Ottimale Lentivirus di produzione e colture cellulari condizioni necessarie al successo le cellule trasdurre primario dell'uomo epiteliali bronchiali

Biology

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Baumlin-Schmid, N., Salathe, M., Fregien, N. L. Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (113), e54176, doi:10.3791/54176 (2016).

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Abstract

In coltura in vitro di cellule primarie umane epiteliali bronchiali (HBE) utilizzando condizioni di interfaccia aria-liquido fornisce un modello utile per studiare i processi di differenziazione cellulare delle vie aeree e la funzione. Negli ultimi anni, l'uso di vettori lentivirali per la consegna transgene diventata pratica comune. Mentre ci sono segnalazioni di trasduzione di cellule epiteliali delle vie aeree completamente differenziate con alcuni lentivirus pseudo-digitato non-HIV, l'efficienza complessiva di trasduzione è di solito inferiore al 15%. Il protocollo qui presentato fornisce un metodo affidabile ed efficiente per produrre lentivirus e di trasdurre cellule epiteliali bronchiali umane primarie. Usando cellule epiteliali bronchiali indifferenziate, trasduzione in terreni di crescita epiteliale bronchiale, mentre le cellule attaccano, con una molteplicità di infezione di fattore 4 fornisce efficienze vicino al 100%. Questo protocollo descrive, passo dopo passo, la preparazione e la concentrazione di vettori lentivirali alto titolo e esimoprocesso di trasduzione e. Si discute gli esperimenti che hanno determinato le condizioni di coltura ottimali per raggiungere trasduzione altamente efficienti di cellule epiteliali bronchiali umane primarie.

Introduction

Lo sviluppo di replica-difettose, lentivirus pseudotyped (LV) ha fornito ai ricercatori un metodo sicuro ed efficace per fornire transgeni in vitro 1. Grazie alla loro espressione a lungo termine, questi LV potrebbe essere utilizzato anche per l'erogazione di agenti terapeutici in vivo 2,3. La produzione di LV richiede co-trasfezione di rene embrionali umane (HEK) cellule con diversi plasmidi: vettore di trasferimento, imballaggi gag / pol, imballaggi di giri, e la busta vescicolare glicoproteina virus della stomatite (VSV-G) plasmidi. Sistemi di imballaggio di terza generazione sono considerati più sicuri rispetto ai sistemi di seconda generazione perché il gene rev è codificato su un plasmide confezione separata, riducendo così la possibilità di ricombinazione per produrre un lentivirus competente replica. Anche se i sistemi di confezionamento di seconda generazione producono cinque unità di trasduzione totali superiori piega, la scissione del genoma virale originale per creareil sistema di terza generazione ha diminuito il livello di trasduzione solo minimamente 3,4.

Mentre le linee cellulari possono essere trasdotte più semplice ed efficiente, i ricercatori hanno spostato la loro attenzione per le cellule primarie, perché questi sono più rappresentativi di tessuti in vivo 5,6. Tuttavia, le cellule principali sono refrattari alla trasduzione. Mentre sono stati segnalati trasduzione di cellule delle vie aeree epiteliale completamente differenziate, l'efficienza complessiva non sia superiore al 15% 7.

Qui descritto è un protocollo che permette la produzione di LV alto titolo. Un approccio step-by-step è delineato per raggiungere quasi il 100% di efficienza di trasduzione in cellule HBE primarie. Più specificamente, il protocollo descrive le condizioni di coltura ottimali strumentali per riuscire 3. In breve, le cellule 293T HEK sono trasfettate utilizzando il lentivirale pCDH vettore di espressione con il EF-1 promotore di espressione di guida di una maggiore verde fluorescenteproteine ​​(eGFP) o mCherry, una proteina fluorescente rossa, e un sistema di confezionamento di terza generazione. LV rilasciate in media sono raccolti 24-72 ore più tardi. Le particelle virali sono concentrati con polietilene glicole (PEG), un metodo conveniente e facile della concentrazione virale, prima stima titolo utilizzando un kit di p24 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Successivamente, le cellule HBE primarie indifferenziate sono trasdotti in mezzi proliferazione (terreno di crescita epiteliale bronchiale o BEGM) 8, mentre si collega (dopo essere tripsinizzati), ad una molteplicità di infezione (MOI) fattore 4, aggiungendo hexadimethrine bromuro e incubando per 16 ore ( durante la notte). Le cellule sono poi lasciati differenziare. Poiché il transgene è espresso virale a lungo termine (utilizzando il promotore appropriato, vedere la discussione), espressione verrà mantenuta per tutto differenziazione in un epitelio delle vie aeree pseudostratificato o può essere indotta (utilizzando un promotore inducibile) dopo la differenziazione.

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Protocol

1. Fase 1: cultura di HEK 293T

  1. Preparare cellule HEK supporti (denominato come HEK media) aggiungendo 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS) e 1% (v / v) di penicillina / streptomicina ad alto glucosio Dulbecco Modified mezzo di Eagle (DMEM).
  2. Cappotto uno 10 centimetri piatto di coltura di tessuti con collagene I. Mix 30 ml di collagene I in 2 ml di acqua distillata. Stendere l'impasto sul piatto e incubare per 2 ore a 37 ° C e 5% di CO 2.
  3. Rimuovere la miscela e lasciare asciugare piatto in una cappa a flusso laminare per 15 min.
  4. Cellule HEK piastra nel piatto rivestito ad una densità di celle 1 x 10 6 a 10 ml mezzi HEK e incubare a 37 ° C e 5% CO 2.
  5. Quando le cellule HEK sono 50-60% confluenti (Figura 1a, 2-3 giorni dopo la placcatura), passare alla fase 2. Valutazione visiva di confluenza è sufficiente. Non è necessaria alcuna quantificazione.
    Nota: cellule HEK sono coltivate in mezzi HEK (vedi sopra). Quando raggiungono confluenza, they può essere suddiviso (ad esempio 1/5) o congelati verso il basso per un uso successivo.

2. Fase 2: Produzione e la concentrazione di lentivirus (LV) in cellule HEK

Nota: I protocolli devono essere eseguiti in linea con le normative istituzionali e governative in + (Enhanced BSL-2) le condizioni negli Stati Uniti BSL-2.

  1. Trasfezione utilizzando una procedura di precipitazione di calcio (Lipofectamine e altri agenti di trasfezione non fosse efficiente come la procedura di precipitazione di calcio). Si consiglia l'uso di un kit trasfezione commerciale per garantire la riproducibilità, anche se la procedura è modificato come segue. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente. Questo è il giorno 0.
  2. Per ogni 10 centimetri piatto di cellule HEK293, mescolare 4,5 mg di busta DNA PMD2-VSVG, 7,5 mg il confezionamento di DNA pMDLg / pRRE, 3,75 mg di DNA pRSV-rev, 10 mg di DNA di vettori lentivirali di espressione, di 86 ml di una soluzione 2 M di calcio e acqua sterile in un tubo da centrifuga da 15 ml per un volume finale di 700 microlitri(Questi ultimi due soluzioni vengono forniti nel kit trasfezione commerciale).
  3. Goccia a goccia, aggiungere 700 ml di soluzione fisiologica 2x HEPES-buffered (HBS, forniti nel kit trasfezione), mentre vortex (nella cappa a flusso laminare) e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti (eseguire il passaggio 4 durante l'attesa).
  4. Durante il tempo di incubazione presto, deposito 5 microlitri della miscela su un vetrino. Controllare la goccia sotto un microscopio con un obiettivo 10X, concentrandosi lentamente su e giù. Un bel precipitato deve essere visibile, a conferma del processo di precipitazione di fosfato di calcio (Figura 1b).
  5. Fermare la precipitazione dopo 30 minuti con l'aggiunta di 10 ml di HEK cellule media e pipetta su e giù per mescolare.
  6. Prendete il piatto di cellule HEK dal passaggio 2,1-2,5, e rimuovere il supporto (giorno 0). Aggiungere la soluzione precipitato dal punto 2.5 attentamente e lentamente lungo il bordo del piatto.
  7. Il giorno successivo (giorno 1), rimuovere ed eliminare il supporto contenente il precipitato e sostituirlo wesimo 10 ml di terreno HEK. Controllare per fini precipitato sotto il microscopio: dovrebbe essere visibile nel piatto in spazi vuoti tra le cellule (Figure 1C e d).
  8. Il giorno 2, raccogliere media con una siringa, filtro attraverso un filtro a siringa da 0,45 micron in una provetta da centrifuga da 15 ml contenente 3,8 ml di un glicole polietilene 40% soluzione (PEG). Inverti 5x per mescolare e conservare a 4 ° C per almeno 24 ore (per il PEG precipitare in modo da formare, ma non più di 5 giorni) fino a quando tutte le collezioni di virus sono completi.
  9. Ripetere il passaggio 2.8 nei giorni 3 e 4. Il giorno 4 non sostituirli con media HEK ma decontaminare con il 10% di candeggina e scartare il piatto.
  10. Centrifugare tutte le provette per la raccolta (in genere tutte le collezioni insieme il giorno 5) a 1.650 xg per 20 minuti a 4 ° C a pellet il virus. Rimuovere e scartare il surnatante, e far girare di nuovo a 1.650 xg per 5 minuti a 4 ° C per raccogliere e rimuovere ogni residuo di PEG surnatante.
  11. Resuspend il pellet di ogni tubo in 200 ml di bronchiale mezzo di crescita epiteliale (BEGM) senza amfotericina B 8. riunirli e aliquota a 200 ml. virus Conservare a -80 ° C. Aliquota altri 10 ml di eseguire il test Gag di HIV-1 (p24) l'antigene ELISA.
  12. Utilizzando un kit commerciale ELISA, eseguire un test dell'antigene p24 secondo il protocollo del produttore. Il test fornisce una stima della p24 virale in pg / ml.

3. Fase 3: cellule di coltura HBE primaria

  1. Cellule Piatto HBE in 10 ml BEGM supporti (con 100 microlitri amfotericina B se il passaggio 0 cellule sono utilizzati per eliminare eventuali contaminazioni fungine) ad una densità di celle 1 x 10 6 in collagene I spalmato 10 centimetri piatto di coltura tissutale. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2.
  2. Il giorno successivo, rimuovere il supporto e sostituire con 10 ml BEGM (con 100 ml amfotericina B per il passaggio 0 cellule) per un totale di 4 giorni. Ritorno a incubatore.
  3. Dopo 4 dAYS, utilizzare solo BEGM senza amfotericina B. Cambio media ogni due giorni.
  4. Quando le cellule sono 80-90% confluenti (figura 2a; ~ 7 giorni dopo la placcatura), procedere con la trasduzione (prestare attenzione a 3,5 per la preparazione prima trasduzione). Ancora una volta, valutazione visiva di confluenza è sufficiente. Non è necessaria alcuna quantificazione.
  5. Prima di trasduzione, cappotto gli inserti di supporto permeabili con una soluzione di collagene IV diluita 1/10 con acqua distillata sterile. Aggiungere 200 microlitri di ogni inserto e lasciare asciugare per una notte nella cappa a flusso laminare.

4. Fase 4: trasduzione delle cellule HBE

  1. Rimuovere supporti, aggiungere 3 ml di 0,1% tripsina in 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico in tampone fosfato isotonico (EDTA / PBS) e incubare 5 min a 37 ° C e 5% CO 2. Controllare al microscopio (obiettivo 10X) per vedere se tutte le celle sono staccati. In caso contrario, tornare alla incubatore per un ulteriore 5 min.
  2. Quando tutte le cellule sono staccati, aggiungere 3ml di inibitore della tripsina di soia (SBTI 1 mg / ml), mescolare e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 ml. Agglomerare le cellule facendo girare a 460 xg per 5 min a temperatura ambiente.
  3. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 3 ml di BEGM e procedere con il conteggio.
  4. Risospendere le cellule HBE (ora di passaggio 1 o P1) in un rapporto di 2 x 10 5 cellule per un inserto di supporto permeabile 12 millimetri in 400 ml di BEGM (vedi tabella 2). Estrapolare questi numeri in base alla quantità di inserti di supporto permeabili che verranno trasdotte.
</ Tr>
Superficie Superficie conta delle cellule media Volume (media)
10 centimetri piatto 52,7 cm 2 1 x 10 6 BEGM 10 ml
Filtro 12 millimetri 1.13 cm 2 2 x 10 5 BEGM 400 ml
Filtro 24 millimetri 4.52 cm 2 8 x 10 5 BEGM 800 ml

Tabella 2: media estrapolazione per il conteggio delle cellule.

  1. Utilizzando una molteplicità di infezione (MOI) fattore 4, aggiungere il volume appropriato di virus alla sospensione cellulare.
  2. Aggiungere bromuro hexadimethrine a 2 mg / ml concentrazione finale.
  3. Dispensare 400 microlitri della miscela (BEGM, HBE cellule, virus e hexadimethrine bromuro) per inserto supporto permeabile nel vano apicale, e aggiungere 1 ml di BEGM solo al vano basolaterale. Incubare per una notte a 37 ° C e 5% di CO 2. cellule Sempre piastra HBE senza virus come il controllo e la selezione di test puromicina, se applicabile.
  4. Il giorno successivo, remmezzi apicale e basolaterale ove, lavare con PBS, e sostituire entrambi i comparti con l'interfaccia aria-liquido (ALI) supporto 8.
  5. Quando le cellule sono confluenti, rimuovere il liquido apicale (noto come stabilire una interfaccia aria-liquido). Continuare cambiando il mezzo (ALI) nel comparto inferiore a giorni fino a raggiungere la piena maturità; di solito da 3 a 4 settimane dopo.
    Nota: Se il vettore lentivirale contiene un gene di selezione, come puromicina, le cellule possono essere selezionate aggiungendo puromicina secondo una curva concentrazione selezione. Per le cellule HBE, una concentrazione di 1 mg / ml è stato determinato per essere ideale per la selezione consistente di cellule trasdotte. Tuttavia, questa concentrazione potrebbe differire per le altre cellule o condizioni e deve essere determinata uccidendo curve. L'aggiunta di puromicina può iniziare già a partire un giorno dopo i media è stato sostituito dai media ALI o successivi (2-3 giorni) per consentire la piena espressione del gene di selezione. Assicurarsi di aggiungere puromicina a un inserto che hcome non è stata trasdotte. Puromicina può essere aggiunto finché le cellule sono completamente differenziate.

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Representative Results

La figura 1 illustra diversi passaggi chiave della valutazione cellule e soluzioni durante il processo di trasfezione. Figura 1A mostra la confluenza ottimale delle cellule HEK293T prima trasfezione per produzione di virus. È importante che le cellule sono distribuiti uniformemente in tutto il piatto. Figura 1b rivela il precipitato in una goccia della miscela di trasfezione usando ottica in campo chiaro e un obiettivo 10X. Quanto più i precipitati sembrano granelli di sabbia piuttosto che agglomerati, più efficiente la trasfezione sarà. In questo quadro, il precipitato è un po 'grossolana. Il precipitato è un indicatore affidabile se la trasfezione produrrà un alto titolo del virus. Se uno qualsiasi degli eccipienti è mancante o di scarsa qualità (DNA vettore per esempio), agglomerati si formano, che è un segno minaccioso. Se questo è il caso, è più saggio interrompere e riavviare la procedura, assicurandosi chetutti gli ingredienti sono nel mix, e / o il controllo della qualità del DNA vettoriale e DNA confezionamento. Figura 1c mostra lo stesso piatto come A, dopo incubazione overnight. Il precipitato è (e dovrebbe essere) visibile tra cellule. Abbiamo notato che le cellule non si moltiplicano molto durante la 24 ore dopo la trasfezione.

La figura 2 mostra come le cellule HBE aspetto prima e 3 giorni dopo la trasduzione. Figura 2a descrive cellule confluenti HBE primaria circa il 80% prima di tripsinizzazione e trasduzione. Un piatto 10 cm ai 80% di confluenza produce circa 4 x 10 6 cellule. Figura 2b mostra quasi il 100% trasduzione di cellule P1 HBE indifferenziate utilizzando un MOI di 4 sull'inserto supporto permeabile. Quando le cellule vengono piastrate su HBE questi inserti di supporto permeabili, le cellule sono relativamente piatta. In questa immagine, l'altezza delle celle è di pochi micron, che spiega perché la0,4 micron pori sono visibili anche se le cellule.

La figura 3 mostra esperimenti di ottimizzazione che conducono al protocollo presentato. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicato su pozzi rivestiti collagene (24-pozzetti), con 2 x 10 5 cellule HBE primarie per pozzetto. La maggior parte degli esperimenti hanno usato un MOI di 0.4 con un 2 mg / ml concentrazione finale di hexadimethrine bromidein BEGM media. cellule fluorescenti sono state contate 3 giorni dopo la trasduzione. Anche se l'ottimizzazione iniziale del protocollo è stata eseguita su plastica, i risultati sono stati confermati su inserti di supporto permeabili. Inoltre, i tentativi di trasdurre cellule P1 HBE completamente differenziate non riuscire (dati non mostrati), confermando relazioni precedenti. Come si vede in figura 3a, una percentuale più elevata di cellule HBE sono trasdotto in BEGM mezzi rispetto al ALI. Se le cellule sono placcati il ​​giorno prima trasduzione in mezzi BEGM, l'efficienzaè significativamente diminuita rispetto al trasduzione mentre le cellule alleghiamo (Figura 3b). Quando le cellule P1 HBE sono placcati il ​​giorno prima trasduzione in ALI mezzi (anziché BEGM), l'efficienza di trasduzione diminuisce ulteriormente (dati non mostrati). La differenza tra questi 2 media è la concentrazione di calcio. BEGM supporto contiene una bassa concentrazione di calcio (0,1 mM) rispetto al ALI supporto (1 mM). Forme di calcio e mantiene giunzioni strette e, quindi, potrebbe rendere difficile per le particelle del virus di attraversare 9 e accedere ai loro recettori a livello della membrana basolaterale. Infatti, alcune infezioni sono riusciti a bassi livelli interrompendo giunzioni strette con acido tetraacetico etilenglicole (EGTA), per esempio 10. Come detto in precedenza, completamente differenziate le cellule P1 HBE sono refrattari e possono essere trasdotte solo con basse efficienze 5-7, che potrebbe essere a causa di giunzioni strette in alta calcio contenente i media. Un'altra spiegazionebassa efficienza di trasduzione nelle cellule completamente differenziate è un meccanismo di trasporto mucociliare attivo dove muco potrebbe agire come barriera. Oppure, come riportato da Bals et al., La fase di differenziazione in cui le cellule sono HBE, è un fattore determinante della efficienza di trasduzione 10. Il fatto che più cellule vengono trasdotte in BEGM che in ALI multimediale supporta questa affermazione (Figura 3a).

Come si vede nella figura 3b, un incremento di efficienza di trasduzione quasi il 50% è stata osservata quando le cellule sono state trasdotte mentre allegando rispetto alle cellule placcato giorno precedente. Nel loro studio, Ricks et al. Ha mostrato un aumento del 20% quando la trasduzione è stata eseguita dopo tripsinizzazione 11. Insieme, questi risultati suggeriscono che i media e lo stato di maturazione delle cellule è la chiave per il successo di trasduzione.

Il pannello in figura3c, dimostra hexadimethrine bromideplaying ruolo atrivial in efficienza di trasduzione. Tuttavia, il suo uso è suggerito in questo protocollo dal momento che non ha alcun impatto negativo, ma potrebbe potenzialmente essere utile. Bromuro Hexadimethrine è un polimero cationico utilizzato in virologia per migliorare l'efficienza di trasduzione 12. Altri hanno pubblicato l'uso di protamina, un altro polimero cationico, ma è stata trovata alcuna differenza significativa per quanto riguarda l'efficienza di trasduzione rispetto al hexadimethrine bromuro 13. Bromuro Hexadimethrine non influisce la crescita né la differenziazione 14-16.

Infine, diverse MOI sono stati esaminati nella figura 3d: la più alta efficienza di trasduzione si è verificato con una MOI di 4. Non vi era alcuna differenza significativa tra MOI 0,4 e 4, invece, MOI 4 trasdotto 100% delle cellule HBE mentre MOI 0,4 trasdotte solo il 75%. Il MOI definisce quanti virus particelle will hanno il potenziale di infettare una cellula. Ci sono diversi metodi per determinare il MOI. Uno di questi è di definire il numero di unità di trasduzione (TU). Utilizzando un ELISA, la quantità di antigene p24 può essere determinato in pg / ml. p24 virale in picogrammi può essere convertito in TU, che sono necessari per calcolare il MOI. Il MOI è calcolato dividendo il numero di TU per il numero di cellule. Ci sono 10-100 unità di trasduzione (TU) per picogrammo p24. Tutti i riferimenti nel testo per quanto riguarda MOI si basano su calcoli con 100 TU per picogrammo p24. (Http://tronolab.epfl.ch/webdav/site/tronolab/shared/protocols/TUvsp24.html).

Figura 1
Figura 1:. Trasfezione di cellule 293T HEK (a) cellule HEK 293T cresciuto al 50-60% di confluenza come visto sotto un obiettivo 10X. (B) precipitato visibile in 5 ml goccia 5 minuti dopo la miscelazione tutto reageNTS al microscopio (obiettivo 10X). (C) Precipitare nel piatto accanto alle celle, dopo trasfezione overnight (obiettivo 10X). (D) ingrandimento del centro di (c). Bianco freccia che punta a precipitare. Barra di scala = 100 micron; è lo stesso per a, b, c. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: trasduzione di cellule NHBE (a) cellule HBE coltivate in un piatto rivestito di collagene I, 80-90% di confluenza (circa 4 x 10 6 cellule) in BEGM mezzi per 5 giorni (obiettivo 10X).. Barra di scala = 100 micron. (B) eGFP trasdotto cellule HBE su inserti permeabili di supporto (12 mm), 3 giorni dopo la trasduzione (confocale, 20X). In questo stato, cel HBE ls sono piatte e pori della membrana sono visibili. Scala bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Ottimizzazione del protocollo di trasduzione (a) impatto dei media sulla efficienza di trasduzione.. (B) Confronto di trasduzione nelle cellule HBE placcato il giorno prima e la trasduzione delle cellule mentre si collega. (C) Influenza della hexadimethrine bromuro di sull'efficienza trasduzione. (D) valutazione del miglioramento delle efficienze di trasduzione che utilizzano differenti MOI. L'analisi è stata effettuata utilizzando il test t di Student o di Kruskal-Wallis e Dunn test di confronto multiplo. Le barre di errore rappresentano SE e tutti * rappresentano p <0.05.ww.jove.com/files/ftp_upload/54176/54176fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il protocollo qui delineato assicura quasi il 100% di efficienza di trasduzione. Tuttavia, ci sono passaggi durante il processo che sono importanti per raggiungere questo obiettivo. Per esempio, durante il processo di trasfezione, la presenza di precipitati nel mix trasduzione (drop) o nel piatto il giorno dopo trasduzione (figure 1b e d) sono entrambi rilevanti per una buona trasfezione. L'assenza di un precipitato o la presenza di agglomerati può essere dovuto ad una omissione di uno dei reagenti di trasfezione, un problema di pH, o un preparato plasmide cattiva. Se il precipitato è mancante, c'è un'alta probabilità che nessuno sarà visibile il giorno successivo. Inoltre, aggiungendo la miscela di trasfezione o supporti HEK troppo veloce può causare le cellule HEK per staccare, ostacolando trasfezione e la resa. Un'altra indicazione di un buon rendimento al giorno 6 prima della fase di centrifugazione: un precipitato bianco deve essere visibile nella parte inferiore del tubo. Un cattivo trasfezione con quasinessun virus non creerà questa precipitato bianco. Durante il processo di trasduzione, è fondamentale utilizzare le cellule HBE primarie che sono stati de-differenziati e che sono in una delle cellule staminali come Stato al fine di ottenere efficienze elevate di trasduzione. L'uso di un vettore contenente una proteina fluorescente come eGFP o mCherry che è facilmente visualizzato può essere un ottimo strumento.

Le modifiche potrebbero essere apportate per adattare questo protocollo per diverse cellule primarie. Un approccio potrebbe essere quello di ridurre la concentrazione di calcio nella media. Come si vede in figura 3a, utilizzando BEGM media che contiene una minore concentrazione di calcio prodotto un significativo maggiore efficienza di trasduzione nelle cellule HBE primarie. Un altro approccio potrebbe essere quello di aumentare il MOI. Come mostrato nella figura 3d, maggiore è la MOI, migliore è l'efficienza di trasduzione. Tuttavia, utilizzando un più alto MOI potrebbe diventare tossico per alcune cellule.

Tuttavia, ci sono alcuni Limita zioni al presente protocollo. Questa tecnica è stata sviluppata utilizzando passaggio 1 cellule HBE. Polmoni respinti per il trapianto sono stati ottenuti con adeguato consenso conforme ricerche per gli standard stabiliti dalla dichiarazione di Helsinki. Ottenere cellule HBE primarie da fonti commerciali può essere costoso. Queste cellule sono solitamente disponibili solo in un passaggio superiore. Questo protocollo non è stato testato su passaggi superiori a 2. Un altro fattore limitante è il test dell'antigene p24 ELISA. Diverse compagnie offrono il kit, ma a costi elevati. Inoltre, la concentrazione virale in test, è solo un valore approssimativo poiché il test rileva p24 lentivirus e p24 libero rilasciato durante transitori trasfezione 17. Pertanto, questa valutazione di MOI è solo una stima. Infine, utilizzando l'espressione diversi costrutti (maggiori o minori dimensioni) non può dare gli stessi risultati. Ad esempio, differenti efficienze sono state registrate usando mCherry e eGFP (dati non mostrati).

ent "> Ci sono vantaggi di questo protocollo rispetto ad altri metodi. Uno di loro è il processo di trasfezione. Infatti, il protocollo proposto può produrre tali titoli ad alta virus che non avrà bisogno di essere concentrato i media raccolti contenenti virus e potrebbe essere utilizzato direttamente di trasdurre cellule. polietilene glicole (PEG), utilizzato in questo protocollo per concentrare il virus, è stato conosciuto per essere tossico per le cellule di mammifero 18. Inoltre, se sono stati utilizzati più alto MOI, questo aumenterebbe il rischio di tossicità anche di più. Tuttavia, se la fase di concentrazione PEG diventa obsoleto, ricercatori che non sono riusciti a trasdurre causa di effetti di tossicità potrebbe riconsiderare l'uso dei lentivirus. Un altro vantaggio di questo protocollo è la mancanza di differenze di efficienza di trasduzione in plastica o inserti di supporto permeabili. il vantaggio di essere grado di trasdurre su plastica è che meno cellule e particelle virali sono necessari. di conseguenza, le cellule possono essere ampliati dopo trasduzione e trasferitisu inserti di supporto permeabili quando confluenti (dati non riportati).

La scelta di vettori dipende da diversi aspetti, come la selezione di cellule trasdotte con puromicina o l'espressione di proteine ​​marker come la proteina fluorescente verde (GFP). Ci sono molteplici vettori commerciali disponibili che sono adatti (pRRLsinPPT.CMV.MCS.Wpre, pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro, pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro, pGEM-T Easy) 15,19-21. Selezione dei promotori rappresenta una sfida, dal momento che la CMV promoter comunemente usato è messo a tacere in vie aeree differenziate cellule epiteliali 15. Per l'espressione specifica delle cellule ciliate, si raccomanda l'uso del promotore volpe-J1. In alternativa, il promotore EF-1 può essere utilizzato per l'espressione in tutte le cellule delle vie aeree 20,21. Se sono richieste iperespressione della proteina, la dimensione dell'inserto determina, in parte, l'efficienza di trasduzione. Tuttavia, le grandi dimensioni possono essere ospitati, come visto da trasduzione di successo del full-length ciclasi solubile ciclasi 22 .Il laboratorio ha pubblicato diversi sovraespressione di successo costruisce 15,16,20-22. Per espressione shRNA (di solito sotto il U6 o H1 promotore), più costrutti dovranno essere esplorate. Questo può essere noioso con prove effettuate alla fine del differenziamento (PCR e western blotting), ma il processo non può essere abbreviato in quanto le cellule non differenziate possono non essere una buona rappresentazione di successo per cellule in differenziazione. Anche in questo caso, il laboratorio ha pubblicato più di successo shRNA costruisce 14,20,21,23.

Usando questo protocollo, più ricercatori potrebbero essere abilitati per migliorare significativamente precedenti trasduzione poveri. Alcuni potrebbero trovare utile per aumentare le efficienze facendo alcuni aggiustamenti. Alcuni potrebbero utilizzare questo strumento per scoprire nuovi processi biologici o per essere in grado di dimostrare i concetti, sia utilizzando atterramento o iperespressione strategie.

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Acknowledgments

Ringraziamo l'Alleanza Organo Agenzia Recupero Vita dell'Università di Miami per la fornitura di polmoni. Ringraziamo anche il Dr. Lisa Künzi per la preparazione del DNA usato per gli esperimenti mostrati nella Figura 2B e 3-D, il Dr. Ben Gerovac e Lisa Novak per il virus mCherry utilizzato per gli esperimenti nelle figure 3A a C. Ringraziamo anche Gabriel Gaidosh dalla struttura di imaging, Dipartimento di Oftalmologia presso l'Università di Miami.

Questo studio è stato sponsorizzato da finanziamenti del NIH, la Fondazione CF e l'assistente di volo Medical Research Institute di Dr. Matthias Salathe.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK293T/17 cells ATCC CRL-11268
Fetal bovine serum (FBS)  Sigma 12306C use at 10%
DMEM Thermo Scientific 11995-040
Penicillin/Streptomycin (100x) Thermo Scientific 15140-122 use at 1x
Collagen I BD Biosciences 354231 dilute 1:75 in distilled water
Calphos Clontech 631312 Transfection kit containing 2 M Calcium solution, 2x HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O
Polythylene glycol 8000 VWR scientific 101108-210 stock of 40%
Amphotericin B Sigma A9528 use at 1x
Trypsin Sigma T4799
Soybean trypsin inhibitor Sigma T9128
Transwell 12 mm Corning 3460
Collagen IV Sigma C7521 dilute 1:10 in distilled water
Hexadimethrine bromide Sigma H9268 stock of 2 mg/ml
Puromycin (10.000x) Thermo Scientific A11138-03 use at 1x
Alliance HIV-1 p24 ELISA PerkinElmer NEK050001KT
F12 Thermo Scientific 11765-054
pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro System Biosciences CD532A-2 lentiviral expression vector
pMD2-VSVG Addgene 12259 packaging DNA
pMDLg/pRRE Addgene 12251 packaging DNA
pRSV-rev Addgene 12253 packaging DNA

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References

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Comments

3 Comments

  1. Using the methodology described, were you able to get these Primary HBE's to fully differentiate after the lentiviral transduction?

    Reply
    Posted by: Eugene G.
    February 15, 2017 - 3:04 PM
  2. Hi Eugene. Yes, primary HBE cells differentiate just fine after the transduction. However, it depends what shRNA is used. If the gene silenced is important for the differentiation process, this might be an issue.
    Let me know if there is anything I can help you with. Here is my email address nschmid@med.miami.edu.

    Reply
    Posted by: Nathalie B.
    February 16, 2017 - 8:13 AM
  3. Yes, they differentiate very well. See refs 15 and 22 for examples.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 15, 2017 - 4:32 PM

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