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Biology

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Edens, L. J., Levy, D. L. A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation. J. Vis. Exp. (114), e54173, doi:10.3791/54173 (2016).

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Abstract

Uma questão fundamental em biologia celular é como tamanhos de células e organelas são regulados. Tem sido desde há muito reconhecido que o tamanho do núcleo geralmente escalas com o tamanho da célula, nomeadamente durante a embriogénese, quando ocorrer uma redução dramática tanto na célula e tamanhos nucleares. Mecanismos de regulação tamanho nuclear são em grande parte desconhecido e pode ser relevante para o cancro onde o tamanho nuclear alterada é um parâmetro de diagnóstico e prognóstico chave. In vivo abordagens para identificar reguladores tamanho nuclear são complicados pela natureza essencial e complexo da função nuclear. A abordagem in vitro descrito aqui para estudar o controlo tamanho nuclear aproveita as reduções de tamanho normal nucleares que ocorrem durante o desenvolvimento de Xenopus laevis. Em primeiro lugar, os núcleos são montados em X. laevis extracto de ovo. Em seguida, esses núcleos são isoladas e novamente suspensas em citoplasma de embriões de fase tardia. Depois de um período de 30 - 90 min de incubação, a área de superfície nucleardiminui em 20 - 60%, proporcionando um ensaio útil para identificar componentes citoplasmáticos presentes em embriões de fase tardia que contribuem para o desenvolvimento de escalonamento tamanho nuclear. Uma das principais vantagens desta abordagem é a relativa facilidade com que os extractos de ovos, bem como de embriões pode ser manipulado bioquimicamente, permitindo a identificação de novas proteínas e actividades que regulam o tamanho nuclear. Tal como acontece com qualquer uma abordagem in vitro, a validação dos resultados de um sistema in vivo é importante, e micro-injecção de X. embriões laevis é particularmente apropriado para estes estudos.

Introduction

Os tamanhos de organelos celulares tipicamente dimensionado de acordo com o tamanho da célula, e esta tem sido talvez mais bem documentadas para o dimensionamento do tamanho dos núcleos com tamanho de célula de 1-10. Isto é particularmente verdadeiro durante a embriogénese e diferenciação celular, quando reduções dramáticas em ambos celular e tamanho nuclear são frequentemente observados 11,12. Além disso, o tamanho nuclear alterado é um parâmetro chave no diagnóstico e prognóstico do cancro 13-17. Mecanismos que contribuem para a regulamentação tamanho nuclear são pouco conhecidos, em parte devido à complexidade e à natureza essencial da estrutura e função nuclear. O método aqui descrito foi desenvolvido como um ensaio in vitro para o tamanho nuclear de escala que é propício à manipulação bioquímica e a elucidação dos mecanismos de regulação tamanho nuclear.

Xenopus laevis extrato de ovo é um sistema bem estabelecido de recapitular e estudar processos celulares complexos em um in vitro 18-22. Uma vantagem chave do sistema extracto é que X. laevis extratos de ovos representam um citoplasma quase não diluído cuja composição pode ser facilmente alterado, por exemplo, através da adição de proteínas recombinantes ou imunodepleção. Além disso, é capaz de manipular processos essenciais através do emprego de tratamentos que poderiam ser letal num contexto in vivo. Modificações do procedimento de extracto de ovo permitir o isolamento de extratos de X. laevis embriões em vez de ovos, e estes extractos de embriões são igualmente passíveis de manipulação bioquímica 23. Durante X. laevis desenvolvimento, o embrião fertilizado de uma única célula (~ 1 mm de diâmetro) é submetido a uma série de doze divisões celulares rápidas (etapas 1-8) para gerar vários milhares de 50 μm de diâmetro e células menores, chegando a um estágio de desenvolvimento denominado transição midblastula (MBT) ou estágio agosto 24-26. O MBT é caracterizado pelo início da transcrição zigótica, migração celular, divisão celular assíncronos, aquisição de fases de hiato, e estabelecimento de tamanhos de estado estacionário nucleares em vez de expansão nuclear contínuo como no embrião pré-MBT. De estágio 4 a gastrulação (estádios 10,5-12), o volume de núcleos individuais, diminui em mais de 10 vezes 11.

Aqui, o objetivo é identificar os mecanismos responsáveis ​​por estas reduções no tamanho nuclear durante a progressão do desenvolvimento. A abordagem é a primeira a montar núcleos em X. laevis extrato de ovo e isolar os núcleos do citoplasma do ovo / extract. Estes núcleos são então ressuspensas em citoplasma de embriões de fase de gástrula tardia. Após um período de incubação, os núcleos de extracto de ovo tornam-se menores no final de extrato fase de embrião. Nós fundamentado que este woulseria um ensaio útil para a identificação de componentes citoplasmáticos presentes em embriões em estágio final que contribuem para o desenvolvimento de escala de tamanho nuclear. Utilizando este ensaio, juntamente com a validação in vivo, demonstrou que a proteína quinase C (PKC) contribui para a redução do desenvolvimento em tamanho nuclear em X. laevis 23.

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Protocol

Todos os procedimentos e estudos de Xenopus foram realizadas em conformidade com o Guia NRC para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório 8ª edição. Protocolos foram aprovados pela Universidade de Wyoming Institutional Animal Care e Use Committee (Assurance # A-3216-01).

1. Preparação de X. Extrato laevis Egg (adaptado de 27,28)

  1. Prime X. feminina laevis rãs um mínimo de três dias e um máximo de duas semanas antes da coleta de ovos com um único IU injeção de gonadotrofina de égua prenhe (PMSG) 100.
  2. Um dia antes do experimento, injetar rãs imunizadas com 800 UI de gonadotrofina coriônica humana (HCG) e lugar a 16 ° C em 1 L por sapo de 1 / 3x toques modificados do Marc (MMR). Ver Tabela 1 para todas as composições de tampão.
    Nota: Algumas rãs não põem ovos ou põem ovos de má qualidade. Normalmente 2 - 3 rãs são injetados para garantir pelo menos um sapo vai colocar sufficiennúmeros t de ovos de boa qualidade. O sapo média põem ovos suficientes para produzir pelo menos 1 ml de extrato de ovo.
  3. Prepare 1 G 1 / MMR 3x com água desionizada destilada fria (ddH2O), 500 ml de tampão B, 1 L de tampão C, 500 ml de tampão D e 100 mL de tampão E.
  4. Transferência puseram ovos para um prato de cristalização de vidro (150 x 75 mm). Usando um plástico Pasteur pipeta com a ponta cortada, fazenda fora inchado activado ovos brancos ou ovos lisadas. reter apenas ovos com pólos animais escura distintos e iguais e pólos vegetais brancos.
  5. Preparar 13 x 51 mm tubos de centrifugação com 1 ml de tampão E suplementado com 355 | iM de citocalasina D adicionado imediatamente antes da utilizao no passo 1.7.
  6. Dejelly e lavar os ovos.
    1. Lavar os ovos brevemente com frio 1/3 x MMR em um copo de tamanho adequado, mudando o tampão 3 - 4 vezes.
    2. Retire as peles de geléia de os ovos de incubação com tampão B. Isso vai demorar 3-10 min. Como os casacos de geléia nublados são liberados a partir do ovos, mudar o tampão.
      Nota: Dejellying é completa quando os ovos aparecem bem embalado no canto do prato quando inclinado e pólos vegetais são orientados para baixo. Os ovos são muito mais frágeis após dejellying, por isso não incubar os ovos com tampão B durante mais de lavagens necessárias e posteriores precisam ser realizadas com muito cuidado.
    3. Lavar os ovos brevemente com 3 - 4 mudanças de tampão C.
    4. Lavar os ovos brevemente com 2 mudanças de tampão D.
    5. Lavar os ovos brevemente com 2 mudanças de tampão E.
  7. Preencha tubos de centrífuga com ovos usando uma ampla pipeta furo de vidro ou conta-gotas de plástico. Aspirar off tampão excesso. Para embalar os ovos e remover tanto tampão quanto possível, de centrifugação em rotor basculante a 212 xg durante 60 seg e em seguida a 478 xg durante 30 seg. Aspirar off tampão excesso.
    Nota: É importante remover tanto quanto possível o tampão em excesso neste passo para garantir o extracto de ovo é minimamente diluídos.
  8. Numa oscilante rotor de cesto, ultracentrífuga sob vácuo durante 15 min a 12000 xg e 4 ° C para esmagar ovos aberta e separar-se em camadas diferentes, com o citoplasma sendo a camada de cor âmbar no meio. Remover tubos de centrífuga e coloque imediatamente em gelo.
  9. Recolher o extracto.
    1. Utilizando uma agulha de calibre 18 e seringa, perfurar o tubo de centrifugação imediatamente acima da camada pigmentada escura na parte inferior do tubo e remover a camada de cor âmbar citoplasmática meio. Não coletamos nenhuma da camada lipídica superior. Recolhe-se o citoplasma em um tubo adequadamente dimensionado.
      Nota: Geralmente, um sapo produz pelo menos 1 ml de extrato.
    2. citoplasma suplemento com 1 / 1.000 o volume de 19,7 mM citocalasina D, 1 / 1.000 do volume de estoque LPC, e 1/50 do volume de 50x mix de energia. Inverta suavemente o tubo para misturar. Não excessivamente pipete o extrato.
    3. Manter o extracto sobre gelo e usá-lo dentro de 3 horas de preparação para obter os melhores resultados.
_title "> 2. Preparação de Demembranated Sperm X. laevis (adaptado de 29)

Nota: Os volumes de procedimentos aqui apresentados são para até 8 testículos.

  1. Remover 0,05% benzocaína (estoque benzocaína a 10% preparada em etanol e diluiu-se a 0,05% na água do tanque da rã) a partir de 4 ° C e aquecer até à temperatura ambiente. Anestesiar e sacrifício masculino X. laevis rãs em solução benzocaína à temperatura ambiente durante 20 - 30 min. Certifique-se de morte por ausência de batimentos cardíacos por examinar e sentir a área do peito, pela falta de resposta à estimulação mecânica, e / ou por decapitação.
  2. Faça uma incisão em forma de U ao longo do abdómen. Retire a massa em tubo de corpos gordos amarelos. Na parte superior dos rins, testículos localizar as massas, que são cor de rosa pálido cerca de 1 cm de comprimento 29 de forma oval. Extirpar os testículos e juntá-las em papel absorvente para remover o sangue e outros tecidos.
  3. Lavar testículos em tampão T. A utilização de um pilão apertado equipado para picar testículos com 1 ml de tampãoT em um tubo de 1,5 ml até ficar homogénea (10 golpes ou mais). Centrifugar 5 - 10 segundos num mini-centrifugador e recolher o sobrenadante, a remoção de grandes pedaços de tecido. Repetir a centrifugação mais uma vez e recolher o sobrenadante.
  4. Transferir a solução contendo esperma a um tubo de plástico de 15 ml. Aumenta o volume a um total de 2 ml com tampão T. Centrifugar a 1.411 xg durante 10 min a 16 ° C para sedimentar o esperma.
  5. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 ul de tampão T. Centrifugar a 1.411 xg durante 10 min a 16 ° C. Repetir esta etapa uma vez ou duas vezes como necessário para limpar o pelete de glóbulos vermelhos e somáticas.
  6. Ressuspender o sedimento em 100 ul de tampão T e 300 ul de tampão de S. incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
    Nota: Tampão S contém a lisolecitina, que é responsável pela demembranation.
  7. Adicione três volumes de tampão R (preparada antes da utilização). Inverta tubo exatamente uma vez. Centrifugar a 1.411 xg durante 15 min a 16 &# 176; C.
  8. Ressuspender o sedimento em 400 ul de tampão R e, em seguida, adicionar um adicional de 2 ml de tampão de R. Centrifugar a 1.411 xg durante 15 min a 16 ° C.
  9. Ressuspender o sedimento em 50 ul de tampão T.
  10. Diluir 1 mL demembranated núcleos de esperma com 9 ul de tampão T. Aplique esta diluição para um hemocitômetro. Contar o número de núcleos finas de esperma em forma de S em uma grande grade 4 x 4, e multiplicar esse número por 100 para obter a concentração das ações em núcleos de esperma por mL.
  11. Diluir o estoque para 100.000 núcleos de esperma por ul com tampão de T, resultando em um estoque 200x. Preparar 3 - 5 mL alíquotas. congelamento de flash em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C.

3. Montagem Nuclear

  1. Suplemento 100 ul de extracto de ovo com 1,5 mL de ciclo-heximida 35,5 mM (concentração final de ~ 0,5 mM), 6 ul de 20x solução de partida de cálcio (concentração final de ~ 0,6 mM), e 0,7 ul 200x esperma (concentração final ~ 700esperma núcleos / uL). Dimensionar o volume de reação cima ou para baixo, conforme necessário. Inverter ou bata suavemente para misturar.
    Nota: Extrato de um ciclo de metaphase em interfase fornece uma plataforma mais robusta e confiável para a montagem nuclear.
  2. Incubar em um banho de água a 16-20 ° C durante 90 min. Misturar batendo suavemente a cada 15 min para assegurar núcleos permanecem suspensas no extracto.
  3. Monitorar o progresso do conjunto nuclear a 45 min através da preparação de uma polpa como segue.
    1. Pipeta de 2 l de extracto numa lâmina de vidro e adicionar 2 ul correção núcleo.
    2. Overlay com uma lamela de 22 mm2. Imagem em um microscópio de epifluorescência, utilizando água, óleo ou ar 20 - objetivos 100X e um filtro DAPI.
      Nota: Os núcleos podem ser visualizadas por imagiologia de campo brilhante, mas são muito mais fáceis de visualizar por fluorescência.
    3. Use núcleos imediatamente ou alíquotas de flash congelamento em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C.
      Nota: A adição de 4% de glicerol ao pr núcleosIOR ao congelamento pode ajudar a manter a sua integridade. núcleos congelados são geralmente ainda viável e capaz de importação nuclear, no entanto, o processo de congelamento pode conduzir a núcleos frágeis rompidas ou mais estruturalmente. Os núcleos até um ano após a congelação pode ser usado.

4. Preparação de X. laevis Extrato de embrião

  1. Induzir X. feminina laevis rãs põem ovos como descrito em 1.1 e 1.2.
  2. Isolar testículos de X. masculino rãs laevis, conforme descrito em 2.2. Submerge testículos em meios L15 suplementado com 50 UI / ml de penicilina e estreptomicina, em um vidro de 35 x 10 mm numa caixa de Petri. Armazenar a 4 ° C por até duas semanas.
  3. Recolha e fertilizar ovos.
    1. Recolher ovos frescos, mantendo rãs sobre um vidro reutilizável placa de Petri e promover a postura de ovos, aplicando pressão suave para a parte inferior das costas perto da cloaca. Espremendo o sapo demasiado duro pode resultar em lesões, levando a um abdômen inchado e requiring eutanásia 29.
    2. Prop o prato a um ângulo de aproximadamente 45 °, para recolher ovos permitir na borda do prato, remover todo o excesso de tampão, e adicionar suficiente um / 3x MMR para cobrir apenas os ovos. Fertilizar os ovos dentro de 15 min após a colheita.
    3. Usar um pilão firmemente ajustado para macerar e homogeneizar 1/4 de um testículo em um tubo de 1,5 mL com 500 uL de elevado teor de sal de modificação salina de Barth (elevado teor de sal MBS). Adicionar testículos maceradas para os ovos e para permitir que a fertilização ocorra à temperatura ambiente durante 15 - 20 min, depois inundar ovos com 1 / 3x MMR.
      Nota: Eficácia dos testículos diminui com o tempo de armazenamento, por conseguinte, mais tecido testículos pode ser necessário para a fertilização bem sucedida quando se utiliza testículos que foram armazenados durante mais de uma semana.
    4. Confirmar fertilização através da verificação de contracção do polo animal pigmentada escura e pela rotação dos embriões com os seus pólos animais voltado para cima, geralmente cerca de 20 - 30 min após a adição de Teste esmagados. Espere a primeira clivagem celular para ocorrer dentro de 90 min.
    5. Usando uma ampla pipeta furo de vidro diligentemente remover mortos (branco e inchado ou distribuição desigual de gema e pigmento), lise, ou ovos não fertilizados (ou seja, não clivada), como eles vão rapidamente induzir a morte em embriões vizinhos.
    6. Em qualquer lugar 1-2,5 horas após a fertilização, dejelly embriões em 2-3% de cisteína dissolvido em 1/3 x MMR e ajustada a pH 7,9 com 10 N de KOH. Realizar duas mudanças de tampão que são cada 3-4 min. Lave bem os embriões com 6 - 10 breves mudanças de 1 / 3x MMR para remover todos os vestígios de cisteína.
      Nota: os embriões Dejellied têm uma membrana vitelina e não são tão frágil como ovos dejellied.
  4. Usando uma pipeta de largura furo de vidro, transferência (ou seja, clivado) Embriões fertilizados saudáveis ​​para uma placa de Petri contendo um fresco / 3x MMR e permitir-lhes a desenvolver para a fase desejada, à TA ou, se é preferido o desenvolvimento mais lento, 16 ° C. Continuar para remover morto ou lyembriões sed indicado por falta de primeira divisão ou a aparência inchada branco.
  5. Verificar o estágio dos embriões através da verificação de fechamento quase total do blastopore e por comparação com desenhos de embriões em estágios disponíveis em materiais de referência 24.
    Nota: Os embriões cultivados a 16 ° C irá atingir o estágio 11,5-12 em aproximadamente 12 horas.
  6. Incubar etapa 11.5 - 12 embriões em fresco 1 / 3x MMR suplementado com ciclo-heximida 0,5 mM durante 1 hora à TA, a prender os embriões no final de interfase.
  7. Transferir com vidro grande furo ou pipeta de plástico de um mínimo de 15 (de preferência 30 ou mais) embriões prendeu-interfase para um tubo de microcentrífuga.
    Nota: 15 embriões são suficientes para produzir cerca de 20 ul de extracto. Intensificar conforme necessário.
  8. Adicionar 1 ml de tampão de lise de ovo (ELB) suplementado com 1 ml de estoque LPC. Inverter cuidadosamente para lavar os embriões, os embriões permitir a cair para o fundo do tubo, e remover o tampão. Repita este passo de lavagem mais duas vezes. </ Li>
  9. embriões ressuspender em 500 mL de ELB mais 0,5 ul de estoque LPC, 5 ul de cicloheximida 19,7 mM e 5 ul de 35,5 mM citocalasina D (para inibir a polimerização de actina). Centrifugar a 200 xg durante 1 min numa microcentrífuga de mesa.
  10. Remover o excesso de tampão e usar um pilão para esmagar completamente os embriões. Centrifugar num rotor de balde oscilante durante 10 min a 10000 xg e 16 ° C.
  11. Perfurar a camada de lido a partir do topo com uma ponta de pipeta de 200 uL. Com uma ponta de pipeta de 200 mL limpo, remover a camada de cor âmbar citoplasmática meio a um tubo de tamanho apropriado.
  12. extracto de embrião suplemento com 1/50 do volume de mistura de energia 50x (para fornecer um sistema de regeneração de ATP), 1/100 do volume de 35,5 mM de ciclo-hexamida, 1/500 do volume de 19,7 mM de citocalasina D, e 1 / 1.000 o volume de estoque LPC.
  13. Prepara-se uma polpa como descrito no ponto 3.3 para visualizar núcleos embrionárias endógenos presentes no extracto.
    Nota: extrato de embriões podem ser congelados com os núcleos endógenos neste momento. Alíquota para reduzir a ciclos de congelamento / descongelamento e armazenar a -80 ° C.
  14. Para remover os núcleos a partir do extracto de embrião, dilui-se o extracto com um volume igual de ELB contendo 1/50 do volume de mistura de 50x de energia, o volume de 1/100 de 35,5 mM de ciclo-hexamida, 1/500 do volume de 19,7 mM de citocalasina D, e 1 / 1.000 do volume de estoque LPC. Centrifugar num rotor de balde oscilante a 17000 xg durante 15 min a 16 ° C.
  15. Recolhe-se o sobrenadante com cuidado para evitar qualquer lípido que permanece no topo. Não perturbe os núcleos sedimentados no fundo do tubo. Prepara-se uma polpa como descrito no ponto 3.3 para assegurar que a maioria dos núcleos foram removidos. Use o extrato fresco ou alíquota e armazenar a -80 ° C.
  16. Para inactivar pelo calor extracto de embrião para experiências de controlo, de calor 30 - 100 mL alíquotas de extracto a 56 ° C durante 30 min, utilizando um termociclador. Permitir que o calor extracto inactivado regressar até à temperatura ambiente antes de usar.
_title "> 5. Nuclear Shrinking Ensaio e Imunofluorescência

  1. Isolar núcleos montados no extracto de ovo por diluição de 25 - 150 ul de núcleos pré-montados em 1 ml ELB em um tubo de 1,5 ml. Centrifugar a 1.600 xg durante 3 min a 4 ° C numa mesa de microcentrífuga. Remover o tampão, com cuidado para não perturbar o sedimento de núcleos frágil na parte inferior do tubo.
  2. Ressuspender núcleos num volume de extracto de embrião igual ao volume original de extracto de ovo utilizado em 5.1. Uso ELB ou extracto inactivado por calor por reacções de controlo, conforme apropriado.
  3. Bata levemente o tubo para quebrar o pellet e ressuspender os núcleos. Incubar à temperatura ambiente durante 90 minutos, suavemente batendo no tubo para misturar todos os 15 - 30 min. Nota: Na maior parte do encolhimento nuclear ocorre nos primeiros 30 min.
  4. Monitorar o progresso de encolhimento nuclear, preparando um squash.
    1. Pipeta de 2 l de extracto numa lâmina de vidro e adicionar 2 ul correção núcleo.
    2. Sobreposição com um 22 mm2
  5. Toque no tubo para ressuspender os núcleos imediatamente antes da adição de 500 ul de fixador consiste em ELB, 15% de glicerol e 2,6% de paraformaldeído. Inverta imediatamente, e colocar o tubo num agitador rotativo durante 15 min à temperatura ambiente.
  6. Prepare girar tubos equipando 15 ml tubos de vidro de fundo redondo com inserções de plástico de fundo redondo (desenho e esquemas disponíveis mediante solicitação). Adicionar 5 ml de tampão de almofada nuclear. Deixe cair uma lamela circular 12 mm no tubo, sendo certo que está na horizontal na parte superior da inserção de plástico.
  7. Com cuidado, a camada de solução contendo núcleos fixos na parte superior da almofada nuclear utilizando uma ponta de pipeta de grande calibre. Centrifugar num rotor de balde oscilante durante 15 min a 1000 xg e 16 ° C.
  8. Use de um aspirador para remover todo o tampão de puxar e a inserção de plástico para o topo do tubo. Remover a lamela com um par de fórceps finos, tendo o cuidado de observar o lado da tampaescorregar para o qual os núcleos foram centrifugadas. Pós-correcção em metanol frio (armazenada a -20 ° C) durante 5 min à TA.
  9. Transferir lado do núcleo lamela em cima de uma folha de filme de parafina de plástico que reveste uma grande placa de petri de plástico. Coloque toalhetes descartáveis ​​molhado ao longo do lado do recipiente para evitar a desidratação.
  10. Rehidratar núcleos sobre a lamela com 500 ul de PBS-NP40 (1x PBS mais 0,1% de NP40) e aspirado após 5 - 10 seg.
  11. Cuidadosamente camada 75 ul de PBS-3% de Albumina de Soro Bovino (BSA) para a lamela. Deixa-se bloquear uma hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
  12. Remover solução de bloqueio, e incuba-se com anticorpo primário (por exemplo, mAb414 contra o complexo do poro nuclear, 1: 1000) diluída em PBS-BSA a 3% durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. Lavar com cinco mudanças imediatas de PBS-NP40.
  13. Incubar com anticorpo secundário diluído em PBS-BSA a 3% durante 1 h à TA. Lavar com cinco mudanças imediatas de PBS-NP40.
  14. Incubarcom 10 ug / ml de Hoechst diluída em PBS-BSA a 3% durante 5 min à TA. Lavar cinco vezes com PBS-NP40. Remova todo o excesso de buffer.
  15. Monte a lamela numa lâmina com meio de montagem 5 jul antifade. Selo com unhas polonês claro. Imagem imediatamente usando um microscópio de epifluorescência, com 20 - 100x objetivos ou armazenar a 4 ° C para imagens mais tarde.
    Nota: Execute quantificação como descrito anteriormente 23.

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Representative Results

Montagem de núcleos em extracto de ovo

Os primeiros passos deste protocolo estão a preparar X. extrato laevis ovo (Protocolo 1) e núcleos de esperma demembranated (protocolo 2). Estes reagentes são então usadas para montar os núcleos de novo (Protocolo 3). A Figura 1 mostra alguns dados representativos. Adição de cálcio conduz o extracto de ovo meioticamente preso em interfase, eo cicloheximida mantém o extrato preso em interfase. Por 30 - 45 min após o início da reacção, os núcleos de esperma inicialmente finas em forma de S deverá começar a engrossar em massas de cromatina em forma de bala. formação bem sucedida de um envelope nuclear intacto pode ser avaliada por importação e retenção de uma carga de importação marcado por fluorescência, tal como GST-GFP-NLS (dados não mostrados), ou por coloração com aro para o complexo do poro nuclear utilizando mAb414 que reconhece FG-repeat contaiNing nucleoporina (Figura 1A). Depois de ocorrer a montagem nuclear, forma nuclear deve tornar-se mais arredondados e o volume nuclear deve aumentar à medida que se expande o envelope nuclear e as proteínas nucleares são importados (Figura 1B-C). Deixar de observar a formação de um envelope nuclear intacto ou crescimento nuclear indica um extracto a qualidade do ovo pobre. Neste caso, o melhor é começar de novo com um novo lote de ovos.

Remoção de Endógeno Núcleos de Extrato de embrião
O próximo passo é preparar um extrato de embrião de fase tardia (Protocol 4). Após a preparação inicial do extracto e antes da remoção dos núcleos, é melhor preparar uma polpa Hoechst-manchado de uma pequena parte alíquota do extracto. A visualização de muitos pequenos núcleos embrionárias é uma boa indicação de sucesso na preparação do extracto (Figura 2A). Como núcleos embrionárias endógenos podem interferir com a jusante Analysis, é também importante verificar-se uma alíquota do extracto depois de retirar núcleos por diluição e centrifugação. Em comparação com o primeiro polpa, muito poucos núcleos deve ser deixado no extracto (Figura 2B). Se ainda existem muitos núcleos presente, uma segunda rodada de centrifugação é necessária.

Ensaio Shrinking Nuclear
A Figura 3 mostra resultados representativos para o ensaio de encolhimento nuclear (Protocolo 5). Extracto de ovo núcleos ressuspensos no final de extracto de fase de embrião tornam-se menores ao longo do tempo (Figura 3B). Um bom controlo negativo para o ensaio é a incubar núcleos com extracto de embrião que foi inactivado pelo calor (Figura 3A). Como núcleos não encolher em inactivado pelo calor extrato, isso proporciona alguma confiança que a observada nuclear encolhendo com extrato de embrião não tratada não é uma consequência dos efeitos osmóticos. A medida de tamanho nuclearreduções observadas varia dependendo do lote particular de ovos, extracto de núcleos, bem como a qualidade do extracto de embrião. Na nossa experiência, encolhimento nuclear está sempre observados (por exemplo, em mais de 40 extractos de embrião diferentes), no entanto, é importante para repetir estas experiências várias vezes com diferentes núcleos e extrai para tratar a variabilidade inerente do ensaio. A Figura 4 mostra um esquema de todo o protocolo.

figura 1
Figura 1. Montagem Nuclear Tempo Curso de X. laevis Egg Extract. Os núcleos foram montados de novo em X. laevis extracto de ovo como descrito no protocolo 3. Alíquotas de a mesma reacção foram fixos e visualizados por imunofluorescência, utilizando um anticorpo contra o complexo de poros nucleares (NPC) (mAb414) em: > A) 30 min, B) 60 min, e C) 90 min após o início do conjunto nuclear. O protocolo de imunofluorescência é descrito no Protocolo 5. A barra de escala é de 25 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Remoção de núcleos de X. laevis Extrato de embrião. X. laevis extracto de embrião foi preparado a partir de fase de 11,5 - 12 embriões como descrito no protocolo 4. Uma pequena ali quota de extracto foi fixada e corada com Hoechst: A) antes da remoção dos núcleos, e B) depois da remoção dos núcleos por centrifugação. A barra de escala é de 25 mm.om / files / ftp_upload / 54173 / 54173fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Os dados representativos do Ensaio Shrinking Nuclear. Os núcleos foram montados de novo em X. laevis extracto de ovo suplementado com GFP-LB3 recombinante (para visualizar a lâmina nuclear). Como descrito no protocolo 5, extracto de ovo núcleos foram isolados e ressuspendidos em fase 11,5-12 extracto de embrião a partir da qual os núcleos embrionárias endógenos tinha sido removido. imagens ao vivo de lapso de tempo foi realizada em intervalos de 30 seg para 90 min. Figura painéis mostram imagens adquiridas em intervalos de 6 mínimo para núcleos incubados em: a) os extratos tarde fase de embrião (LEE), e B) inactivado pelo calor (HI) extrato de embrião. As imagens dos cursos de tempo procedada esquerda para a direita. A barra de escala é de 25 mm. C) Nucleares encolhendo dados de 46 diferentes extratos de ovos e embriões. As barras mostram os meios para> 240 núcleos. As barras de erro são o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Esquema do Nuclear Shrinking de Ensaio. Cada caixa colorida representa um protocolo. O vermelho indica preparação de X. extrato laevis ovo (Protocolo 1). Azul indica preparação de demembranated X. espermatozóides laevis (protocolo 2). Rosa indica conjunto nuclear de novo no extrato de ovo (Protocol 3). O verde indica preparação de X. laevis extrato de embrião (Protocol 4). Roxo indica os s nucleareshrinking protocolo de ensaio e imunofluorescência (Protocolo 5). Partes deste valor foram reutilizados a partir de 23. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

nome tampão composição do tampão
Modificado Ringer de Marc (MMR), 1 / 3x NaCl 33 mM, KCl 0,7 mM, MgSO4 0,3 mM, CaCl2 0,7, HEPES 1,7 mM, pH 7,4
tampão extrato (XB), 10x KCl 1 M, CaCl2 1 mM, MgCl2 10 mM, sacarose 500 mM, HEPES 100 mM, pH 7,8 (pH ajustado com KOH 10 N, armazenado a 4 ° C)
tampão B 4% cisteína dissolvido em XB 0,8x (preparado com DDH 2 O frio, pH umadjusted para 7,8 com NaOH 10 N)
tampão C Misturar 100 m de 10x XB com 900 ml de ddH 2 O fria
tampão D Tampão C mais de EGTA 5 mM e 800 | iM MgCl2
estoque LPC, 1.000x 10 mg / ml de cada um de leupeptina, pepstatina, e quimostatina dissolvido em DMSO (armazenado em alíquotas a -20 ° C)
tampão E 100 ml de tampão D mais de 100 ações LPC ul
mix de energia, 50x 190 mM de fosfato de creatina dissódico, o sal dissódico de ATP 25 mM, cloreto de magnésio 25 mM
tampão T PIPES 15 mM, NaCl 15 mM, EDTA 5 mM, 7 mM de MgCl2, KCl 80 mM, sacarose a 0,2 M, pH 7,4 (filtro de esterilizar e armazenado a 4 ° C)
tampão S 20 mM de maltose e 0,05% de lisolecitina preparado em tampão T
tampão R Tampão T acrescida de 3% bovinaalbumina de soro
solução de cálcio, 20x 10 mM de CaCl2, 0,1 M de KCl, 1 mM de MgCl2 (armazenada a -20 ° C)
correção Nucleus 125 ul de 2 M de sacarose, 12,5 mL de HEPES 1 M pH 7,9, 250 ul de formaldeído a 37%, 112 ul de ddH2O, 0,5 ul de 10 mg / ml de Hoechst (armazenado à temperatura ambiente durante até duas semanas)
Modificada Saline de Barth (MBS), 10x NaCl 880 mM, KCl 10 mM, HEPES 50 mM, NaHCO 3 25, pH 7,8
MBS elevado teor de sal 1x MBS além de 0,7 mM de CaCl 2 e 20 mM de NaCl
tampão de lise ovo, ELB 250 mM de sacarose, 50 mM de KCl, 2,5 mM de MgCl 2, 10 mM de HEPES, pH 7,8
tampão almofada Nuclear 1x XB, 0,2 M de sacarose, 25% de glicerol (esterilizado por filtração e guardado a 4 ° C)

Tabela 1. Tampões. As composições de todos os buffers mencionados neste protocolo são descritos nesta tabela.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG Molecular Probes A10037
ATP disodium salt Sigma Aldrich A2383
Benzocaine Sigma Aldrich E1501
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059
CaCl2 Sigma Aldrich C3306
Centrifuge Beckman J2-21M
Centrifuge rotor Beckman JS 13.1
chymostatin Sigma Aldrich C7268
creatine phosphate disodium Calbiochem 2380
cycloheximide Sigma Aldrich C6255
cytochalasin D Sigma Aldrich C8273
disposable wipes (kimwipes) Sigma Aldrich Z188956
L-cysteine Sigma Aldrich W326306
EGTA Sigma Aldrich E4378
Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
Glass crystallizing dish (150 x 75 mm) VWR 89090-662
Glycerol Macron 5094-16
HEPES Sigma Aldrich H4034
Hoechst - bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma Aldrich B2261
HCG - Human Chorionic Gonadotropin  Prospec hor-250-c
L15 Media Sigma Aldrich L4386
leupeptin Sigma Aldrich L2884
Lysolecithin Sigma Aldrich L1381
mAb414 Abcam ab24609
MgCl2 EMD MX0045-2
MgSO4 Sigma Aldrich M9397
Maltose Sigma Aldrich M5885
NP40 BDH 56009
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin + Streptomycin Sigma Aldrich Pp0781
pepstatin Sigma Aldrich P5318
PIPES Sigma Aldrich P6757
Plastic paraffin film (parafilm) Sigma Aldrich P7793
KCl Sigma Aldrich P9541
KH2PO4 Mallinckrodt 70100
KOH Baker 5 3140
PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin Prospec hor-272-a
NaCl Sigma Aldrich S3014
NaHCO3 Fisher BP328
Na2HPO4 EMD SX0720-1
NaOH EMD SX0590
Pestle Thomas Scientific 3411D56
Round bottom glass tubes, 15 ml Corex 8441
Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) ThermoFisher A10037
sucrose Calbiochem 8550
thermal cycler Bio-Rad T100
Ultracentrifuge Beckman L8-80M
Ultracentrifuge rotor Beckman SW 50.1
Vectashield (anti-fade mounting medium) Vector H-1000

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