Kullanılarak hücresiz Deneyi

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Edens, L. J., Levy, D. L. A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation. J. Vis. Exp. (114), e54173, doi:10.3791/54173 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hücre biyolojisinde temel bir soru hücre ve organel boyutları düzenlenir nasıl. Uzun zamandan beri hem hücre azaltılması için ve nükleer boyutlar ortaya çıktığında çekirdeğin boyutu genellikle özellikle embriyojenez sırasında, hücre boyutu ile terazi olduğu kabul edilmiştir. Nükleer boyut düzenleme mekanizmaları büyük ölçüde bilinmemektedir ve değişmiş nükleer boyutu önemli bir tanısal ve prognostik parametre olduğu kanser ile ilgili olabilir. In vivo nükleer fonksiyonun temel ve karmaşık doğası gereği karmaşık olan nükleer boyut regülatörleri belirlenmesi amacıyla yaklaşır. Nükleer boyut kontrolünü incelemek için burada açıklanan in vitro yaklaşım Xenopus laevis gelişimi sırasında meydana gelen nükleer boyutu normal indirimlerin yararlanır. İlk olarak, çekirdek X monte edilmektedir Yumurta özü laevis. Daha sonra, bu çekirdekler izole edilmiş ve geç aşama embriyolar sitoplazma içinde tekrar süspanse edilir. 90 dakika kuluçka dönemi, nükleer yüzey alanı - 30 sonragelişimsel nükleer boyut ölçekleme katkıda geç evre embriyo mevcut sitoplazmik bileşenleri tanımlamak için yararlı bir tahlil sağlayan% 60 - 20 azalır. Bu yaklaşımın en büyük avantajı yumurta ve embriyo ekstreleri biyokimyasal nükleer boyutunu düzenleyen yeni proteinler ve faaliyetlerinin tanımlanması için izin manipüle edilebildiği göreli bir tesistir. Nitro yaklaşımda herhangi biri gibi, bir in vivo sistem sonuçların doğrulanması önemlidir ve X'in mikroenjeksiyon laevis embriyolar bu çalışmalar için özellikle uygundur.

Introduction

Hücre organellerinin boyutları genellikle hücrenin boyutuna ölçeklendirme ve bu belki de en iyi cep boyutu 1-10 nükleer boyutta ölçekleme için dokümante edilmiştir. Bu durum hücre çekirdek büyüklüğü hem de azaltılması için genellikle 11,12 görülmektedir embriyojenez ve hücre farklılaşması sırasında geçerlidir. Ayrıca, değişmiş nükleer boyut kanseri tanı ve prognoz 13-17 anahtar bir parametredir. Nükleer boyut düzenlemeye katkıda Mekanizmalar nedeniyle karmaşıklığı ve nükleer yapı ve fonksiyonunun temel doğası kısmen, büyük ölçüde bilinmemektedir. Burada anlatılan yöntemi biyokimyasal manipülasyon ve nükleer boyut düzenleme mekanizmalarının aydınlatılmasında mükellef nükleer boyut ölçekleme için bir in vitro deneyi olarak geliştirilmiştir.

Xenopus laevis yumurta özü bir in vitro karmaşık hücresel süreçleri recapitulate ve incelemek için iyi kurulmuş bir sistemdir 18-22 dahil olmak üzere birçok hücresel süreçleri hakkında yeni temel bilgiler ortaya koymuştur. Özü sistemine temel avantajlarından biri, o X. laevis yumurta özler, terkibi kolaylıkla yeniden birleştirici protein veya bağışıklık sistemindeki eklenmesiyle, örneğin, değiştirilebilen bir yaklaşık seyreltilmemiş sitoplazma temsil etmektedir. Ayrıca, bir başka şekilde in vivo bir bağlamda ölümcül olabilir tedaviler kullanılarak esas işlemleri manipüle edebilir. Yumurta özü prosedürünün Değişiklikler X elde edilen ekstrelerin izolasyonu için izin laevis embriyoların yerine yumurta ve bu embriyo ekstreleri biyokimyasal manipülasyon 23 eşit müsait. X sırasında gelişimini laevis, tek hücreli döllenmiş embriyo (~ 1 mm çapında) (1 aşamaları - 8) oniki hızlı hücre bölünmeleri bir dizi uğrar oluşturmak için birkaç bin 50 μm çapında ve gelişimsel aşamaya ulaşan küçük hücreler, midblastula geçiş (MBT) ya da sahne 24-26 Ağustos olarak nitelendirdi. MBT zigotik transkripsiyon, hücre göçü, asenkron hücre bölünmeleri, boşluk fazlarının edinimi ve nükleer kararlı durum boyutları ziyade öncesi MBT embriyo gibi sürekli nükleer genişleme kurulması başlaması ile karakterizedir. Bireysel çekirdeklerin hacmi fazla 10 kat 11 azalır - gastrulasyon sahne 4 den (12 10.5 aşamaları).

Burada amaç gelişimsel ilerlemesi sırasında nükleer boyutu bu azalmaların sorumlu mekanizmaları tespit etmektir. Yaklaşım ilk X'te çekirdekleri bir araya getirilmesidir Yumurta özü laevis ve yumurta sitoplazma / ekstresinden elde edilen bu çekirdekleri izole etmek. Bu çekirdek daha sonra son gastrula sahne embriyolardan sitoplazma içinde tekrar süspanse edilir. bir kuluçka döneminden sonra, yumurta ekstreden çekirdekler geç aşama embriyo özü küçük hale gelir. Biz bu woul gerekçeligelişimsel nükleer boyut ölçekleme katkıda geç evre embriyo mevcut sitoplazmik bileşenleri tanımlamak için yararlı bir deney olurdu. In vivo doğrulama ile birleştiğinde, bu tahlil, kullanarak, protein kinaz C (PKC), X nükleer boyutta gelişim azalmalara katkı gösterdi 23 laevis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm Xenopus prosedürleri ve çalışmalar Laboratuvar Hayvanları 8 baskısının Bakımı ve Kullanımı için NRC Kılavuzu ile uyumlu olarak yürütülmüştür. Protokoller Wyoming Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Güvence # A-3216-01) Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

X'in 1. Hazırlık (27,28 uyarlanmıştır) laevis Yumurta Özü

  1. Başbakan kadın X. laevis üç gün en az ve hamile kısrak serum gonadotropin (PMSG) tek bir 100 IU enjeksiyonu ile yumurta toplamadan önce iki hafta en fazla kurbağa.
  2. Bir gün önce deney, 1 / 3x Marc'ın modifiye zilleri (MMR) bir kurbağa başına 1 L 16 ° C'de insan koryonik gonadotropin (HCG) ve yer 800 IU prime kurbağalar enjekte edilir. Tüm tampon bileşimleri için Tablo 1 'e bakınız.
    Not: Bazı kurbağa yumurtalarını olmaz ya da kalitesiz yumurtalarını olacaktır. Genellikle 2-3 kurbağa sufficien koyacak en az bir kurbağa sağlamak için enjekte edilirkaliteli yumurta t numaraları. Ortalama kurbağa yeterince yumurta yumurta ekstraktı en az 1 ml üretmek koyacak.
  3. 1 / 3x MMR soğuk damıtılmış iyonu giderilmiş su ile L1 hazırlama (GKD 2 O), 500 mi tampon B, 1 L tamponu Cı 500 ml tampon D ve 100 ml tampon E
  4. Transfer cam kristalize çanak (150 x 75 mm) yumurta koydu. ucu ile bir plastik Pasteur pipeti kesti kullanarak, beyaz kabarık aktif yumurta veya parçalanmış yumurta dışarı çiftlik. Sadece farklı ve eşit karanlık hayvan direkleri ve beyaz bitkisel direkleri ile yumurta korur.
  5. D sitokalasin 355 uM ile takviye edilmiş tampon E 1 ml 13 x 51 mm santrifüj tüpleri Adım Bu 1.7 içinde kullanılmadan hemen önce ilave edildi.
  6. Dejelly yumurta yıkayın.
    1. 4 kez - Tampon 3 değişiyor, uygun büyüklükte bir beher soğuk 1 / 3x MMR ile kısaca yumurta yıkayın.
    2. 10 dakika - 3 yerden alacak Tampon B. This ile inkübasyon tarafından yumurta jöle kat çıkarın. bulutlu jöle mont yumurtadan serbest olaraks, tampon değiştirin.
      Not: eğik ve bitkisel kutuplar aşağıya dönük zaman yumurta sıkıca çanak köşesinde dolu görünür olduğunda Dejellying tamamlandı. Yumurta çok daha kırılgan dejellying sonra, yani gerekli ve sonraki yıkar daha uzun Tampon B ile kuluçkaya yok çok dikkatli yapılması gerekir.
    3. Tampon C 4 değişikliklerle - 3 ile yıkayın yumurta kısaca
    4. Tampon D. 2 değişikliklerle yıkayın yumurta kısaca
    5. Tampon E. 2 değişikliklerle yıkayın yumurta kısaca
  7. Geniş delik cam pipet veya plastik damlalık kullanarak yumurta santrifüj tüpleri doldurun. Fazla tampon kapalı aspire. yumurta paketi ve 30 saniye için 478 x g hızında daha sonra 60 saniye boyunca 212 xg'de sallanan kepçeli rotor içinde mümkün santrifüj kadar tampon kaldırmak ve. Fazla tampon kapalı aspire.
    Not: Yumurta özü minimal seyreltilir emin olmak için bu aşamada mümkün olduğu kadar fazla tampon kaldırmak için önemlidir.
  8. Bir sallanan içinde kepçeli rotor, 15, 12.000 x g'de dakika ve 4 ° C'de vakum altında ultrasantrifüjdeki açık yumurta ezmek ve sitoplazma ortasında sarı renkli tabaka olmak üzere, farklı tabakalara ayrılması için. buz üzerinde hemen santrifüj tüplerine ve yer çıkarın.
  9. özü toplamak.
    1. 18 gauge iğne ve şırınga kullanılarak, sadece tüpün alt kısmında koyu pigmentli katmanın üzerinde santrifüj tüpü delinme ve orta amber renkli sitoplazmik tabakayı kaldırmak. Üst lipit tabakasının herhangi toplamak yok. uygun boyutta tüp içinde sitoplazma toplayın.
      Not: Genellikle, 1 kurbağa özü en az 1 ml üretir.
    2. 1 / 1.000 D cytochalasin 19.7 mM hacmi, 1 / 1.000 LPC stokunun hacmi ve 1/50 50x enerji karışımı hacmi ile Ek sitoplazma. Yavaşça karıştırın tüp ters. aşırı özü pipetlemeyin etmeyin.
    3. buz üzerinde özü tutmak ve en iyi sonuçlar için hazırlık 3 saat içinde kullanın.
(29 uyarlanmıştır) Demembranated X. laevis Sperm _title "> 2. Hazırlık

Not: Burada sunulan prosedür hacimleri en fazla 8 testislerin içindir.

  1. % 0.05 benzokain (% 10 benzokain stok etanol içinde hazırlanır ve kurbağa tankı su içinde% 0.05 kadar sulandırılmıştır), 4 ° C ila oda sıcaklığına kadar ılıması çıkarın. Uyutmak ve erkek X kurban 30 dakika - 20 Oda sıcaklığında benzokain çözeltisi kurbağa laevis. ve / veya başları kesilerek, incelenmesi ve mekanik uyarıya yanıt eksikliği ile, göğüs bölgesini hissederek kalp atışı yokluğunda ölümünü sağlamak.
  2. karın boyunca U-şekilli kesi yapmak. Sarı yağ organlarının tubulated kitle çıkarın. Böbreklerin üst kısmında, oval şekilli uzunluğu 29 1 cm'lik soluk pembe kitleleri olan testisler, bulun. testis tüketim ve kan ve diğer doku kaldırmak için kurutma kağıdı üzerine onları yuvarlayın.
  3. Tampon T. Kullanımında Tampon 1 ml testis kıymaya sıkı takılmış havaneli testisler yıkayınhomojen olana kadar 1.5 ml bir tüp içinde T (10 vuruş ya da daha fazla). Santrifüj 5-10 mini santrifüj sn ve doku büyük parça çıkarmadan, süpernatant toplamak. bir kez daha tekrar santrifüj ve süpernatantı toplamak.
  4. 15 ml plastik tüpe sperm içeren çözelti aktarın. sperm pelet, 16 ° C'de 10 dakika boyunca 1,411 x g hızında Tampon T Santrifüj 2 ml'lik bir toplam hacim artırma.
  5. Süpernatantı ve 16 ° C'de 10 dakika boyunca 1,411 x g hızında Tampon T Santrifüj 500 ul pelletini. Somatik ve kırmızı kan hücrelerinin pelet temizlemek için gereken şekilde bir veya iki kez yineleyin.
  6. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 100 ul Tampon T ve 300 ul Tampon S. kuluçkaya pelletini.
    Not: Tampon S demembranation sorumludur lizolesitin içerir.
  7. Tampon R üç cilt ekleyin (Kullanmadan önce taze hazırlanmış). tam olarak bir kez tüp ters çevirin. 16 ve 15 dakika boyunca 1,411 x g hızında santrifüj# 176; C.
  8. 400 ul Tampon R pelet yeniden süspanse edin ve daha sonra 16 ° C'de 15 dakika boyunca 1,411 x g hızında Tampon R. Santrifüj ilave 2 ml ekleyin.
  9. 50 ul Tampon T pelletini
  10. Bir hemasitometre bu seyreltme uygula 9 ul Tampon T. ile 1 ul demembranated sperm çekirdekleri sulandırmak. büyük bir 4 x 4 ızgara ince S şeklinde sperm çekirdeklerinin sayısını ve ul başına sperm çekirdekleri stoklar konsantrasyonunu elde etmek için bu sayıyı 100 ile çarpın.
  11. Bir 200x stok sonuçlanan Tampon T ul 100.000 sperm çekirdekleri, için stokunu. 5 ul alikotları - 3 hazırlayın. -80 ° C'de, sıvı azot ve mağaza flaş dondurma.

3. Nükleer Meclisi

  1. 1.5 ul 35.5 mM sikloheksimid (nihai konsantrasyon ~ 0.5 mM) ile, 6 ul 20x kalsiyum stok çözelti (son konsantrasyon ~ 0.6 mM) ve 0.7 ul 200x sperm (yumurta özü 100 ul Supplement nihai konsantrasyon ~ 700Sperm çekirdek / ml). Reaksiyon hacmi yukarı veya aşağı ölçeği gerektiği gibi. Çevirin ya da hafifçe karıştırın dokunun.
    Not: interfaz içine metafaz sağlanıncaya Özü nükleer montaj için daha sağlam ve güvenilir bir platform sağlar.
  2. 90 dakika boyunca 20 ° C - 16 ° C'deki bir su banyosu içinde inkübe edin. yavaşça çekirdekler özü içinde asılı kalmasını sağlamak için her 15 dakikada dokunarak karıştırın.
  3. aşağıdaki gibi bir kabak hazırlayarak 45 dakika nükleer montaj ilerlemeyi izlemek.
    1. Pipet 2, bir cam slayt üzerine ekstresi il, 2 ul çekirdeği düzeltme ekleyin.
    2. 22 mm 2 lamel ile Yerleşimi. 100X amaçlarını ve bir DAPI filtre - su, yağ veya hava 20 kullanarak bir Epifloresans mikroskop görüntüsü.
      Not: Çekirdekler parlak alan görüntüleme ile görüntülenmiştir ancak floresan görselleştirmek için çok daha kolay bir şekilde karşılanabilmektedir.
    3. -80 ° C'de, sıvı azot ve mağaza hemen çekirdekleri veya flaş dondurma alikotları kullanın.
      Not: çekirdek pr% 4 gliserol eklemekendi bütünlüğünü korumak için yardımcı olabilir donma IOR. Dondurulmuş çekirdekler ancak donma süreci kesintiye ya da daha fazla yapısal kırılgan çekirdekler yol açabilir, yine genel olarak uygulanabilir ve nükleer ithalat yeteneğine sahiptirler. Çekirdekler donma sonra bir yıla kadar kullanılabilir.

X'in 4. hazırlanması leavis Embriyo Özü

  1. Kadın X'i indükleyin 1.1 ve 1.2 açıklandığı gibi yumurtalarını bırakmak için kurbağaları laevis.
  2. Erkek, X testisler Yalıtmak 2.2'de açıklandığı gibi kurbağa laevis. Cam 35 x 10 mm Petri kabı, penisilin ve streptomisin, 50 IU / ml ile takviye edilmiş L15 ortamı testislerin daldırın. en fazla iki hafta süreyle 4 ° C'de saklayın.
  3. Toplamak ve yumurta döllemek.
    1. Bir bardak yeniden kullanılabilir Petri kabı üzerinde kurbağa tutarak taze koydu yumurta toplamak ve alt sırt kloakanın yakın hafif bir basınç uygulayarak yumurtlama teşvik. Şişirilmiş bir karın ve req yol yaralanmaya neden olabilir çok sert kurbağa sıkarakötenazi 29 uiring.
    2. Yaklaşık 45 ° 'lik açıyla çanak Prop, yumurta, yemeğin kenarından toplamak tüm aşırı tampon kaldırmak ve zorlukla yumurta karşılamak için yeterli 1 / 3x MMR eklemenize olanak sağlar. toplama 15 dakika içinde yumurta döller.
    3. ıslatarak yumuşatmak ve Barth'ın Salin (Yüksek Tuz MBS) Modifiye yüksek tuz 500 ul ile 1.5 ml tüp içinde bir testisin 1/4 homojenize etmek sıkıca monte havaneli kullanın. daha sonra 1 / 3x MMR yumurta sel, 20 dakika - yumurta yumuşatılır testisler ekleyin ve 15, oda sıcaklığında meydana getirmek üzere, döllenme için izin verir.
      Not: Testislerin Etkinliği fazla bir hafta boyunca saklanan testis kullanırken bu nedenle daha fazla testis dokusu başarılı döllenme için gerekli olabilir, saklama süresi azalır.
    4. ezilmiş teste ilave edildikten sonra 30 dakika - genellikle yaklaşık 20 yukarı bakacak koyu pigmentli hayvan kutup kasılması kontrol ederek ve onların hayvan direkleri embriyoların dönmesi ile döllenme onaylayıns. ilk hücre bölünmesi 90 dakika içinde meydana bekliyoruz.
    5. Hızla komşu embriyolarda ölümü neden olacak gibi, parçalanmış, özenle ölü (beyaz ve kabarık veya sarısı ve pigmentin düzensiz dağılımı) kaldırmak geniş bir delik cam pipet kullanarak, ya da döllenmemiş yumurta (yani, bölünmüş değil).
    6. Her 1 -% 3 sistein 1/3 x MMR içinde eritildi ve 10 N KOH ile pH 7.9 ayarlanır - dejelly 2 embriyolar 2.5 saat sonra gübreleme. 4 dk - Her 3 iki tampon değişiklikleri gerçekleştirmek. sistein tüm izlerini silmek için 1 / 3x MMR 10 kısa değişiklikler - iyice 6 ile embriyolar yıkayın.
      Not: Dejellied embriyolar bir vitellin membran ve dejellied yumurta gibi kırılgan değildir.
  4. Geniş delik cam pipet kullanarak, 16 ° C taze 1 / 3x MMR içeren Petri sağlıklı döllenmiş (yani bölünmüş) embriyo transferine ve yavaş gelişme tercih edilir onları, oda sıcaklığında istenilen aşamaya geliştirmek ya da izin verir. Ölü ya da ly kaldırmak için devam ediyorsed embriyolar ilk bölümü ya da beyaz kabarık bir görünüm eksikliği ile gösterilir.
  5. Blastopore neredeyse tam kapanması için kontrol ederek ve referans materyalleri 24 mevcut sahnelenen embriyolar çizimlere karşılaştırarak embriyoların sahne doğrulayın.
    Not: Embriyolar evre 11.5 ulaşacak 16 ° C'de kültüre - Yaklaşık 12 saat 12.
  6. Geç interfaz embriyolar tutuklama, oda sıcaklığında 1 saat süre ile 0.5 mM sikloheksimid ile desteklenmiş taze 1 / 3x MMR 12 embriyo - evre 11.5 inkübe edin.
  7. Geniş delik cam veya plastik pipet 15 (tercihen 30 veya daha fazla) en az bir mikrosantrifüj tüp interfaz-tutuklanan embriyolar ile transfer.
    Not: 15 embriyo özü yaklaşık 20 ul üretmek için yeterlidir. Gerektiği gibi büyütmek.
  8. LPC stokunun 1 ul ile desteklenmiş 1 ml yumurta lizis tamponu (ELB) ekleyin. Yavaşça, embriyoların yıkayın embriyolar tüp altına düşmesine izin ve tampon kaldırmak için ters çevirin. Bu yıkama adımı iki kez daha tekrarlayın. </ Li>
  9. Elb 500 ul artı LPC stokunun 0.5 ul, 19.7 mM sikloheksimid 5 ul, ve D sitokalasin 35.5 mM 5 ul içinde süspanse embriyolar (aktin polimerizasyonunu inhibe etmek için). Bir masa mikrosantrifüj 1 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin.
  10. Fazla tamponu çıkarın ve iyice embriyolar ezmek için bir havaneli kullanın. 10,000 x g'de 10 dakika ve 16 ° C'de bir sallanma kepçeli rotor içinde santrifüjleyin.
  11. 200 ul bir pipet ucu ile üst lipid tabakası ile delikler. Temiz bir 200 ul pipet ucu ile, uygun bir büyüklükte tüp orta sitoplazmik kehribar renkli katmanı kaldırmak.
  12. 50x enerji karışımını hacmi (ATP rejenerasyon sistemi sağlamak için) 1/50 ile Ek embriyo özü, 1/100 35.5 mM cyclohexamide, D cytochalasin 19.7 mM 1/500 hacim ve 1 / 1.000 hacmi hacmi LPC stok.
  13. özü endojen embriyonik çekirdekleri görselleştirmek için 3.3'de açıklandığı gibi bir kabak hazırlayın.
    Not: Embriyo ekstresi ile donmuş olabilir Bu noktada, endojen çekirdekler. Kısım -80 ° C'de dondurma / çözülme döngüleri ve mağaza azaltmak için.
  14. 1/50 50x enerji karışımı hacmi, 1/100 ihtiva Elb bir eşit hacmi ile özü seyreltin, embriyo ekstreden, çekirdeklerini uzaklaştırmak üzere 35.5 mM cyclohexamide hacmi, 1/500 D sitokalasin 19.7 mM hacmi ve 1 / 1.000 LPC stok hacmi. 16 ° C'de 15 dakika boyunca 17,000 x g'de bir sallanan kepçeli rotor içinde santrifüjleyin.
  15. üstündeki kalan lipid önlemek için dikkatli olmak süpernatant toplayın. tüpün alt kısmında topak haline çekirdekleri rahatsız etmeyin. En çekirdekleri çıkarılmış olmasını sağlamak için 3.3'de açıklandığı gibi bir kabak hazırlayın. -80 ° C de taze özü veya kısım ve mağaza kullanın.
  16. termal devir cihazı aracılığıyla 30 dakika boyunca 56 ° C'de ekstrenin 100 ul tam bölünen miktarları, - Kontrol deneylerinde, ısı 30 embriyo özü inaktive ısı. ısı ile inaktive özü kullanmadan önce oda sıcaklığına dönmesi için izin verin.
Deneyi ve immünfloresan Daralan _title "> 5. Nükleer

  1. 1.5 ml bir tüp içinde 1 mi Elb bölgesindeki prefabrik çekirdeklerin 150 ul - 25 seyreltilerek yumurta özü monte çekirdekleri izole edin. Bir masa mikrosantrifüj 4 ° C'de 3 dakika boyunca 1600 x g'de santrifüjleyin. tüpün alt kısmında çekirdeklerinin kırılgan pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, tamponu çıkarın.
  2. 5.1 kullanılan yumurta özü orijinal hacmine eşit embriyo özü bir hacimde çekirdekleri yeniden süspanse edin. uygun şekilde kullanın ELB veya kontrol reaksiyonları için ısı inaktive özü.
  3. Yavaşça pelet kırmak ve çekirdekleri tekrar süspansiyon tüp dokunun. 30 dakika - hafifçe her 15 karıştırmak için tüp dokunarak, 90 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Not: Nükleer daralma çoğu ilk 30 dakika içinde gerçekleşir.
  4. Bir kabak hazırlayarak nükleer daralma ilerlemesini izlemek.
    1. Pipet 2, bir cam slayt üzerine ekstresi il, 2 ul çekirdeği düzeltme ekleyin.
    2. 22 mm 2 ile Yerleşimi
  5. hemen öncesinde ELB oluşan fiksatif 500 ul,% 15 gliserol ve% 2.6 paraformaldehid ekleyerek çekirdekleri tekrar süspansiyon tüp dokunun. Hemen Invert ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca, bir döndürücü üzerinde tüp yerleştirin.
  6. yuvarlak alt plastik uçlar (tasarım ve istek üzerine şema) ile 15 ml'lik yuvarlak dipli cam tüpler donatım ile tüpler aşağı spin hazırlayın. Nükleer yastık tampon 5 ml ekleyin. plastik ucun üstündeki düz durduğundan emin olduktan sonra tüpe 12 mm dairesel lamel bırakın.
  7. Yavaşça geniş çaplı bir pipet ucu kullanılarak nükleer yastık üstünde sabit çekirdek içeren solüsyon katman. 1000 xg'de 15 dakika ve 16 ° C için sallanan bir kova rotor Santrifüj.
  8. tampon kaldırmak ve tüpün üstüne plastik parçayı çekmek için bir aspiratör kullanın. kapağın kenarını dikkat dikkatli olmak, ince forseps bir çift ile lamel çıkarınçekirdekler döndürülmüştür, bunun üzerine kayma. Soğuk metanol sonrası düzeltme oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (-20 ° C'de saklanan).
  9. Büyük bir plastik petri astar plastik parafin film kağıda kadar lamel çekirdek tarafı aktarın. su kaybını önlemek için çanak kenarı boyunca ıslak tek kullanımlık mendil yerleştirin.
  10. 10 sn - 5 sonra PBS-NP40 500 ul (1x PBS artı% 0.1 NP40) ve aspirat ile lamel çekirdekleri rehidrate.
  11. Dikkatle lamel üzerine PBS-% 3 sığır serum albümini (BSA) 75 ul tabaka. Oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 ° C engelleyebilir izin verin.
  12. Bloke etme çözeltisi çıkarın ve primer antikor ile inkübe (örneğin, çekirdek gözenek kompleks, 1 karşı mAb414: 1000) oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca PBS% 3 BSA içinde seyreltilmiştir. PBS-NP40 beş acil değişiklikler ile yıkayın.
  13. Oda sıcaklığında 1 saat için PBS% 3 BSA içinde seyreltilmiş sekonder antikor ile inkübe edin. PBS-NP40 beş acil değişiklikler ile yıkayın.
  14. tasarlamak10 ug / ml Hoechst oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS% 3 BSA içinde seyreltilmiştir. PBS-NP40 ile beş kez yıkayın. tüm aşırı tamponu çıkarın.
  15. 5 ul antifade montaj ortamı ile bir slayt üzerine lamel monte edin. şeffaf tırnak cilası ile mühür. Daha sonra görüntüleme için 4 ° C'de 100x hedefleri ya da mağaza - Görüntü hemen Epifloresans 20 ile mikroskop kullanılarak.
    Not: Daha önce 23 açıklandığı gibi kantifikasyonunu gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yumurta Özü içinde Çekirdek Meclisi

Bu protokolün ilk adımlar X hazırlamak için vardır laevis yumurta özü (Protokol 1) ve demembranated sperm çekirdekleri (Protokol 2). Bu reaktifler, sonra çekirdekleri de novo (Protokol 3) monte etmek için kullanılır. 1, bazı temsili verileri göstermektedir. kalsiyum ilavesi interfaz içine meiotically tutuklandı yumurta özü sürücüler ve sikloheksimid interfaz tutuklandı özü tutar. 30 haberi - reaksiyon başlangıcından sonra 45 dakika, başlangıçta ince S şeklinde sperm çekirdekleri sülük şeklinde kromatin kitlelere içine kalınlaştırmak başlamalıdır. bozulmamış bir çekirdeksel zar başarıyla oluşumu, GST-GFP-NLS (veriler gösterilmemiştir) ya da FG-tekrar kabul mAb414 kullanılarak çekirdek gözenek kompleks için ağız boyama ile bir floresan etiketli içe yük alma ve tutma ile değerlendirilebilir contaiNing nucleoporins (Şekil 1A). Nükleer montaj oluşur, sonra nükleer şekil daha yuvarlak olması gerektiğini ve nükleer zarf genişletir ve nükleer proteinler (Şekil 1B-C) ithal edilmektedir nükleer hacim artmalıdır. bozulmamış bir nükleer zarf veya nükleer büyümenin oluşumunu uyulmaması kalitesiz yumurta özü gösterir. Bu durumda, bu yumurta yeni bir parti ile yeniden başlatmak en iyisidir.

Embriyo Özü Endojen Çekirdeklerin çıkarılması
Bir sonraki adım, bir geç evre embriyo ekstresi (Protokol 4) hazırlamaktır. özü ve önceki çekirdeklerin giderilmesi için ilk hazırlanmasından sonra, bu ekstrenin küçük bir kısım bir Hoechst-lekeli kabak hazırlamak için uygundur. Birçok küçük embriyonik çekirdeklerin görselleştirme özü (Şekil 2A) hazırlanmasında başarı iyi bir göstergesidir. endojen embriyonik çekirdekler aşağı analysi müdahale gibis, seyreltme ve santrifüj ile çıkarılmasından sonra çekirdekleri ekstraktının bir tümbölenini kontrol etmek de önemlidir. İlk kabak ile karşılaştırıldığında, çok az çekirdek özü (Şekil 2B) bırakılmalıdır. Birçok çekirdekler hala mevcut varsa, santrifüj ikinci tur gereklidir.

Nükleer Daralan Deneyi
Şekil 3 nükleer küçülen tahlil için temsili sonuçlar (Protokol 5) gösterir. Ileri evre embriyo özü içinde yeniden süspanse yumurta özü çekirdekleri zaman (Şekil 3B) üzerinde küçülür. Deney için iyi bir negatif kontrol ısıyla inaktive (Şekil 3A) olmuştur embriyo özü ile çekirdekleri inkübe etmektir. çekirdekler ısı ile inaktive özü de küçültmek için başarısız olarak, bu işlenmemiş embriyo ekstresi ile küçülen nükleer gözlenen bazı güven ozmotik etkileri sonucu değil sağlar. Nükleer boyutu ölçüdegözlenen azalma yumurta özü çekirdeklerinin özellikle toplu yanı sıra embriyo özü kalitesine bağlı olarak değişir. Bizim tecrübelerimize göre, nükleer daralma her zaman, ancak farklı çekirdekleri ile bu deneyler birden çok kez tekrarlamak önemlidir ve testin doğasında değişkenlik ele özleri, (örneğin, 40'dan fazla farklı embriyo ekstrelerinde) görülmektedir. Şekil 4 şematik gösterir tüm protokol.

Şekil 1
Şekil X 1. Nükleer Meclisi gün Dersin laevis Yumurta Özü. Çekirdekler X de novo monte edildi çekirdek gözenek kompleks (NPC) (mAb414) de karşı bir antikor kullanılarak immünofloresans aynı reaksiyondan 3. alikotlan sabit ve görselleştirilmiştir Protokolü de tarif edildiği gibi, yumurta özü laevis: > A), 30 dk, b) 60 dakika, ve C) çekirdek tertibatının başlatılmasından 90 dakika sonra. Immünfloresans protokol ölçek çubuğu 25 mm. Protokolde 5. açıklanan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
X. Çekirdeklerin Şekil 2. Kaldırma Embriyo Özü laevis. X. A) önceden santrifüj çekirdeklerin çıkarılmasından sonra çekirdeklerin giderilmesi ve B): Protokol 4'te tarif edildiği gibi ekstrenin küçük bir kısım sabit ve Hoechst ile lekeli 12 embriyo - laevis embriyo özü aşamasından 11.5 elde edilmiştir. Ölçek çubuğu 25 mm.om / files / ftp_upload / 54173 / 54173fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. Temsilcisi Veri Nükleer Küçülen Testi gelen. Çekirdekler X de novo monte edildi rekombinant GFP-LB3 ile desteklenmiş laevis yumurta özü (nükleer lamina görselleştirmek için). Protokol 5'te tarif edildiği gibi, yumurta özü çekirdekler izole edilmiş ve aşama 11.5 yeniden süspansiyon haline getirildi - endojen embriyonik çekirdekleri kaldırılmış olan 12 embriyo özü. Canlı time-lapse görüntüleme 90 dakika boyunca 30 sn aralıklarla yapıldı. A) geç dönem embriyo ekstresi (LEE), ve B) ısı ile inaktive (HI) embriyo ekstresi: Şekil panelleri inkübe çekirdekleri için 6 dakika aralıklarla elde edilen görüntüleri göstermek. Zaman derslerden Görüntüler devamsoldan sağa. Ölçek çubuğu 46 farklı yumurta ve embriyo özlerinden 25 mikron. C) Nükleer daralma veridir. Barlar> 240 çekirdekleri için araçları göstermektedir. Hata çubukları standart sapma vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Testi Küçülen Nükleer Şekil 4. şematik. Her renkli kutu bir protokol temsil eder. Kırmızı X hazırlanmasını gösterir laevis yumurta özü (Protokol 1). Mavi demembranated X hazırlanmasını gösterir laevis sperm (Protokol 2). Pembe yumurta özü de novo nükleer tertibatını (Protokol 3) gösterir. Yeşil X hazırlanmasını gösterir leavis embriyo özü (Protokol 4). Menekşe nükleer s gösterirhrinking tahlil protokolü ve immünfloresans (Protokol 5). Bu rakamın bölümleri 23'ten yeniden edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

tampon adı tampon kompozisyon
Marc'ın Modifiye Ringer (MMR), 1 / 3x 33 mM NaCI, 0.7 mM KCI, 0.3 mM MgSO 4, 0.7 mM CaCl2, 1.7 mM HEPES, pH 7.4
Ekstre tampon maddesi (XB) ', 10x 1 M KCI, 1 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, 500 mM sükroz, 100 mM HEPES, pH 7.8 (pH 4 ° C'de saklanır, 10 N KOH ile ayarlanmış)
tampon B Sistein 0.8x XB içinde çözülmüş% 4 (soğuk GKD 2 O, Ph, bir ile hazırlanan10 N NaOH ile 7.8'e konuma getirilmiş olması gerekir)
Tampon Cı Soğuk GKD 2 O 900 ml ile 10x XB arasında 100 m Mix
tampon D Tampon C artı 5 mM EGTA, 800 uM MgCl2
LPC stok, 1,000x 10 mg / ml löpeptin, pepstatin, ve DMSO içinde çözülmüş kimostatin her biri (-20 ° C'de parçalar halinde saklanır)
tampon E 100 ml Tampon D artı 100 ul LPC stok
Enerji karışımı, 50x 190 mM kreatin fosfat disodyum, 25 mM ATP disodyum tuzu, 25 mM magnezyum klorür
Tampon T 15 mM PIPES, 15 mM NaCI, 5 mM EDTA, 7 mM MgCI2, 80 mM KCI, 0.2 M sükroz, pH 7.4 (filtre ile sterilize edildi ve 4 ° C'de saklanır)
tampon S Maltoz, 20 mM ve Tampon T hazırlanan lisolesitin% 0.05
Tampon R Tampon T artı% 3 sığırserum albümin
Kalsiyum stok solüsyonu, 20x 10 mM CaCl2, 0.1 M KCI, 1 mM MgCl2 (20 ° C'de saklanan)
Çekirdek düzeltme 125 p, l 2 M sukroz, pH 7.9 12.5 ul, 1 M HEPES, 250 ul% 37 formaldehit, 112 ul GKD 2 O, 0.5 ul 10 mg / ml Hoechst (iki hafta boyunca oda sıcaklığında depolandı)
Modifiye Barth'ın Salin (MBS), 10x 880 mM NaCI, 10 mM KCI, 50 mM HEPES, 25 mM NaHCO 3, pH 7.8
Yüksek tuz MBS 1x MBS artı 0.7 mM CaCl2 ve 20 mM NaCI
Yumurta liziz tamponu, elb 250 mM sakaroz, 50 mM KCI, 2.5 mM MgCI2, 10 mM HEPES, pH 7.8
Nükleer yastık tampon 1x XB, 0.2 M sukroz,% 25 gliserol (filtre ile sterilize edildi ve 4 ° C'de saklandı)

Tablo 1. tamponlar. Bu protokolde belirtilen tüm tampon bileşimleri, bu tabloda açıklanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG Molecular Probes A10037
ATP disodium salt Sigma Aldrich A2383
Benzocaine Sigma Aldrich E1501
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059
CaCl2 Sigma Aldrich C3306
Centrifuge Beckman J2-21M
Centrifuge rotor Beckman JS 13.1
chymostatin Sigma Aldrich C7268
creatine phosphate disodium Calbiochem 2380
cycloheximide Sigma Aldrich C6255
cytochalasin D Sigma Aldrich C8273
disposable wipes (kimwipes) Sigma Aldrich Z188956
L-cysteine Sigma Aldrich W326306
EGTA Sigma Aldrich E4378
Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
Glass crystallizing dish (150 x 75 mm) VWR 89090-662
Glycerol Macron 5094-16
HEPES Sigma Aldrich H4034
Hoechst - bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma Aldrich B2261
HCG - Human Chorionic Gonadotropin  Prospec hor-250-c
L15 Media Sigma Aldrich L4386
leupeptin Sigma Aldrich L2884
Lysolecithin Sigma Aldrich L1381
mAb414 Abcam ab24609
MgCl2 EMD MX0045-2
MgSO4 Sigma Aldrich M9397
Maltose Sigma Aldrich M5885
NP40 BDH 56009
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin + Streptomycin Sigma Aldrich Pp0781
pepstatin Sigma Aldrich P5318
PIPES Sigma Aldrich P6757
Plastic paraffin film (parafilm) Sigma Aldrich P7793
KCl Sigma Aldrich P9541
KH2PO4 Mallinckrodt 70100
KOH Baker 5 3140
PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin Prospec hor-272-a
NaCl Sigma Aldrich S3014
NaHCO3 Fisher BP328
Na2HPO4 EMD SX0720-1
NaOH EMD SX0590
Pestle Thomas Scientific 3411D56
Round bottom glass tubes, 15 ml Corex 8441
Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) ThermoFisher A10037
sucrose Calbiochem 8550
thermal cycler Bio-Rad T100
Ultracentrifuge Beckman L8-80M
Ultracentrifuge rotor Beckman SW 50.1
Vectashield (anti-fade mounting medium) Vector H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conklin, E. Cell size and nuclear size. J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).
  2. Wilson, E. B. The Cell in Development and Heredity. The Macmillan Company. 727-733 (1925).
  3. Levy, D. L., Heald, R. Nuclear size is regulated by importin alpha and Ntf2 in Xenopus. Cell. 143, (2), 288-298 (2010).
  4. Chan, Y. H., Marshall, W. F. Scaling properties of cell and organelle size. Organogenesis. 6, (2), 88-96 (2010).
  5. Walters, A. D., Bommakanti, A., Cohen-Fix, O. Shaping the nucleus: Factors and forces. J Cell Biochem. 113, (9), 2813-2821 (2012).
  6. Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. J Cell Sci. 122, (Pt 10), 1477-1486 (2009).
  7. Edens, L. J., White, K. H., Jevtic, P., Li, X., Levy, D. L. Nuclear size regulation: from single cells to development and disease. Trends Cell Biol. 23, (4), 151-159 (2013).
  8. Jevtic, P., Edens, L. J., Vukovic, L. D., Levy, D. L. Sizing and shaping the nucleus: mechanisms and significance. Curr Opin Cell Biol. 28, 16-27 (2014).
  9. Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of intracellular scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
  10. Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation. Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).
  11. Jevtic, P., Levy, D. L. Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing. Curr Biol. 25, (1), 45-52 (2015).
  12. Hara, Y., Iwabuchi, M., Ohsumi, K., Kimura, A. Intranuclear DNA density affects chromosome condensation in metazoans. Mol Biol Cell. 24, (15), 2442-2453 (2013).
  13. Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nat Rev Cancer. 4, (9), 677-687 (2004).
  14. Jevtic, P., Levy, D. L. Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer. Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).
  15. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12, (3), 196-209 (2012).
  16. Blom, J. H., Ten Kate, F. J., Schroeder, F. H., van der Heul, R. O. Morphometrically estimated variation in nuclear size. A useful tool in grading prostatic cancer. Urol Res. 18, (2), 93-99 (1990).
  17. Dey, P. Cancer nucleus: morphology and beyond. Diagn Cytopathol. 38, (5), 382-390 (2010).
  18. Cross, M. K., Powers, M. A. Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts. Dis Model Mech. 2, (11-12), 541-547 (2009).
  19. Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M., Rapoport, T. A. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124, (3), 573-586 (2006).
  20. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  21. Edens, L. J., Levy, D. L. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. John Wiley & Sons, Inc. 325-345 (2014).
  22. Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8, (1), a019166 (2016).
  23. Edens, L. J., Levy, D. L. cPKC regulates interphase nuclear size during Xenopus development. J Cell Biol. 206, (4), 473-483 (2014).
  24. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). 2nd edn, North-Holland Publishing Company. (1967).
  25. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30, (3), 687-696 (1982).
  26. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30, (3), 675-686 (1982).
  27. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  28. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nat Protoc. 1, (5), 2305-2314 (2006).
  29. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).
  30. Khan, M. A., et al. Quantitative alterations in nuclear structure predict prostate carcinoma distant metastasis and death in men with biochemical recurrence after radical prostatectomy. Cancer. 98, (12), 2583-2591 (2003).
  31. Tan, P. H., Goh, B. B., Chiang, G., Bay, B. H. Correlation of nuclear morphometry with pathologic parameters in ductal carcinoma in situ of the breast. Mod Pathol. 14, (10), 937-941 (2001).
  32. Zeimet, A. G., et al. DNA ploidy, nuclear size, proliferation index and DNA-hypomethylation in ovarian cancer. Gynecol Oncol. 121, (1), 24-31 (2011).
  33. Theerthagiri, G., Eisenhardt, N., Schwarz, H., Antonin, W. The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex. J Cell Biol. 189, (7), 1129-1142 (2010).
  34. Wuhr, M., et al. Evidence for an upper limit to mitotic spindle length. Curr Biol. 18, (16), 1256-1261 (2008).
  35. Loughlin, R., Wilbur, J. D., McNally, F. J., Nedelec, F. J., Heald, R. Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus. Cell. 147, (6), 1397-1407 (2011).
  36. Wilbur, J. D., Heald, R. Mitotic spindle scaling during Xenopus development by kif2a and importin. eLife. 2, e00290 (2013).
  37. Kieserman, E. K., Heald, R. Mitotic chromosome size scaling in Xenopus. Cell Cycle. 10, (22), 3863-3870 (2011).
  38. Maresca, T. J., Freedman, B. S., Heald, R. Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts. J Cell Biol. 169, (6), 859-869 (2005).
  39. MacCallum, D. E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B. Mol Biol Cell. 13, (1), 25-39 (2002).
  40. Goehring, N. W., Hyman, A. A. Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components. Curr Biol. 22, (9), R330-R339 (2012).
  41. Du Toit, A. Development: Honey, I shrunk the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, (10), 633 (2014).
  42. Buchner, K. The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus. J Cancer Res Clin Oncol. 126, (1), 1-11 (2000).
  43. Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. Protein kinase C, an elusive therapeutic target. Nat Rev Drug Discov. 11, (12), 937-957 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics