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Biology

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Edens, L. J., Levy, D. L. A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation. J. Vis. Exp. (114), e54173, doi:10.3791/54173 (2016).

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Abstract

Una pregunta fundamental en biología celular es cómo se regulan los tamaños de células y orgánulos. Durante mucho tiempo se ha reconocido que el tamaño del núcleo escalas generalmente con el tamaño de la celda, en particular durante la embriogénesis cuando se producen reducciones dramáticas en tanto celular y tamaños nucleares. Mecanismos de regulación del tamaño nuclear son en gran parte desconocida y puede ser relevante para el cáncer, donde el tamaño nuclear alterada es un parámetro clave de diagnóstico y pronóstico. En vivo para la identificación de los reguladores nucleares de tamaño se complica por la naturaleza esencial y compleja de la función nuclear. El enfoque in vitro descrito aquí para estudiar el control del tamaño nuclear se aprovecha de las reducciones normales en tamaño nuclear que se producen durante el desarrollo de Xenopus laevis. En primer lugar, los núcleos se ensamblan en X. laevis extracto de huevo. A continuación, estos núcleos se aíslan y se resuspendieron en el citoplasma de embriones de etapa tardía. Después de un 30 - 90 min período de incubación, la superficie nucleardisminuye en 20 a 60%, proporcionando un ensayo útil para identificar los componentes citoplasmáticos presentes en embriones de etapa tardía que contribuyen al desarrollo de escala tamaño nuclear. Una ventaja importante de este enfoque es la facilidad relativa con la que los extractos de huevo y embrión puede ser bioquímicamente manipulados, lo que permite la identificación de nuevas proteínas y actividades que regulan el tamaño nuclear. Como con cualquier enfoque en vitro, la validación de los resultados en un sistema in vivo es importante, y la microinyección de X. laevis embriones es particularmente apropiado para estos estudios.

Introduction

Los tamaños de los orgánulos celulares típicamente escala con el tamaño de la célula, y esto ha sido quizás mejor documentado para el escalado de tamaño nuclear con tamaño de celda 1-10. Esto es particularmente cierto durante la embriogénesis y la diferenciación celular, cuando reducciones dramáticas en tanto celular y tamaño nuclear se observan a menudo 11,12. Además, alterado tamaño nuclear es un parámetro clave en el diagnóstico de cáncer y el pronóstico 13-17. Mecanismos que contribuyen a la regulación del tamaño nuclear son en gran parte desconocidos, en parte debido a la complejidad y la naturaleza esencial de la estructura y la función nuclear. El método aquí descrito se desarrolló como un ensayo in vitro para la escala del tamaño nuclear que es susceptible a la manipulación bioquímica y la elucidación de los mecanismos de regulación del tamaño nuclear.

Xenopus laevis extracto de huevo es un sistema bien establecido para recapitular y estudiar procesos celulares complejos en un in vitro 18-22. Una ventaja clave del sistema es que el extracto de X. extractos de huevo laevis representan un citoplasma casi sin diluir cuya composición puede ser alterado fácilmente, por ejemplo mediante la adición de proteínas o immunodepletion recombinantes. Además, uno es capaz de manipular los procesos esenciales mediante el empleo de tratamientos que de otro modo podrían ser letales en un contexto in vivo. Las modificaciones del procedimiento de extracto de huevo permiten para el aislamiento de extractos de X. laevis embriones en lugar de huevos, y estos extractos de embriones son igualmente susceptibles de manipulación bioquímica 23. Durante X. laevis desarrollo, el embrión fertilizado de una sola célula (~ 1 mm de diámetro) se somete a una serie de doce divisiones celulares rápidas (etapas 1-8) para generar varios miles de 50 μm de diámetro y células más pequeñas, llegando a una etapa de desarrollo denominan la transición midblastula (MBT) o 24-26 de la etapa 8. El MBT se caracteriza por el inicio de la transcripción cigóticos, la migración celular, divisiones celulares asíncronos, la adquisición de fases Gap, y el establecimiento de tamaños de estado estable nucleares en lugar de la expansión nuclear continua como en el embrión de pre-MBT. Desde la etapa 4 a la gastrulación (etapas 10,5-12), el volumen de los núcleos individuales se reduce en más de 10 veces 11.

Aquí, el objetivo es identificar los mecanismos responsables de estas reducciones en el tamaño nuclear durante la progresión del desarrollo. El enfoque es montar primero núcleos en X. laevis huevo y el extracto de aislar esos núcleos desde el citoplasma del huevo / extracto. Estos núcleos se resuspendieron a continuación en el citoplasma de embriones en estadio de gástrula tardía. Después de un período de incubación, los núcleos de extracto de huevo se hacen más pequeños a finales de extracto de la etapa embrionaria. Pensamos que este would ser un ensayo útil para la identificación de los componentes citoplasmáticos presentes en los embriones en etapas avanzadas que contribuyen al desarrollo de escala del tamaño nuclear. Utilizando este ensayo, junto con la validación in vivo, hemos demostrado que la proteína quinasa C (PKC) contribuye a la reducción del desarrollo en el tamaño nuclear en X. laevis 23.

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Protocol

Todos los procedimientos y estudios de Xenopus se llevaron a cabo en cumplimiento de la Guía de la NRC para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio 8 ª edición. Protocolos fueron aprobados por la Universidad de Wyoming Institucional Cuidado de Animales y el empleo (Aseguramiento # A-3216-01).

1. Preparación de X. Extracto de huevo laevis (adaptado de 27,28)

  1. X. primordial de mujeres laevis ranas un mínimo de tres días y un máximo de dos semanas antes de la recolección de huevos con una sola inyección de 100 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG).
  2. Un día antes del experimento, inyectar ranas cebó con 800 UI de gonadotropina coriónica humana (HCG) y el lugar a 16 ° C en 1 L por la rana de 1 / 3x timbres modificados de Marc (MMR). Ver Tabla 1 para todas las composiciones de amortiguamiento.
    Nota: Algunas ranas no ponen huevos o ponen huevos de mala calidad. Por lo general 2 - 3 ranas se inyectan para asegurar al menos una rana sentará suficient número de huevos de buena calidad. La rana promedio pondrá huevos suficientes para producir al menos 1 ml de extracto de huevo.
  3. Prepare 1 L 1 / 3x MMR con agua destilada desionizada fría (ddH 2 O), 500 ml de tampón B, 1 L de tampón C, 500 ml de tampón D, y 100 ml de tampón E.
  4. Transferencia puso huevos a un plato de cristalización de vidrio (150 x 75 mm). El uso de un plástico pipeta Pasteur con la punta cortada, la granja a cabo hinchados activado huevos blancos o huevos lisadas. Sólo retener los huevos con polos animales oscura distintas e iguales y polos blancos vegetales.
  5. Preparar 13 x 51 mm tubos de centrífuga con 1 ml de Tampón E suplementado con 355 mM citocalasina D añaden justo antes de usar en el paso 1.7.
  6. Dejelly y lavar los huevos.
    1. Lavar los huevos brevemente con frío 1 / 3x MMR en un vaso de precipitados de tamaño adecuado, cambiando el tampón 3 - 4 veces.
    2. Retirar las capas de la jalea de los huevos de incubación con tampón B. Esto se llevará a cualquier lugar del 3 - 10 minutos a. Como las capas de gelatina nublado se liberan del huevos, cambiar el tampón.
      Nota: Dejellying se completa cuando los huevos aparecen apretujada en la esquina del plato cuando se inclina y polos vegetales están orientados hacia abajo. Los huevos son mucho más frágiles después dejellying, por lo que no incuban los huevos con tampón B por más de lavados necesarios y posteriores deben realizarse con mucho cuidado.
    3. Lavar los huevos brevemente con 3 - 4 cambios de tampón C.
    4. Lavar los huevos brevemente con 2 cambios de tampón D.
    5. Wash huevos brevemente con 2 cambios de tampón E.
  7. Llenar los tubos de centrífuga con huevos usando una amplia pipeta de vidrio orificio o un gotero de plástico. Aspirar el exceso de tampón. Para empaquetar los huevos y eliminar la mayor cantidad de tampón como sea posible, de centrifugación en rotor de cubeta oscilante a 212 xg durante 60 seg y luego a 478 xg durante 30 seg. Aspirar el exceso de tampón.
    Nota: Es importante eliminar la mayor cantidad de tampón en exceso de lo posible en este paso para asegurar el extracto de huevo se diluye mínimamente.
  8. En un balanceo rotor cubo, ultracentrífuga a vacío durante 15 min a 12.000 xg y 4 ° C para aplastar los huevos abierto y se separan en diferentes capas, con el citoplasma de ser la capa de color ámbar en el medio. Retire los tubos de centrífuga y colocar inmediatamente en hielo.
  9. Recoger el extracto.
    1. El uso de una aguja de calibre 18 y una jeringa, perforar el tubo de centrífuga justo por encima de la capa pigmentada oscura en la parte inferior del tubo y eliminar la capa citoplasmática de color ámbar medio. No se debe recoger cualquiera de la capa lipídica superior. Recoger el citoplasma en un tubo de tamaño apropiado.
      Nota: Por lo general, 1 rana produce al menos 1 ml de extracto.
    2. citoplasma suplemento con 1 / 1.000 del volumen de 19,7 mM citocalasina D, 1 / 1.000 el volumen de LPC de valores, y 1/50 del volumen de 50x combinación de energías. Invierta suavemente el tubo para mezclar. No pipetear en exceso el extracto.
    3. Mantenga el extracto sobre hielo y usarlo a menos de 3 h de preparación para obtener los mejores resultados.
_TITLE "> 2. Preparación de esperma Demembranated X. laevis (adaptado de 29)

Nota: Los volúmenes se explica a continuación son para un máximo de 8 testículos.

  1. Retire 0,05% benzocaína (10% benzocaína de stock preparado en etanol y se diluyó a 0,05% en agua tanque de rana) a partir de 4 ° C y se calienta a temperatura ambiente. Anestesiar y sacrificar masculina X. laevis ranas en solución benzocaína a temperatura ambiente durante 20 - 30 min. Asegurar la muerte por la ausencia de latidos del corazón mediante el examen y la sensación de la zona del pecho, por la falta de respuesta a la estimulación mecánica, y / o por decapitación.
  2. Se practica una incisión en forma de U a lo largo del abdomen. Retire la masa de los cuerpos tubulada grasas amarillas. En la parte superior de los riñones, localizar los testículos, que son masas de color rosa pálido alrededor de 1 cm de longitud 29 de forma ovalada. Extirpar los testículos y rodar sobre papel secante para eliminar la sangre y otros tejidos.
  3. Lavar los testículos en Tampón T. Uso una mano de mortero ajustado equipado para picar testículos con 1 ml de tampónT en un tubo de 1,5 ml hasta que sea homogénea (10 golpes o más). Centrifugar 5 a 10 seg en una mini centrífuga y se recoge el sobrenadante, la eliminación de grandes piezas de tejido. Repetir la centrifugación una vez más y se recoge el sobrenadante.
  4. Transferir la solución que contiene espermatozoides a un tubo de plástico 15 ml. Aumentar el volumen a un total de 2 ml con tampón T. Se centrifuga a 1.411 xg durante 10 minutos a 16 ° C para sedimentar los espermatozoides.
  5. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 500 l de tampón T. Se centrifuga a 1.411 xg durante 10 minutos a 16 ° C. Repita este paso una o dos veces como sea necesario para limpiar el sedimento de glóbulos rojos y somáticas.
  6. Resuspender el precipitado en 100 l de tampón T y 300 l de tampón de S. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
    Nota: Buffer S contiene lisolecitina, que es responsable de demembranation.
  7. Añadir tres volúmenes de tampón I (preparado fresco antes de su uso). Invertir el tubo exactamente una vez. Se centrifuga a 1.411 xg durante 15 minutos a 16 y# 176; C.
  8. Resuspender el precipitado en 400 l de tampón R y luego agregar un adicional de 2 ml de solución tampón R. Se centrifuga a 1.411 xg durante 15 minutos a 16 ° C.
  9. Resuspender el precipitado en 50 l de tampón T.
  10. Diluir 1 l demembranated núcleos de los espermatozoides con 9 l de tampón T. Aplicar esta dilución a un hemocitómetro. Contar el número de núcleos de los espermatozoides en forma de S-finas en una gran cuadrícula de 4 x 4, y multiplicar el resultado por 100 para obtener la concentración de la población en núcleos de los espermatozoides por l.
  11. Diluir la población de 100.000 núcleos de los espermatozoides por l con tampón T, lo que resulta en una acción de 200x. Preparar 3 - 5 ml de alícuotas. congelación de flash en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C.

3. Asamblea Nuclear

  1. Suplemento 100 l de extracto de huevo con 1,5 l 35,5 cicloheximida mM (concentración final 0,5 ~ mM), 6 l de 20x solución stock de calcio (concentración final de ~ 0,6 mM), y 0,7 l de 200x esperma (concentración final 700 ~esperma núcleos / l). Escalar el volumen de reacción hacia arriba o hacia abajo según sea necesario. Invertir o golpear suavemente para mezclar.
    Nota: Extracto de ciclado de la metafase en la interfase proporciona una plataforma más robusta y fiable para el montaje nuclear.
  2. Incubar en un baño de agua a 16 - 20 En ° C durante 90 minutos. Mezclar golpeando suavemente cada 15 minutos para asegurar núcleos permanecen suspendidas en el extracto.
  3. Monitorear el progreso del equipo nuclear a los 45 minutos mediante la preparación de una calabaza de la siguiente manera.
    1. Pipetear 2 l de extracto sobre un portaobjetos de vidrio y añadir 2 l solución núcleo.
    2. Superponer con un cubreobjetos de 22 mm 2. Imagen en un microscopio de epifluorescencia usando agua, aceite o aire 20 - 100X objetivos y un filtro DAPI.
      Nota: Los núcleos puede ser visualizada mediante formación de imágenes de campo brillante, pero son mucho más fáciles de visualizar por fluorescencia.
    3. Utilizar inmediatamente o núcleos de congelación alícuotas de flash en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C.
      Nota: La adición de 4% de glicerol a la pr núcleosIOR a la congelación puede ayudar a mantener su integridad. núcleos congelados son por lo general sigue siendo viable y capaz de importación nuclear, sin embargo, el proceso de congelación puede dar lugar a núcleos frágiles interrumpidos o más estructuralmente. Los núcleos de hasta un año después de la congelación puede ser utilizado.

4. Preparación de X. laevis extracto de embrión de

  1. Inducir X. femenina laevis ranas para poner sus huevos como se describe en 1.1 y 1.2.
  2. Aislar los testículos masculinos de X. laevis ranas como se describe en 2.2. Sumergir testículos en los medios de comunicación L15 suplementado con 50 UI / ml de penicilina y estreptomicina en un vaso 35 plato x 10 mm Petri. Almacenar a 4 ° C durante un máximo de dos semanas.
  3. Recoger y fertilizar los óvulos.
    1. Recoger los huevos recién puestos mediante la celebración de ranas sobre un plato de vidrio reutilizable Petri y promover la puesta de huevos mediante la aplicación de una presión suave a la baja de la espalda, cerca de la cloaca. Exprimir la rana demasiado fuerte puede provocar lesiones, dando lugar a un abdomen hinchado y requiring la eutanasia 29.
    2. Apuntalar el plato en un aproximado de 45 ° de ángulo, permiten que los huevos se acumulen en el borde del plato, eliminar todo el exceso de tampón, y añadir una cantidad suficiente MMR 1 / 3x para cubrir apenas los huevos. Fertilizar los óvulos dentro de los 15 min de la colección.
    3. Utilice una mano de mortero ajustado firmemente para macerar y homogeneizar 1/4 de un testículo en un tubo de 1,5 ml con 500 l de sal de alta Modificados salina de Barth (alta concentración de sal MBS). Añadir testículos macerados a los huevos y permitir que ocurra la fertilización a temperatura ambiente durante 15 a 20 min, a continuación, inundar huevos con 1 / 3x MMR.
      Nota: Eficacia de los testículos disminuye con el tiempo de almacenamiento, por lo tanto, se puede requerir más testículos tejido para una fertilización exitosa cuando se usa testículos que se han almacenado durante más de una semana.
    4. Confirmar la fertilización mediante la comprobación de la contracción del polo animal pigmentada oscura y por la rotación de los embriones con sus polos animales hacia arriba, por lo general alrededor 20 - 30 min después de la adición de teste triturados. Esperar de la primera escisión de células que se produzca dentro de los 90 min.
    5. Utilizando una amplia pipeta de vidrio orificio eliminar diligentemente muerto (blanco e hinchado o la distribución desigual de la yema de huevo y pigmento), se lisaron, o huevos no fertilizados (es decir, no escindido), ya que se inducen rápidamente la muerte en embriones de vecinos.
    6. En cualquier lugar 1-2,5 horas después de la fertilización, dejelly embriones en 2-3% de cisteína disuelven en 1/3 x MMR y se ajustaron a pH 7,9 con 10 N de KOH. Realice dos cambios de tampón que son cada uno 3 - 4 min. Es necesario lavar los embriones con 6 - 10 breves cambios de 1 / 3x MMR para eliminar todos los restos de cisteína.
      Nota: embriones dejellied tienen una membrana vitelina y no son tan frágiles como huevos dejellied.
  4. Utilizando una amplia pipeta de vidrio ánima, transferir (es decir, escindida), los embriones fecundados sanos de una placa de Petri que contiene frescos 1 / 3x MMR y permitir que se desarrollan a la etapa deseada a temperatura ambiente o, si se prefiere un desarrollo más lento, 16 ° C. Continuar para eliminar muerto o Lyembriones sed indicados por falta de primera división o la apariencia hinchada blanca.
  5. Verificar la etapa de los embriones mediante la comprobación de cierre casi completo de la blastopore y comparando a los dibujos de embriones por etapas disponibles en materiales de referencia 24.
    Nota: los embriones cultivados a 16 ° C alcanzará la etapa 11.5 - 12 de aproximadamente 12 horas.
  6. Incubar etapa 11.5 - 12 embriones en fresco 1 / 3x MMR suplementado con cicloheximida 0,5 mM durante 1 hora a RT, para detener los embriones a finales de la interfase.
  7. Transferir con el vidrio grueso calibre o pipeta de plástico de un mínimo de 15 (preferiblemente 30 o más) embriones en interfase a detener a un tubo de microcentrífuga.
    Nota: 15 embriones son suficientes para producir aproximadamente 20 l de extracto. Ampliar según sea necesario.
  8. Añadir 1 ml de tampón de lisis de huevo (ELB) suplementado con 1 l de LPC de valores. Invertir suavemente para lavar los embriones, embriones para permitir que caen hacia el fondo del tubo, y retirar el tampón. Repita este paso de lavado dos veces más. </ Li>
  9. Volver a suspender los embriones en 500 l de ELB más 0,5 l de LPC de valores, 5 l de cicloheximida 19,7 mm y 5 l de 35,5 mM citocalasina D (para inhibir la polimerización de la actina). Centrifugar a 200 xg durante 1 min en una microcentrífuga de mesa.
  10. Eliminar el exceso de tampón y el uso de una mano de mortero para machacar a fondo los embriones. Centrífuga en un rotor de cubo oscilante durante 10 minutos a 10.000 x g y 16 ° C.
  11. Perforar la capa lipídica de la parte superior con una punta de pipeta de 200 l. Con una punta de pipeta de 200 l limpia, eliminar la capa de color ámbar citoplasmática medio de un tubo de tamaño adecuado.
  12. extracto de embrión de suplemento con 1/50 del volumen de 50x mezcla de energía (para proporcionar un sistema de regeneración de ATP), un centésimo del volumen de ciclohexamida 35,5 mM, 1/500 del volumen de 19,7 mM citocalasina D, y 1 / 1.000 el volumen de LPC de valores.
  13. Preparar una calabaza como se describe en 3.3 a visualizar los núcleos de embriones endógenos en el extracto.
    Nota: extracto de embriones se pueden congelar con los núcleos endógenos en este punto. Alícuota para reducir la congelación / descongelación y se almacena a -80 ° C.
  14. Para eliminar los núcleos a partir del extracto de embrión, diluir el extracto con un volumen igual de ELB que contiene 1/50 del volumen de 50x mezcla de energía, centésima del volumen de ciclohexamida 35,5 mM, 1/500 del volumen de 19,7 mM citocalasina D, y 1 / 1.000 el volumen de LPC de valores. Centrífuga en un rotor de cubo oscilante a 17.000 xg durante 15 minutos a 16 ° C.
  15. Recoger el sobrenadante con cuidado de evitar cualquier lípido que queda en la parte superior. No molestar los núcleos sedimentados en la parte inferior del tubo. Preparar una calabaza como se describe en 3.3 para asegurar que la mayoría de los núcleos se han eliminado. El uso del extracto fresco o alícuota y se almacena a -80 ° C.
  16. Para calentar inactivar extracto de embrión para los experimentos de control, de calor 30 - 100 ml de alícuotas de extracto a 56 ° C durante 30 min usando un termociclador. Dejar que el extracto inactivado por calor para volver a la temperatura ambiente antes de su uso.
_TITLE "> 5. nuclear Shrinking Ensayo e inmunofluorescencia

  1. Aislar núcleos reunidos en extracto de huevo mediante la dilución de 25 - 150 l de núcleos pre-ensamblados en 1 ml ELB en un tubo de 1,5 ml. Centrifugar a 1600 xg durante 3 min a 4 ° C en una microcentrífuga de mesa. Eliminar el tampón, teniendo cuidado de no perturbar el pellet frágil de los núcleos en la parte inferior del tubo.
  2. Resuspender los núcleos en un volumen de extracto de embrión igual al volumen original de extracto de huevo utilizado en 5.1. Uso ELB o extracto inactivado por calor para las reacciones de control, según proceda.
  3. Golpear suavemente el tubo para disolver el sedimento y volver a suspender los núcleos. Incubar a temperatura ambiente durante 90 min, golpeando suavemente el tubo para mezclar cada 15 - 30 min. Nota: La mayor parte de la contracción nuclear se produce en los primeros 30 minutos.
  4. Monitorear el progreso de reducción nuclear mediante la preparación de una calabaza.
    1. Pipetear 2 l de extracto sobre un portaobjetos de vidrio y añadir 2 l solución núcleo.
    2. Superposición con un 22 mm2
  5. Toca el tubo para resuspender los núcleos justo antes de la adición de 500 l de fijador que consiste en ELB, 15% de glicerol, y 2,6% de paraformaldehído. Invertir inmediatamente, y colocar el tubo en un rotador durante 15 minutos a temperatura ambiente.
  6. Preparar tubos de girar mediante el equipamiento de tubos de 15 ml cristal con fondo redondo con insertos de plástico de fondo redondo (diseño y esquemas disponibles bajo petición). Añadir 5 ml de tampón de cojín nuclear. Caída de un cubreobjetos circular de 12 mm en el tubo, asegurándose de que quede plana en la parte superior de la pieza de plástico.
  7. la capa suavemente la solución que contiene núcleos fijos en la parte superior de la almohadilla nuclear utilizando una punta de pipeta de gran calibre. Centrífuga en un rotor de cubo oscilante durante 15 minutos a 1.000 xg y 16 ° C.
  8. Utilice un aspirador para eliminar todo el tampón y tire de la pieza de plástico a la parte superior del tubo. Retire el cubreobjetos con un par de pinzas finas, teniendo cuidado de observar el lado de la tapase deslizan sobre la que los núcleos se centrifugaron. Post-fix en metanol frío (almacenado a -20 ° C) durante 5 min a TA.
  9. Transferir el lado núcleo cubreobjetos arriba sobre una lámina de película plástica de parafina que recubre una gran placa de Petri de plástico. Coloque toallitas desechables húmedas a lo largo del lado del plato para evitar la deshidratación.
  10. Rehidratar núcleos en el cubreobjetos con 500 l de PBS-NP40 (1x PBS más 0,1% de NP40) y aspirado después de 5 a 10 seg.
  11. capa cuidadosamente 75 l de PBS-3% albúmina de suero bovino (BSA) en el cubreobjetos. Permitir bloquear 1 hr a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
  12. Retirar la solución de bloqueo, y se incuba con el anticuerpo primario (por ejemplo, mAb414 contra el complejo del poro nuclear, 1: 1000) diluido en PBS-BSA al 3% durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. Lavar con cinco cambios inmediatos de PBS-NP40.
  13. Incubar con anticuerpo secundario diluido en PBS-BSA al 3% durante 1 hora a RT. Lavar con cinco cambios inmediatos de PBS-NP40.
  14. Incubarcon 10 mg / ml Hoechst diluido en PBS-BSA al 3% durante 5 min a RT. Lavar cinco veces con PBS-NP40. Eliminar todo el exceso de tampón.
  15. Montar el cubreobjetos sobre un portaobjetos con medio de montaje 5 l antifade. Sellar con esmalte de uñas transparente. Imagen inmediatamente utilizando un microscopio de epifluorescencia con 20 - 100x objetivos o se almacena a 4 ° C para obtener imágenes más tarde.
    Nota: Realizar la cuantificación como se ha descrito previamente 23.

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Representative Results

Asamblea de los núcleos en extracto de huevo

Los primeros pasos de este protocolo son para preparar X. extracto de huevo laevis (Protocolo 1) y núcleos de los espermatozoides demembranated (Protocolo 2). Estos reactivos se utilizan para ensamblar núcleos de novo (Protocolo 3). La figura 1 muestra algunos datos representativos. La adición de calcio conduce el extracto de huevo meiotically detenido en la interfase, y la cicloheximida mantiene el extracto detenido en la interfase. A los 30 - 45 minutos después del inicio de la reacción, los núcleos de los espermatozoides en forma de S inicialmente delgadas deben comenzar a espesar en masas de cromatina en forma de babosas. formación exitosa de un sobre nuclear intacta puede ser evaluada por la importación y la retención de una carga de importación marcado con fluorescencia, tal como GST-GFP-NLS (datos no mostrados), o por tinción de borde para el complejo de poro nuclear usando mAb414 que reconoce FG-repetición contaiNing nucleoporinas (Figura 1A). Después se produce el montaje nuclear, la forma nuclear debe ser más redondeada y el volumen nuclear debe aumentar a medida que la envoltura nuclear se expande y proteínas nucleares son importados (Figura 1B-C). El incumplimiento de la formación de una membrana nuclear intacta o el crecimiento nuclear indica un extracto de huevo de calidad pobre. En este caso, lo mejor es empezar de nuevo con un nuevo lote de huevos.

La eliminación de los núcleos endógenos a partir de extracto de embriones
El siguiente paso es preparar un extracto de embrión de etapa tardía (Protocolo 4). Después de la preparación inicial del extracto y antes de la extracción de núcleos, lo mejor es preparar una calabaza con tinción de Hoechst de una pequeña alícuota del extracto. Visualización de muchos pequeños núcleos de embriones es una buena indicación de éxito en la preparación del extracto (Figura 2A). Como núcleos de embriones endógenos pueden interferir con la analysi aguas abajos, también es importante comprobar una alícuota del extracto después de la eliminación de los núcleos por dilución y centrifugación. En comparación con la primera squash, muy pocos núcleos deben dejarse en el extracto (Figura 2B). Si todavía hay muchos núcleos presentes, se requiere una segunda ronda de centrifugación.

Ensayo nuclear Shrinking
La Figura 3 muestra los resultados representativos para el ensayo de contracción nuclear (Protocolo 5). Núcleos extracto de huevo se volvieron a suspender a finales de extracto de etapa embrionaria se hacen más pequeños con el tiempo (Figura 3B). Un buen control negativo para el ensayo es incubar los núcleos con extracto de embrión que ha sido inactivado por calor (Figura 3A). Como núcleos fallan para reducir el tamaño en el extracto inactivado por calor, esto proporciona cierta confianza en que observó nuclear reducción con extracto de embrión no tratado no es una consecuencia de los efectos osmóticos. La extensión de tamaño nuclearreducciones observadas varía dependiendo del lote particular de núcleos extracto de huevo, así como la calidad del extracto de embrión. En nuestra experiencia, la reducción nuclear siempre se observó (por ejemplo, en más de 40 extractos de embriones diferentes), sin embargo, es importante repetir estos experimentos varias veces con diferentes núcleos y extrae para hacer frente a la variabilidad inherente del ensayo. La figura 4 muestra un esquema de todo el protocolo.

Figura 1
Figura 1. Asamblea nuclear del Lapso de tiempo en X. laevis huevo Extraer. Los núcleos se monta de novo en X. laevis extracto de huevo como se describe en el Protocolo 3. Las alícuotas de la misma reacción se fijaron y se visualizaron por inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo contra el complejo del poro nuclear (NPC) (mAb414) en: > A) 30 min, B) 60 min, y C) 90 min después del inicio del montaje nuclear. El protocolo de inmunofluorescencia se describe en el Protocolo 5. La barra de escala es de 25 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. La eliminación de los núcleos de X. laevis extracto de embrión de. X. extracto de embrión laevis se preparó a partir etapa 11.5 - 12 embriones como se describe en el Protocolo 4. Una pequeña alícuota de extracto se fijaron y tiñeron con Hoechst: A) antes de la retirada de los núcleos, y B) después de la eliminación de los núcleos por centrifugación. La barra de escala es de 25 micras.om / archivos / ftp_upload / 54173 / 54173fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Los datos representativos del ensayo nuclear que encoge. Los núcleos se monta de novo en X. extracto de huevo laevis suplementado con GFP-LB3 recombinante (para visualizar la lámina nuclear). Como se describe en el Protocolo 5, núcleos de extracto de huevo se aislaron y se volvieron a suspender en fase 11,5-12 extracto de embrión del que se habían eliminado los núcleos endógenos embrionarias. time-lapse en vivo se realizó a intervalos de 30 seg durante 90 minutos. Figura paneles muestran imágenes adquiridas a los 6 minutos durante núcleos incubados en: a) el extracto de embriones etapa tardía (LEE), y B) inactivado por calor (HI) extracto de embrión. Las imágenes de los cursos de tiempo procedande izquierda a derecha. La barra de escala es de 25 micras. C) Nucleares datos de contracción de 46 diferentes extractos de huevos y embriones. Las barras muestran los medios de> 240 núcleos. Las barras de error son la desviación estándar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Esquema del Ensayo Nuclear encoge. Cada caja de color representa un protocolo. El color rojo indica la preparación de X. extracto de huevo laevis (Protocolo 1). El color azul indica la preparación de X. demembranated espermatozoides laevis (Protocolo 2). Rosas, las de ensamblaje de novo nuclear en extracto de huevo (Protocolo 3). El color verde indica la preparación de X. extracto de embrión de laevis (Protocolo 4). El color morado indica los s nucleareshrinking protocolo de ensayo e inmunofluorescencia (Protocolo 5). Algunas partes de esta figura se han reutilizado de 23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

nombre del búfer composición del tampón
Modificado timbres de Marc (MMR), 1 / 3x NaCl 33 mM, KCl 0,7 mM, 0,3 mM MgSO4, 0,7 mM CaCl 2, HEPES 1,7 mM, pH 7,4
extracto de amortiguación (XB), 10x 1 M KCl, 1 mM CaCl 2, 10 mM de MgCl 2, sacarosa 500 mM, HEPES 100 mM, pH 7,8 (pH ajustado con KOH 10 N, se almacena a 4 ° C)
tampón B 4% cisteína disolvió en XB 0,8x (preparado con ddH frío 2 O, pH unadjusted a 7,8 con NaOH 10 N)
Buffer C Mezclar 100 m de 10x XB con 900 ml de ddH 2 O fría
tampón D Buffer C más EGTA 5 mM y 800 mM MgCl 2
LPC de valores, 1,000x 10 mg / ml de leupeptina, pepstatina, y quimostatina disuelto en DMSO (almacenado en alícuotas a -20 ° C)
Buffer E 100 ml de Tampón D más de 100 l de stock LPC
La combinación energética, 50x 190 mM de disodio fosfato de creatina, la sal disódica de ATP 25 mM, cloruro de magnesio 25 mM
Buffer T TUBOS 15 mM, NaCl 15 mM, EDTA 5 mM, 7 mM MgCl 2, KCl 80 mM, 0,2 M de sacarosa, pH 7,4 (filtro de esterilizar y se almacena a 4 ° C)
Buffer S 20 mM de maltosa y 0,05% lisolecitina preparado en tampón T
R tampón Tampón T más el 3% de bovinoalbúmina de suero
Stock de calcio solución, 20x 10 mM CaCl2, 0,1 M KCl, 1 mM MgCl 2 (almacenado a -20 ° C)
fix núcleo 125 l 2 M de sacarosa, 12,5 l 1 M HEPES pH 7,9, 250 l 37% de formaldehído, 112 l de ddH2O, 0,5 l de 10 mg / ml Hoechst (almacenado a temperatura ambiente durante un máximo de dos semanas)
Modificado Saline de Barth (MBS), 10x NaCl 880 mM, KCl 10 mM, HEPES 50, 25 mM de NaHCO3, pH 7,8
MBS altas de sal 1x MBS más 0,7 mM CaCl 2 y NaCl 20 mM
tampón de lisis de huevo, ELB Sacarosa 250 mM, KCl 50 mM, 2,5 mM MgCl 2 mM, HEPES 10, pH 7,8
tampón amortiguador nuclear 1x XB, 0,2 M de sacarosa, 25% de glicerol (esterilizado por filtración y se almacenó a 4 ° C)

Tabla 1. Tampones. Las composiciones de todos los tampones mencionados en este protocolo se describen en esta tabla.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG Molecular Probes A10037
ATP disodium salt Sigma Aldrich A2383
Benzocaine Sigma Aldrich E1501
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059
CaCl2 Sigma Aldrich C3306
Centrifuge Beckman J2-21M
Centrifuge rotor Beckman JS 13.1
chymostatin Sigma Aldrich C7268
creatine phosphate disodium Calbiochem 2380
cycloheximide Sigma Aldrich C6255
cytochalasin D Sigma Aldrich C8273
disposable wipes (kimwipes) Sigma Aldrich Z188956
L-cysteine Sigma Aldrich W326306
EGTA Sigma Aldrich E4378
Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
Glass crystallizing dish (150 x 75 mm) VWR 89090-662
Glycerol Macron 5094-16
HEPES Sigma Aldrich H4034
Hoechst - bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma Aldrich B2261
HCG - Human Chorionic Gonadotropin  Prospec hor-250-c
L15 Media Sigma Aldrich L4386
leupeptin Sigma Aldrich L2884
Lysolecithin Sigma Aldrich L1381
mAb414 Abcam ab24609
MgCl2 EMD MX0045-2
MgSO4 Sigma Aldrich M9397
Maltose Sigma Aldrich M5885
NP40 BDH 56009
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin + Streptomycin Sigma Aldrich Pp0781
pepstatin Sigma Aldrich P5318
PIPES Sigma Aldrich P6757
Plastic paraffin film (parafilm) Sigma Aldrich P7793
KCl Sigma Aldrich P9541
KH2PO4 Mallinckrodt 70100
KOH Baker 5 3140
PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin Prospec hor-272-a
NaCl Sigma Aldrich S3014
NaHCO3 Fisher BP328
Na2HPO4 EMD SX0720-1
NaOH EMD SX0590
Pestle Thomas Scientific 3411D56
Round bottom glass tubes, 15 ml Corex 8441
Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) ThermoFisher A10037
sucrose Calbiochem 8550
thermal cycler Bio-Rad T100
Ultracentrifuge Beckman L8-80M
Ultracentrifuge rotor Beckman SW 50.1
Vectashield (anti-fade mounting medium) Vector H-1000

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