 1,000x 10 mg / ml jeweils von Leupeptin, Pepstatin, Chymostatin und in DMSO gelöst (in Aliquots bei -20 ° C gelagert)
Puffer E 100 ml Puffer D plus 100 ul LPC Lager
Energie-Mix, 50x 190 mM Kreatinphosphat Dinatrium, 25 mM ATP Dinatriumsalz, 25 mM Magnesiumchlorid
Buffer T 15 mM PIPES, 15 mM NaCl, 5 mM EDTA, 7 mM MgCl 2, 80 mM KCl, 0,2 M Saccharose, pH 7,4 (Filter sterilisiert und bei 4 ° C gelagert)
Buffer S 20 mM Maltose und 0,05% Lysolecithin, hergestellt in Puffer T
Buffer R Buffer T plus 3% RinderSerumalbumin
Calcium-Stammlösung, 20x 10 mM CaCl 2, 0,1 M KCl, 1 mM MgCl 2 (bei ​​-20 ° C gelagert)
Nucleus fix 125 & mgr; l 2 M Saccharose, 12,5 & mgr; l 1 M HEPES pH 7,9, 250 & mgr; l 37% Formaldehyd, 112 & mgr; l ddH 2 O, 0,5 ul 10 mg / ml Hoechst (bei ​​Raumtemperatur gelagert für bis zu zwei Wochen)
Barths Saline (MBS) Modifizierte, 10x 880 mM NaCl, 10 mM KCl, 50 mM HEPES, 25 mM NaHCO 3, pH 7,8
High Salt MBS 1x MBS plus 0,7 mM CaCl 2 und 20 mM NaCl
Ei Lysepuffer, ELB 250 mM Saccharose, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl 2, 10 mM HEPES, pH 7,8
Kernkissen Puffer 1x XB, 0,2 M Saccharose, 25% Glycerin (Filter sterilisiert und bei 4 ° C gelagert)

Tabelle 1 Puffer. Compositions aller Puffer in diesem Protokoll genannt werden in dieser Tabelle beschrieben.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG Molecular Probes A10037
ATP disodium salt Sigma Aldrich A2383
Benzocaine Sigma Aldrich E1501
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059
CaCl2 Sigma Aldrich C3306
Centrifuge Beckman J2-21M
Centrifuge rotor Beckman JS 13.1
chymostatin Sigma Aldrich C7268
creatine phosphate disodium Calbiochem 2380
cycloheximide Sigma Aldrich C6255
cytochalasin D Sigma Aldrich C8273
disposable wipes (kimwipes) Sigma Aldrich Z188956
L-cysteine Sigma Aldrich W326306
EGTA Sigma Aldrich E4378
Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
Glass crystallizing dish (150 x 75 mm) VWR 89090-662
Glycerol Macron 5094-16
HEPES Sigma Aldrich H4034
Hoechst - bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma Aldrich B2261
HCG - Human Chorionic Gonadotropin  Prospec hor-250-c
L15 Media Sigma Aldrich L4386
leupeptin Sigma Aldrich L2884
Lysolecithin Sigma Aldrich L1381
mAb414 Abcam ab24609
MgCl2 EMD MX0045-2
MgSO4 Sigma Aldrich M9397
Maltose Sigma Aldrich M5885
NP40 BDH 56009
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin + Streptomycin Sigma Aldrich Pp0781
pepstatin Sigma Aldrich P5318
PIPES Sigma Aldrich P6757
Plastic paraffin film (parafilm) Sigma Aldrich P7793
KCl Sigma Aldrich P9541
KH2PO4 Mallinckrodt 70100
KOH Baker 5 3140
PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin Prospec hor-272-a
NaCl Sigma Aldrich S3014
NaHCO3 Fisher BP328
Na2HPO4 EMD SX0720-1
NaOH EMD SX0590
Pestle Thomas Scientific 3411D56
Round bottom glass tubes, 15 ml Corex 8441
Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) ThermoFisher A10037
sucrose Calbiochem 8550
thermal cycler Bio-Rad T100
Ultracentrifuge Beckman L8-80M
Ultracentrifuge rotor Beckman SW 50.1
Vectashield (anti-fade mounting medium) Vector H-1000

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